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Índice

I. Título de anticorpos: Estudo dirigido.............................................................................................................3

II. Parâmetros de imunoensaios: Estudo dirigido.............................................................................................4

III. Hemaglutinação indireta para Chagas: Estudo dirigido e protocolo.............................................................5

IV. Diagnóstico imunológico da sífilis: Estudo dirigido....................................................................................... 7

V. Imunocromatografia (teste rápido) ............................................................................................................10

VI. Imunofluorescência e ELISA: Estudo dirigido..............................................................................................12

VII. Determinação quantitativa de IgG para T. gongii por ELISA: Protocolo e questões...................................15

VIII. Sorologia IgM, IgG e avidez de IgG para toxoplasmose: Artigo e fluxograma............................................16

IX. Avaliação da imunocompetência: Estudo dirigido .....................................................................................20

X. Avaliação da imunocompetência: Estudo dirigido baseado em casos........................................................24

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I. TÍTULO DE ANTICORPOS: Estudo dirigido

A concentração de anticorpos específicos para um determinado antígeno é geralmente estimada pela

determinação de quantas diluições seriais podem ser feitas até que não se observe mais reação positiva (semi-
quantitativo). Sendo assim, o título do soro corresponde a maior diluição do soro do paciente onde o anticorpo ainda
é detectável.

A determinação da concentração de anticorpos (título) para um antígeno específico envolve os dois passos
seguintes:
1-Preparação da diluição seriada do soro (figura abaixo). Para entender melhor como são feitas as diluições
seriadas, vide página 131 do capítulo 8 do livro Immunology e Serology in Laboratory Medicine; Turgeon, M,L 2014
(disponibilizada no AVA - Canvas).
2-Adição de igual volume de suspensão de antígeno para cada diluição.

Questão de aplicação:

Se uma amostra de soro diluída em 1:64 reagir positivamente com a suspensão de antígeno usado no teste, e a
próxima maior diluição for 1: 128 for negativa, qual será o título lido?

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II. PARÂMETROS DE IMUNOENSAIOS: Estudo dirigido

SENSIBILIDADE

Proporção de todos os pacientes com a doença que apresentam resultados positivos quando o teste em particular é
utilizado. A sensibilidade pode ser calculada como o número de verdadeiros resultados positivos dividido pelo número
de todos os pacientes com a doença [verdadeiro-positivos (VP) e falso-negativos (FN)]. Isso significaria a taxa de VP ou
a verossimilhança do resultado positivo em pessoa doente. O índice de sensibilidade pode ser expresso em
porcentagem (%), bastando multiplicar o valor obtido por 100.
Testes com alta sensibilidade (>99%) podem, ao se obter resultado negativo, excluir a presença da condição ou
doença.
Sensibilidade = VP ÷ (FN + VP)

ESPECIFICIDADE

Proporção de todos os indivíduos sem a doença que apresentam resultados negativos quando o teste em particular é
utilizado. A especificidade pode ser calculada como o número de verdadeiros resultados negativos dividido pelo
número de todos os indivíduos sem a doença [verdadeiro-negativos (VN) e falso-positivos (FP)]. Isso significaria a taxa
de VN ou a verossimilhança do resultado não reagente em pessoa não doente. O índice de especificidade pode ser
expresso em porcentagem (%), bastando multiplicar o valor obtido por 100.
Os testes com alta especificidade (>99%) e que são negativos em indivíduos sadios ou que apresentam sintomas
similares mas não apresentam a condição/doença, são muito úteis para confirmar o diagnóstico.
Especificidade = VN ÷ (FP + VN)

Tabela 1: Comparação de resultados de um teste diagnóstico com a presença ou não de doença.

EFICIÊNCIA, ACURÁCIA OU PRECISÃO DIAGNÓSTICA

Referem-se à relação entre o número de resultados corretos (VP e VN) no teste e o total de indivíduos testados ( n ),
isto é, a proporção de diagnósticos corretos. É a relação entre os VP somados aos VN e o total de indivíduos testados.
Eficiência, acurácia ou precisão diagnóstica = (VP + VN) ÷ n

Questão de aplicação:

O que significa dizer que um teste tem 99% de sensibilidade e 90% de especificidade?

