Testes Sorológicos

Disciplina: Imunologia Clínica

Centro Universitário São Camilo – ES
Docente: Edilene Marin
E-mail: edilenemarin@saocamilo-es.br
Testes Sorológicos

São usados para detecção e

quantificação de
anticorpos e/ou antígenos
IMUNOENSAIOS

Podem utilizar reagentes

marcados e não marcados

Disponibilidade de métodos simples,

rápidos e sensíveis aplicáveis as
Baseiam-se detecção de
análises na rotina laboratorial
imunocomplexos
 Testes Sorológicos

Os testes imunológicos possibilitam diagnosticar infecções por;

Agentes patogênicos (vírus, bactérias, fungos, protozoários, entre outros)

Doenças autoimunes
Neoplasias
Alergias, etc.

É possível identificar também a presença de outros elementos, que venham a ser

reconhecidos como antígenos, como é o caso de hormônios, medicamentos, ácidos
nucleicos e outras moléculas.
 Testes Sorológicos

A realização de diagnósticos imunológicos é baseada nos princípios relacionados

ao desenvolvimento das reações do sistema imune, especialmente a interação
antígeno e anticorpo.

De acordo com o tipo de exame realizado, a análise pode ser;

Qualitativa (quando é capaz de verificar se determinado antígeno/anticorpo

está presente na amostra ou não) - Ex: Anti-HCV, Anti-HBSAG, etc
Quantitativa (quando possibilita averiguar a quantidade desse
antígeno/anticorpo na amostra) - Ex: Imunoglobulinas
Semi-quantitativa (resultado expresso como a máxima diluição da amostra
do paciente que apresente reatividade) – Ex: VDRL, FAN
 Testes Sorológicos

Além da especificidade antígeno/anticorpo, há outros fatores que contribuem para

a eficiência dos imunodiagnósticos. A seguir, conheça os principais deles.

Quanto maior a capacidade de o antígeno desencadear

Antigenicidade respostas imunológicas, maior a intensidade do
envolvimento dos componentes do sistema imune.

A interação entre antígenos e anticorpos multivalentes

(aqueles que apresentam vários sítios de ligação) tem mais
Avidez estabilidade do que entre anticorpos ou antígenos
monovalentes (um só sítio de ligação), já que é considerada
a força total resultante da ligação de todos os sítios
Testes Sorológicos

Relação entre Esse fator interfere na sensibilidade do exame porque a

antígeno formação de complexos antígeno-anticorpo depende da
e anticorpo concentração de cada um deles

O antígeno pode estar na forma solúvel ou particulada

Se o antígeno estiver na forma solúvel, sua detecção é feita
Estrutura do
com base na formação de complexos antígeno-anticorpo
antígeno
insolúveis
Se o antígeno estiver na forma particulada, pode ser
detectado por aglutinação após se ligar com o anticorpo.
A afinidade entre antígeno e anticorpo é a soma das forças
Afinidade das ligações quími- cas que os unem em um sítio de ligação,
tornando a interação entre eles mais estável e sua detecção
em exames mais fácil.
 Testes Sorológicos

Os testes imunodiagnósticos podem ser divididos em: Não marcados ou marcados.

Quadro 1: Ensaios imunológicos: Não marcados e marcados

Fonte: SILVA, 2023, p.75.

Testes Imunológicos
Não-Marcado
 Reações de Precipitação

Uma reação de precipitação, ou imunoprecipitação, é caracterizada pela formação

de precipitados, isto é, de complexos imunes formados pela ligação entre
antígenos e anticorpos.
Figura 1: Complexo antígeno-anticorpo

A detecção dos precipitados formados é o Anticorpo

objetivo desse imunodiagnóstico.
Antígeno

Na reação de precipitação, os antígenos e os

anticorpos devem ser solúveis e, para que
ocorra a formação do precipitado.

Fonte: Adaptado google, 2023.

 Reações de Precipitação

Um fator de grande importância nessa reação é a concentração tanto do antígeno

como do anticorpo utilizados: ambos devem estar presentes em uma
concentração que favoreça a ligação antígeno/anticorpo para formar o
precipitado.

Quando as quantidades de antígeno e anticorpo são equivalentes (zona de

equivalência) ha a formação máxima de precipitado, decrescendo a medida em
que um dos dois reagentes esta em excesso: pró-zona (zona de excesso de
anticorpo) e pós-zona (zona de excesso de antígeno). Em virtude da
reversibilidade da reação, o excesso de um dos reagentes pode induzir a
dissociação do precipitado formado, causando erros de interpretação dos
resultados.
 Reações de Precipitação

Figura 2: Efeito pró-zona

Pró-zona ou Zona de excesso de anticorpo: nesse
momento, há anticorpos em excesso na solução,
e a quantidade de antígenos adicionada é
pequena.
Na prática, isso se deve ao uso de um antissoro
que não esteja suficientemente diluído, ou seja,
apresenta título elevado e diluição baixa. Por isso,
não é possível formar complexos com todos os
anticorpos presentes na solução e não ocorre
precipitação. Fonte: SILVA, 2023, p.73.
Reações de Precipitação

Figura 3: Zona de equivalência

Zona de equivalência: é o momento em

que as quantidades de anticorpo e
antígeno estão proporcionalmente
adequadas, de forma que a ligação
entre eles é máxima, possibilitando a
precipitação dos complexos imunes.

Fonte: SILVA, 2023, p.74.

 Reações de Precipitação

Figura 4: Zona de equivalência

Pós-zona ou zona de excesso de antígeno:

conforme o antígeno é adicionado à
solução, sua quantidade supera a de
anticorpos. Esse excesso interfere na
estabilidade dos imunocomplexos,
solubilizando-os e desfazendo-os. Com isso,
a precipitação passa a diminuir.

Fonte: SILVA, 2023, p.74.

Figura 5: Curva de formação de imunocomplexo em função da quantidade de antígeno adicionado.

Fonte: Adaptado google, 2023.

 Reações de Precipitação

IMUNODIFUSÃO

A técnica de precipitação de complexos antígeno/anticorpo pode ser realizada

também em meio semissólido ou gel. Nesse meio, a precipitação está
relacionada com a difusão, nesta técnica é utilizado gel.

O gel permite a difusão das moléculas de antígenos e de anticorpos através de

seus poros até que elas se encontrem formando precipitados visíveis.

Com base nesse principio, existem ainda algumas variações da técnica de

imunodifusão, que são a imunodifusão radial simples, a imunodifusão radial
dupla, imunoeletroforese e imunofixação.
Reações de Precipitação

A imunodifusão pode ser usada para identificar antígenos

- vírus,
- bactérias e outros patôgenos
- presença de anticorpos no soro.

Além disso, sua realização é relativamente simples, não requer estrutura

complexa de laboratório e seu custo é reduzido. No entanto, é uma técnica
mais demorada e sua sensibilidade não é muito elevada, mas é considerada
aceitável.
Reações de Precipitação

IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES

Método quantitativo. Sua característica básica é o fato de um reagente

imobilizado em um meio (no caso o gel) e presente em concentração conhecida
ser capaz de proporcionar a difusão de moléculas do outro reagente.

Nesta técnica o anticorpo e uniformemente distribuído no gel e o antígeno

(amostra teste) e aplicado em um orifício. A amostra teste difunde radialmente
no gel, formando um halo de precipitação circular em torno do orifício da
amostra.
 Reações de Precipitação

Vamos conhecer os passos para preparo dessa reação;

1. Primeiramente, é necessário preparar o suporte, que é um meio semissólido, que

pode ser obtido com gel de ágar ou agarose.
2. Diluir adequadamente um dos reagentes (antígeno ou anticorpo) e acrescentá-lo
ao gel ainda não solidificado, à temperatura de aproximadamente 45 °C.
3. Em seguida, cobrir uma lâmina ou placa de Petri com uma camada desse gel
preparado com 2 a 4 mm de espessura.
4. Depois de o gel se solidificar, deve ser feita uma cavidade com cerca de 5 mm de
diâmetro na qual se aplica uma quantidade precisa do reagente a ser testado –
antígeno (no caso de o anticorpo ser adicionado ao gel) ou anticorpo (se ao gel for
adicionado antígeno).
Reações de Precipitação

Para que ocorra a difusão, o material deve ser incubado por

aproximadamente 48 horas. Assim, o reagente colocado na cavidade se
difunde radialmente pelo gel e, quando as concentrações do antígeno e do
anticorpo atingem a zona de equivalência, formam complexos imunes que se
precipitam na forma de halo ou circulo em torno da cavidade.