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III. HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA OU MICROAGLUTINAÇÃO: Estudo dirigido e protocolo

Técnica realizada em meio líquido, em pequenos volumes, sendo comum o ensaio em placas de
microcavidades plásticas de fundo em “U” ou “V”. Na microaglutinação são utilizadas hemácias (hemaglutinação) de
aves, que, após tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo, expõem cargas residuais e, na presença de
glutaraldeído (agente polimerizador), adsorvem proteínas e glicoproteínas com elevada afinidade, o que lhes confere
estabilidade. Dá-se preferência à utilização de hemácias de aves por serem nucleadas, o que reduz o tempo do teste,
pois sedimentam mais rapidamente. No teste positivo observa-se a formação de um manto ou tapete, composto pela
malha de imunocomplexos antígeno-anticorpo e que impede o depósito das hemácias, pela força da gravidade, no
fundo da microcavidade. O teste pode ser semiquantitativo pela titulação de anticorpos utilizando diluições seriadas
da amostra. A leitura é observada geralmente após períodos de 30 a 90 min de incubação, tempo necessário para que
as hemácias não aglutinadas sedimentem no fundo da placa.
Esse teste é aplicado na detecção de anticorpos contra uma grande variedade de microrganismos, como Treponema
pallidum, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii.

Figura: Hemaglutinação indireta. O antígeno adsorvido na hemácia permite a detecção semiquantitativa de anticorpos
específicos ( A ) com a formação de um tapete ( B ), mostrando ( C ) a interação específica do anticorpo com o antígeno
adsorvido na hemácia. O teste negativo apresenta-se como um botão sedimentado no fundo da placa ( D ). O teste
controle ( E ) mostra a interação inespecífica de anticorpos da amostra com antígenos da célula. Vaz, Adelaide José.
Ciências Farmacêuticas - Imunoensaios-Fundamentos e Aplicações.

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Protocolo: Determinação semiquantitativa de anticorpos anti- Trypanossoma cruzi no soro humano por
hemaglutinação indireta (microaglutinação)

1- Partir de uma diluição do soro de 1:32

2- Pipetar 20 µl da solução diluente a partir da segunda cavidade da placa, até a diluição que se pretende estudar.
3- Transferir 20 µl do soro 1:32 para a primeira (A1) e segunda (A2) cavidades.
4- Homogeneizar bem o soro com o diluente na segunda cavidade (diluição 1:64) e transferir para a terceira
cavidade (A3) (diluição 1:128) e assim sucessivamente, desprezando 20 µl no final.
5- Pipetar 10 µl da suspensão homogênea de hemácias em todas as cavidades
6- Agitar a placa por vibração mecânica ou batendo, com os dedos, na borda da placa por 3 a 4 minutos.
7- Deixar em repouso em temperatura ambiente, em local livre de vibrações.

Interpretação:
Títulos menores do que 1:32 – Não reagente
Títulos iguais ou maiores do que 1:32 - Reagente

Questão de aplicação do ensaio de hemaglutinação indireta e dos conceitos de sensibilidade e especificidade:

Segundo o Ministério da Saúde, o diagnóstico sorológico de Chagas na fase crônica deve ser realizado através de:
• Dois testes sorológicos de diferentes princípios metodológicos
• ou contendo preparações antigênicas diferentes.

a
Cenários sem uma rede laboratorial adequada, investigação diagnóstica em pacientes com difícil acesso aos serviços de saúde e em gestantes
com suspeita de doença de Chagas durante o pré-natal ou em trabalho de parto. b O terceiro teste realizado pode ser: ELISA, IFI
(imunoflurescência), HAI (hemaglutinação indireta), WB (western blotting).

1. Qual a estratégia do método utilizado nesta prática (HAI) para detecção de anticorpo anti-Trypanossoma
cruzi? Justifique.
2. Por que dois testes sorológicos de diferentes princípios metodológicos ou obtidos de preparações antigênicas
diferentes devem ser utilizados para esse diagnóstico laboratorial da doença de Chagas na fase crônica?

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3. Interprete o resultado obtido nesta aula prática relacionando com a tabela abaixo: Acurácia dos testes
diagnósticos para Chagas.

IV. DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DA SÍFILIS: Estudo dirigido

A via de transmissão da sífilis é o contato direto com pele, mucosa ou tecidos íntegros ou lesados, que permita
a penetração da bactéria Treponema pallidum. Assim, representa uma doença sexualmente transmissível (DST), e
como o doente não tratado pode ser transmissor por longos períodos de tempo, a sífilis é muito prevalente em todo
o mundo. A transmissão por via sanguínea (transfusões e hemoderivados, objetos perfurocortantes contaminados) é
mais elevada se o portador transmissor estiver na fase de disseminação sistêmica com elevada bacteremia. A infecção
perinatal por contato com sangue infectado durante o parto e com leite na amamentação também é possível. As
lesões típicas demonstradas no local da inoculação ou nos tecidos afetados são chamadas de cancro duro. Esse cancro
mostra-se como uma ulceração indolor, não pruriginosa, de bordas endurecidas, acompanhada de linfadenopatia
regional. A ausência de dor, coceira ou incômodo torna as mulheres as principais portadoras assintomáticas e
transmissoras. Em homens, a lesão aparente sem diagnóstico pode levar à automedicação inadequada, e a cicatrização
que ocorre espontaneamente pode ser interpretada equivocadamente como cura. Nesse caso, prosseguem a infecção
disseminada e a transmissão. O diagnóstico é fundamental para interferir na cadeia epidemiológica de transmissão e
para estabelecimento precoce da terapêutica, que está disponível e é reconhecidamente eficaz nas fases iniciais da
infecção.

IMUNOPATOGENIA
O T. pallidum desencadeia a resposta imunológia, que, embora não consiga eliminar o patógeno, acaba
participando do processo celular local com lesões do tipo hipersensibilidade tardia granulomatosa. Enquanto isso, o
treponema continua invadindo novos tecidos, escapando assim da eliminação e reiniciando novas lesões.
Do ponto de vista clínico, a sífilis evolui cronicamente em fases distintas, com períodos de sintomas subagudos
separados por intervalos assintomáticos.
Sífilis primária
Após o período de incubação de 10 a 90 dias (média de 21 dias), pode ser observada a lesão primária no local
da inoculação. Essa ulceração é geralmente única, indolor, com bordas salientes, firmes e endurecidas, e o paciente
mostra linfadenopatia satélite regional. A cicatrização completa da lesão primária é espontânea, e ocorre em 4 a 6
semanas. Nesse meio tempo, o T. pallidum já atingiu a corrente circulatória e está em franca disseminação. Os
anticorpos são detectados concomitantemente ou em até 10 dias após o início da lesão, dependendo do período de

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incubação. O isolamento e a identificação do treponema em exsudato coletado da lesão primária, por microscopia de
campo escuro, têm cerca de 95% de sensibilidade, dependendo da qualidade e da precocidade da coleta após o início
da lesão.
Sífilis secundária
Assim que o T. pallidum invade a corrente sanguínea e linfática, ocorre uma disseminação para todos os
tecidos e órgãos. As lesões vão se repetir como aconteceu na fase primária, mas agora de maneira generalizada.
Algumas semanas (2 a 8) e ocasionalmente até 6 meses após a lesão primária, pode-se evidenciar o processo de lesões
em pele, mucosas, fígado, baço, rim, coração, ossos e articulações. Usualmente essas lesões resolvem-se dentro de 2
a 6 semanas, mesmo sem terapia e podem reaparecer na fase latente a intervalos não definidos.
Anticorpos IgM e IgG estão presentes em elevadas concentrações, e na vigência de tratamento vão se
reduzindo de maneira lenta e gradativa. Sem tratamento, essa queda também ocorre, no entanto é muito mais lenta.
Sífilis latente
Nos primeiros anos após a fase secundária acontece a fase latente precoce, caracterizada pela presença de
anticorpos em elevada concentração e pela ausência de sintomas. Na ausência de tratamento, prossegue para a etapa
tardia, de duração muito variável, que termina quando os sintomas da fase terciária aparecem.
Sífilis terciária
Manifestações podem ocorrer entre 3 a 10 anos após infecção primária. Esta fase é pouco infectante, devido
ao menor número de treponemas circulantes. A forma benigna da sífilis terciária é chamada de gomosa. Ocorre
precocemente em pacientes não tratados, que apresentam lesões granulomatosas em olhos, ossos, vísceras (coração,
fígado, cérebro) e pele.
Sífilis congênita
Gestantes com sífilis não tratada, em especial nas fases secundária e latente precoce, apresentam
probabilidade de 70 a 100% de transmissão placentária. A sífilis congênita pode manifestar-se de maneira precoce, ao
nascimento, semelhante à fase secundária. Outros sintomas podem aparecer mais tardiamente, após alguns anos, e
incluem: neurossífilis, surdez, comprometimento vascular, fronte olímpica, nariz em sela, tíbia em sabre e dentes de
Hutchinson – estes últimos como consequência de malformações ósseas e cartilaginosas. Esses sintomas mais tardios
podem retardar o diagnóstico da sífilis congênita até a fase de adolescência. Cerca de 40% dos casos de sífilis congênita
evoluem para morte fetal (aborto espontâneo, natimortalidade ou morte neonatal).

DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO
É possível dividir os imunoensaios da sífilis, de acordo com o antígeno empregado, em testes não
treponêmicos e treponêmicos.

Testes não treponêmicos

O VDRL, empregado há mais de 60 anos, foi padronizado pelo Venereal Diseases Research Laboratory. O
antígeno utilizado no teste é a cardiolipina adsorvida a cristais de colesterol e estabilizada com solução aquosa proteica
de lecitina. Na presença de anticorpos anticardiolipínicos (reaginas), os cristais de colesterol se agregam, formando
microflocos visivéis ao microscópio óptico. O principío deste método se chama floculação e é uma variante da
aglutinação. Duas variantes desse teste incluem micropartículas de carvão: o rapid plasm reagin (RPR) e o Carbotest.
O VDRL e suas variantes podem ser altamente sensíveis, mas como os componentes fosfolipídicos são comuns
a outras células, ocorrem falso-positivos. As reações cruzadas mais frequentes são com autoanticorpos em doenças
do tecido conectivo, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, colagenoses e outras doenças autoimunes, com
cerca de 20 a 40% desses pacientes mostrando VDRL positivo em títulos baixos, até 1:8. Outras reações cruzadas são
observadas em infecções agudas bacterianas e virais, pneumonia por micoplasma, malária e hanseníase. O VDRL
também apresenta inespecificidade aumentada em amostras de soro de idosos e gestantes, sem que se compreendam
as razões. Mesmo na população adulta jovem saudável, cerca de 1% mostra títulos baixos no VDRL, transitória ou
cronicamente.

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As amostras com resultado positivo no VDRL, provenientes de indivíduos sem dados clínicos direcionados para
a sífilis, devem ser analisadas por testes treponêmicos.

Testes treponêmicos (Não se preocupar AGORA com os princípios destes métodos, apenas comparar com não
treponêmicos com o objetivo de estudar para o diagnóstico da doença)

Utilizam antígenos do T. pallidum de difícil obtenção a custo elevado. São testes de elevada sensibilidade e
especificidade. O algoritmo ideal para triagem diagnóstica da sífilis utilizando testes imunológicos em indivíduos sem
suspeita clínica da infecção é: realizar testes cardiolipínicos e confirmar os casos positivos com testes treponêmicos.
Como visto, os testes cardiolipínicos são baratos, mas de execução manual, um inconveniente em grandes rotinas de
triagem, como em hemocentros para seleção de doadores de sangue. Nesse caso, os testes treponêmicos
automatizados como o imunoenzimático ELISA podem ser a solução. Os testes treponêmicos disponíveis são a
hemaglutinação ou microaglutinação indireta, a imunofluorescência (FTA-Abs) e o teste ELISA. Nos dois últimos, o
emprego de conjugados anti-IgM específicos permitem também verificar a precocidade da infecção. Anticorpos IgM
aparecem nas fases primária e secundária e são um bom marcador para confirmar infecção congênita. Como são testes
de elevada sensibilidade, a sua positividade pode ser de longa duração, mesmo após o tratamento. Inclusive nos casos
tratados precocemente nas fases primária e secundária, a positividade dos testes treponêmicos pode persistir vários
anos, ao contrário do VDRL, que chega negativar ou pelo menos evidenciar claramente a queda da reatividade pela
diminuição dos títulos. Desta forma, a utilidade dos testes não-treponêmicos (VDRL ou RPR) é no monitoramento
terapêutico.

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Questões de aplicação:

1- Explique por que o diagnóstico laboratorial da sífilis depende da fase da infecção.