A análise do resultado dessa reação é feita ao se observar o halo de

precipitação que é formado. O diâmetro do halo é diretamente proporcional
à concentração do reagente presente na cavidade, o antígeno, por exemplo.
Isso ocorre porque a concentração do reagente (o anticorpo) imobilizado no
gel é uniforme por todo meio.
Figura 6: Ilustração da imunodifusão radial simples.

Fonte: Adaptado google, 2023.

Figura 7: Imunodifusão radial simples.

Fonte: Adaptado google, 2023.

 Reações de Precipitação

IMUNODIFUSÃO RADIAL DUPLA

É um método semi-quantitativo baseado na premissa que quando ambos os

reagentes (um antígeno desconhecido e moléculas de um anticorpo especifico)
são colocados a difundir em um meio suporte, o ponto onde os reagentes se
encontram e formam pode ser visualizado como uma linha ou banda de
precipitação.
Essa reação é semelhante à de imunodifusão radial simples, mas na
imunodifusão radial dupla nenhum reagente é imobilizado e, tanto os antígenos
quanto os anticorpos se difundem no meio, um em direção ao outro. Além disso,
em vez de halos são formados arcos ou linhas de precipitação ao redor da
cavidade central.
Figura 9: Ilustração da imunodifusão radial dupla.

Fonte: Adaptado google, 2023.

 Reações de Precipitação

O suporte dessa reação é preparado com base no sistema radial de distribuição

dos reagentes (antígeno e anticorpo). Depois que o gel se solidifica, são feitas
cavidades dispostas radialmente, isto é, deve ser feita uma cavidade central e as
demais cavidades ao seu redor. Cada cavidade deve ter em torno de 5 mm de
diâmetro e, entre elas, deve haver um espaçamento de aproximada- mente 10
mm, mas essa distância depende da concentra- ção de antígeno e de anticorpo
preparada.

Se o foco do estudo for a identificação dos anti- corpos, estes devem ser
colocados nas cavidades exter- nas, enquanto o antígeno deve ser colocado na
cavidade central. Mas, se se deseja identificar os antígenos, estes devem ser
colocados nas cavidades externas e o soro deve ser colocado na cavidade central.
Figura 10: Ilustração da imunodifusão radial dupla.

Fonte: SILVA, 2023, p.80.

Reações de Precipitação
Figura 11: Imunodifusão radial dupla.

Essa reação também requer um

meio semissólido de gel (ágar ou
agarose) e, para isso, é necessário
que uma lâmina ou placa de Petri
receba uma camada de gel isento
de antígenos ou anticorpos e tenha
espessura de 2 a 4 mm.

Fonte: Adaptado google, 2023.

Reações de Aglutinação

Aglutinação

Assim como nas reações de precipitação, a reação de aglutinação é baseada no

princípio imunológico de formação de complexos imunes: a ligação entre os
antígenos e seus anticorpos específicos.

PARTICULA + ANTÍGENO + ANTICORPO

A aglutinação pode acontecer de maneiras diferentes, sendo as principais:
aglutinação direta, indireta e inibição da aglutinação.
 Reações de Aglutinação
Precipitação

Aglutinação direta

Na aglutinação direta, o anticorpo se liga diretamente ao antígeno particulado, que

pode ser bactéria, protozoário, hemácias, entre outros. O antígeno faz parte
naturalmente da partícula.

A reação de aglutinação direta é uma técnica bastante sensível, de simples

realização e que não exige laboratórios com técnicos ou instrumentos específicos.
Por isso, é ainda bastante usada na tipagem sanguínea (HEMAGLUTINAÇÃO)
Exemplos de reações de aglutinação direta: tipagem de grupos sanguíneos
(antígenos específicos), reação de Paul- Bunnel-Davidson (antígenos
heterófilos), teste de Widal para salmoneloses, teste de aglutinação para
toxoplasmose e tripanossomíase.
 Reações de Aglutinação
Precipitação

A hemaglutinação é a aglutinação direta de hemácias que acontece devido à

existência de antígenos naturais na superfície dessas células. Em contato com um
soro antiantígeno específico, os anticorpos se ligam aos antígenos por meio de
ligações cruzadas, de modo que uma aglutinação intensa ocorre e pode ser
visualizada a olho nu.