2- Por que a cardiolipina é o antígeno dos testes não treponêmicos? Qual a sua relação com a T. pallidum?
3- Por que a sensibilidade do teste VDRL/RPR é 100% na fase secundária da sífilis, enquanto das demais fases é
no máximo 90%? (vide tabela acima 16.1)
4- O VDRL é utilizado para o monitoramento da terapêutica, já os testes treponêmicos não podem ser utilizados
para essa finalidade. Explique.

V. Imunoensaios utilizando conjugados: IMUNOCROMATOGRAFIA (TESTE RÁPIDO)

Teste rápido ou remoto é definido como o teste de laboratório clínico realizado próximo ao local de
atendimento do paciente e que fornece resultado imediato. O número de situações em que esses testes podem
ser aplicados aumentou consideravelmente devido ao desenvolvimento de novos diagnósticos rápidos de doenças
infecciosas, favorecendo a intervenção médica e diminuindo a transmissão vertical dessas doenças. Também podem
ser aplicados em bancos de sangue e acidentes de profissionais de saúde.
Embora a implementação tenha ocorrido devido ao aumento da necessidade de resultados clínicos mais
rápidos, não deve ser utilizado de forma única ou como substituto do teste tradicional. Suas limitações devem ser
consideradas em todas as populações de pacientes. Ou seja, são necessários outros exames laboratoriais
para confirmação diagnóstica.

Objetivo:
Detectar se uma proteína, antígeno ou anticorpo está presente em um fluido corporal.
Por exemplo:
• Teste qualitativo para triagem imunológica do beta-HCG.
• Pesquisa de anticorpos contra o vírus HIV, hepatite B e C, Treponema palidum.

Princípios do método:
1. Utiliza-se membranas sintéticas (nitrocelulose ou náilon) como fase sólida na qual estão fixados na forma de
linhas ou pontos:
→ os antígenos ou anticorpos e
→ os correspondentes controles do teste.
2. Utiliza-se reagente marcado ou CONJUGADO: corante coloidal ligado ao antígeno ou anticorpo (depende do
que está se procurando na amostra biológica)
3. A amostra aplicada se une ao conjugado colorido e, após a difusão o das proteínas por cromatografia, a
formação do imunocomplexo é revelada pelo depósito do corante coloidal na linha de captura.

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Local de aplicação da Ac anti-IgG de Membra

Anti-HCG
Anti-hCG
amostra e onde se ovelha na
encontra o conjugado

Interação do
conjugado anti-
hCH/corante com o
hormônio presente
na urina aplicada no
teste.

Conjugado ligado
ao hCG foi retido na
linha da membrana
onde estão fixados
os anti-hCH.

Conjugado retido linha

do controle positivo

Figura: Sequência de eventos em um teste rápido de gravidez positivo. hCG, gonadotrofina coriônica humana

Atividade 1:

Realize o teste rápido beta-HCG para as amostras biológicas 1 e 2, e com auxílio da figura acima e discussão das
questões, interprete os resultados.
a) Alguma das amostras apresenta o hormônio HCG?
b) Se sim, como foi possível visualizar esse antígeno da reação.
c) Qual a diferença entre o anticorpo fixo na membrana e o anticorpo marcado com o corante?
d) Qual o papel do conjugado ou reagente marcado?
e) Qual o papel do controle positivo?
f) Como seria um teste inválido?

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Atividade 2:

Analise o resultado do teste rápido para Sífilis e com auxílio da figura abaixo, interprete o resultado e responda à
questão.

a) Quem é o conjugado neste teste?

VI. Imunoensaios utilizando conjugados: IMUNOFLUORESCÊNCIA E ELISA

O avanço no imunodiagnóstico a partir de 1950 possibilitou identificar antígenos ou anticorpos em testes

altamente sensíveis, empregando moléculas marcadas com compostos químicos detectáveis. As moléculas ligadas
covalentemente aos compostos ligantes são denominadas conjugado, definido como duas substâncias ligadas
covalentemente e que mantêm as suas propriedades funcionais. Essa é uma das principais características requeridas
à obtenção de conjugados, uma vez que moléculas conjugadas que modificam sua função não poderão ser
empregadas em imunoensaios.
A molécula conjugada pode ser um antígeno ou imunoglobulina. Os antígenos podem ser representados por
moléculas derivadas de patógenos, hormônios, marcadores celulares, marcadores tumorais, entre outros. Os
anticorpos podem ser de origem policlonal ou monoclonal.

Técnicas e ensaios utilizando conjugados:

A) IMUNOFLUORESCÊNCIA
Como os anticorpos se ligam de maneira estável e específica ao antígeno correspondente, eles são
inestimáveis como sondas para identificar uma molécula específica em células, tecidos ou fluidos biológicos. As
moléculas de anticorpo podem ser usadas para localizar suas moléculas alvo com precisão em células únicas ou em
seções de tecido por uma variedade de diferentes técnicas de marcação. Quando o próprio anticorpo, ou o anticorpo
anti-imunoglobulina usado para detectá-lo, é marcado com uma substância fluorescente (um fluorocromo ou
fluoróforo) e depois detectado por microscopia, a técnica é conhecida como microscopia de imunofluorescência. Os
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fluorocromos mais usados são a fluoresceína, que emite luz verde; Texas Red e proteína de clorofila peridinina (PerCP),
que emitem luz vermelha; e rodamina e fitoeritrina (PE), que emitem luz laranja / vermelha. Como em todas as
técnicas sorológicas, o anticorpo se liga de maneira estável ao seu antígeno, permitindo que o anticorpo não ligado
seja removido por lavagem.

Questão de aplicação 1:

Observe a figura acima e explique porque quando o fluorocromo é ligado diretamente ao anticorpo primário
específico, o método é chamado de direto; quando o fluorocromo é ligado a um anticorpo secundário, o método é
indireto.

B) ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)

O imunoensaio enzimático (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay ) foi desenvolvido nos anos de 1970
e muito difundido comercialmente a partir de 1985, com o ensaio para anticorpos anti-HIV. É o ensaio mais
comumente empregado nos laboratórios e baseia-se na imobilização de um dos componentes, antígeno ou anticorpo,
em fase sólida*, e na utilização de um conjugado, que também pode ser antígeno ou imunoglobulina, ligado a uma
enzima, com a preservação da atividade enzimática e imunológica. Como o substrato forma um produto colorido, a
alteração de cor é monitorada visualmente que está sendo analisado na amostra. O ELISA apresenta geralmente
elevadas sensibilidade e especificidade, rapidez e custo baixo e objetividade de leitura.

*fase sólida = poliestireno (microcavidade da placa)

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Tipos de ELISA
O ELISA pode ser utilizado para pesquisa de antígenos: competitivo com antígeno marcado; competitivo com
anticorpo marcado; e captura de antígeno ou sanduíche, além de também poder ser empregado para pesquisa de
anticorpos indireto e captura de imunoglobulina classe-específica.

Captura de antígeno ou sanduíche

A pesquisa de antígenos utiliza diversos métodos, sendo o de captura de antígeno ou sanduiche o mais
utilizado para antígenos polivalentes. Método ocorre em duas etapas, no qual o anticorpo fixo na fase sólida captura
especificamente o antígeno da amostra e, após lavagens para retirada dos componentes não específicos, o
imunocomplexo é revelado por um segundo anticorpo específico marcado, formando o sanduíche. A especificidade
desse segundo anticorpo é diferente daquela do fixado à fase sólida, ou seja, contra um epítopo distinto. Uma nova
etapa de lavagem é realizada para a retirada do conjugado não ligado, seguida da adição do substrato cromogênico
para o desenvolvimento de cor proporcional à quantidade de enzima presente na reação, a qual, por sua vez, é
proporcional à quantidade de antigeno presente na amostra. A reação enzimática é interrompida pelo acréscimo de
solução ácida ou alcalina e a leitura é realizada em espectrofotômetro no comprimento de onda adequado para o
cromógeno utilizado.

ELISAsanduíche
ELISA sanduíche ou
oudedecaptura de de antígeno
captura
antígeno

Lavagem Lavagem

Anticorpos específico Adição do soro do Adição do anticorpo Adição do substrato

na fase sólida paciente conjugado com a enzima cromogênico

ELISA indireto
O ELISA indireto pode ser usado quando existe a necessidade de buscar por anticorpos específicos para um
antígeno microbiano (por exemplo, anticorpos reativos a proteínas do vírus da imunodeficiência humana [HIV] ou
vírus da hepatite B) como indicadores de infecção. A amostra é incubada com a fase sólida contendo o antígeno
previamente fixado, permitindo a ligação dos anticorpos séricos presentes na amostra, específicos contra o antígeno.
A especificidade do teste depende da escolha do antígeno. Após a lavagem para a retirada dos componentes não
fixados, é adicionado o conjugado enzimático anti-IgG humana, que se fixa às IgG ligadas ao antígeno da fase sólida,
permitindo revelar e quantificar o anticorpo presente na amostra. Após a adição do substrato cromogênico haverá
desenvolvimento de cor proporcional à quantidade de enzima presente na reação, a qual, por sua vez, é proporcional
à quantidade de anticorpo presente na amostra.