Anticorpo Hemácia + Antígeno

Imunocomplexo = aglutinação
 Reações de Aglutinação
Precipitação

Aglutinação Indireta

A reação de aglutinação indireta ou passiva é fundamentada pela fixação de um

anticorpo ou um antígeno que se pretende estudar a uma célula ou partícula inerte,
ou seja, que não causa interferência na ligação antígeno-anticorpo.

As partículas são utilizadas como suporte para os antígenos/anticorpo, são utilizadas

para sensibilização.

Principais partículas utilizadas:

Látex (poliestireno) – AEO/ASLO, FR, PCR
Cristais de Colesterol – VDRL
Hemaglutinação Indireta – Doença de Chagas
Reações de Aglutinação
Precipitação
Figura 12: Ilustração Aglutinação Indireta.

Fonte: Adaptado google, 2023.

 Reações de Inibição
Aglutinação
Precipitação
da Aglutinação

Inibição da Aglutinação

A reação de inibição da aglutinação se baseia no princípio de impedir a

aglutinação.

Essa reação acontece em um cenário de competição entre antígenos pelos sítios

de ligação de um anticorpo. Esses antígenos são diferentes, pois um deles é
solúvel e está presente na amostra biológica, sendo o que se deseja detectar,
enquanto o outro antígeno está fixo ou adsorvido a outras moléculas (ex:
hemácias, látex, etc), revestindo-as.
 Reações de Inibição
Aglutinação
Precipitação
da Aglutinação

Teste de Gravidez – Beta HCG

Alguns testes de gravidez são fundamentados na detecção do HCG, que é o

hormônio Gonadotrofina Coriônica Humana. Neste teste as partículas de látex são
revestidas de HCG e são adicionadas a uma amostra de urina que possa conter o
HCG naturalmente. São também adicionados a essa amostra os anticorpos
específicos para o HCG.

Em caso de gravidez, os antígenos HCG naturais presentes competem com os

antígenos adsorvidos às partículas de látex para se ligar aos anticorpos. Como a
quantidade de HCG natural é grande, os anticorpos se ligam a eles (e não com os
antígenos do látex) e a aglutinação não ocorre e o resultado é positivo para a
gravidez.
Figura 13: Ilustração, detecção de HCG na urina.

Fonte: Adaptado google, 2023.

ReaçõesLíticos
Ensaios de Precipitação
Aglutinação

Esses ensaios se baseiam na hemólise, utilizando a hemolisina (anticorpo anti-

hemácias) capaz de causar hemólise.

Sistema complemento

Função de complementar a ação dos anticorpos

É o principal mediador humoral do processo inflamatório junto aos anticorpos.

 ReaçõesLíticos
Ensaios de Precipitação
Aglutinação

O sistema complemento é constituído por proteínas séricas e de membrana, que

interagem de maneira altamente regulada para gerar como produto proteínas
biologicamente ativas. Essas proteínas participam em diferentes funções efetoras
envolvidas com a eliminação de antígenos, tais como: lise osmótica de células
estranhas, quimiotaxia; liberação de mediadores inflamatórios; fagocitose e
proliferação celular.

Ensaios líticos
RFC – Reação de Fixação do Complemento
Teste de Neutralização de hemólise
 ReaçõesLíticos
Ensaios de Precipitação
Aglutinação

RFC – Reação de Fixação do Complemento

A reação se manifesta em três momentos:

1º O antígeno se combina com o anticorpo.
2º No segundo, se os imunocomplexos estiverem presentes, os componentes do
sistema complemento ligam-se, sendo assim consumidos.
3º Finalmente, adiciona-se o sistema revelador que consiste de hemácias de
carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo antieritrocitário). Após um
período de incubação, observa-se se ocorreu ou não lise das hemácias
sensibilizadas.

Reação Negativa = Ocorre hemólise

Reação Positiva = Não ocorre hemólise
Figura 14: Representação da reação de fixação do complemento para pesquisa de ac do Trypanossoma Cruzi.

Fonte: MOLINARO; CAPUTO; AMENDOEIRA, 2009, p.86.

“Continue, mesmo quando todos esperam que você desista...”
Madre Tereza de Calcutá

Obrigada!