ELISA indireto
ELISA sanduíche ou de captura de

Lavagem Lavagem

Antígenos adsorvidos Adição do soro do Adição do

do anticorpo
anticorpo Adição
Adição Adição do
do substrato
substrato
na fase sólida paciente secundário conjugado
secundário conjugado com
com aa cromogênico
cromogênico
enzima
enzima

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Questão de aplicação 2:

Aponte as diferenças entres os cenários A e B na figura abaixo e consequentemente, indique as modalidades de

ELISA representadas.

A 3
2
1 +

+
1# fase(sólida
2# antígeno
3#anticorpo
4#conjugado

B 3
2
1 +
4

+
1# fase(sólida
2# anticorpo
3#antígeno
4#conjugado

VII. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE ANTICORPOS IgG PARA Toxoplasma gongii POR ELISA: Protocolo e
questões

Reagentes:
Controles positivos (32 Ul/ml e 75 Ul/ml)
Controle negativo
Conjugado (anti-IgG conjugada com peroxidade)
Substrato
Solução de Bloqueio (Acido Sulfúrico 1mol/L)

Procedimento:

1- Pipetar Controles e Amostras nas cavidades previamente determinadas.

2- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos, cobrir as cavidades com selador de placas.
3- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos em uma incubadora a 37ºC ± 2ºC.
4- Retirar o selador de placas das cavidades.
5- Descartar o conteúdo das cavidades.
6- Efetuar um total de cinco (5) ciclos de lavagem com aproximadamente 300 µL de Solução de Lavagem, e ao
final da lavagem, bater a placa por alguns segundos em papel absorvente.
7- Pipetar 100 µL de Conjugado em todas as cavidades.
8- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos.
9- Cobrir as cavidades com o selador de placa.
10- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos em uma incubadora a 37ºC ± 2ºC.
11- Retirar o selador de placa das cavidades.
12- Descartar o conteúdo das cavidades.
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13- Efetuar um total de cinco (5) ciclos de lavagem com aproximadamente 300 µL de Solução de Lavagem, e ao
final da lavagem, bater a placa por alguns segundos em papel absorvente.
Nota: Lavagem/secagem deficiente pode causar resultados inadequados.
14- Pipetar 100 µL de Substrato em todas as cavidades.
15- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos.
16- Cobrir as cavidades com o selador de placa.
17- Incubar por 10 minutos ± 2 minutos em uma incubadora a 37°C ± 2°C.
18- Retirar o selador de placa das cavidades.
19- Pipetar 100 µL de Solução de Parada em todas as cavidades.
20- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos.

Interpretação:
Positivo: Desenvolvimento de cor igual ou mais intensa que o controle positivo 32 Ul/ml
Negativo: Desenvolvimento de cor abaixo que o controle positivo 32 mUl/ml

Questões sobre o médodo:

a- Qual a modalidade de ELISA?
b- Qual é a função das lavagens?
c- Qual é a função da solução de bloqueio?

VIII. SOROLOGIA IgM, IgG E AVIDEZ DE IgG PARA TOXOPLASMOSE: Artigo e fluxograma

Como a determinação da percentagem de avidez de IgG pode auxiliar na interpretação do resultado de uma reação
sorológica para toxoplasmose quando a reação para IgM é positiva

Autor: Dr. Paulo Leser

Testes pré-natais são utilizados para a avaliação preventiva e profilática durante uma gestação. Entre estes
estão incluídos testes sorológicos para determinados vírus, bactérias e parasitas considerados como potencialmente
patogênicos para o feto (1). Para cada agente infeccioso o resultado de um teste sorológico pode ter diferentes
condutas médicas. Assim, sorologias negativas para qualquer um destes agentes significa ausência de contato prévio
e algumas medidas profiláticas e preventivas devem ser adotadas. Sorologias IgG positivas para toxoplasma, rubéola
ou citomegalia indicam exposição prévia ao agente e ausência de qualquer risco para o feto. Já uma reação sorológica
com presença concomitante de IgG e IgM positivas para toxoplasma, que era interpretada até pouco tempo atrás
como infecção aguda com possível risco para o feto, atualmente não tem mais esta interpretação. O mesmo raciocínio
pode ser aplicado para as reações para rubéola e citomegalia.
Até o início dos anos 90, se uma reação sorológica para toxoplasma mostrava presença de IgM, era
interpretada sempre como sendo um quadro de infecção aguda (2). Com a substituição da técnica de
imunofluorescência indireta para IgM, por técnicas imunoenzimáticas, imunofluorimétricas e de quimioluminescência
(que apresentam como características principais a capacidade de detectar diminutas concentrações de anticorpos IgM
específicos, no soro), constatou-se que anticorpos IgM poderiam persistir por muitos meses, e em muitos casos, até
por um ou dois anos após o início da infecção. Os anticorpos IgM detectados por estes métodos passaram a ser
designados como anticorpos IgM residuais.
A partir deste conceito, a presença de IgM não significa obrigatoriamente infecção aguda e a interpretação de
um teste com IgM positivo para toxoplasma tornou-se extremamente complexa para o clínico e principalmente para
o obstetra, limitando sua utilização, pois não se consegue saber se a paciente está na vigência de uma infecção aguda,

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que pode traduzir risco para o feto, ou se a infecção ocorreu há vários meses atrás, antes de engravidar, e o feto não
seria comprometido.
Várias pesquisas têm sido realizadas na tentativa de se tentar caracterizar o período mais provável em que a
infecção ocorreu. Estas procuram relacionar infecção aguda pelo toxoplasma, com anticorpos específicos IgA(3) ou
IgE(4), ou avaliam a avidez da ligação dos anticorpos IgG com os antígenos do toxoplasma (5). Nas reações
imunológicas, a interação de um anticorpo com um antígeno multivalente é feito por meio de ligações iônicas, e o
termo que define esta força de ligação é denominado avidez (6). Em qualquer resposta imunológica primária, os
anticorpos desencadeados por um estímulo antigênico, inicialmente apresentam baixa avidez. À medida que a
resposta imunológica vai se maturando com o tempo, os anticorpos da classe IgG vão apresentando avidez cada vez
maior.
O princípio da determinação da avidez das moléculas de IgG pelos antígenos foi introduzida com sucesso por
Hedman e col. (7) no diagnóstico laboratorial de rubéola aguda e posteriormente no diagnóstico da toxoplasmose
aguda (8), e é definido pela presença de anticorpos IgG com baixa avidez. O objetivo de desenvolver o teste de avidez
na seção de imunologia do Fleury foi de introduzir uma ferramenta auxiliar diagnóstica, verificando se, baseado nos
resultados obtidos, poderia tentar se estabelecer o período mais provável em que a infecção pelo toxoplasma ocorreu
e fornecer este subsídio aos médicos.
Para isto utilizamos soros de 7 pacientes com toxoplasmose aguda, definida pela soroconversão entre duas
amostras e de 16 pacientes com diagnóstico clínico de toxoplasmose aguda, confirmado laboratorialmente pela
presença de anticorpos IgM. A determinação da concentração de IgG e IgM foi feita pela técnica imunoenzimática. Os
níveis de corte definidos pelo fabricante eram de 3 UI/mL para IgG e de índice 0,6 para IgM. De cada paciente, durante
um período de 6 meses, foram colhidas amostras em diferentes períodos, para análise do comportamento da avidez
da IgG ao longo do tempo. Como controle de infecção pregressa, que por definição deve apresentar altas percentagens
de avidez de IgG, analisamos amostras de soros de 50 indivíduos, identificados por possuírem reações sorológicas
positivas para anticorpos IgG e negativas para anticorpos IgM.
A reação de avidez de IgG foi realizada pela técnica imunoenzimática em duas etapas: antes e após a utilização
de uréia 6M, (7) que é um agente desnaturante das ligações antígeno - anticorpo. A relação da densidade ótica obtida
da reação com uréia, dividida pela densidade ótica da reação sem tratamento com uréia, multiplicada por 100,
determina a percentagem de avidez das moléculas de IgG. Nos 50 indivíduos com infecção pregressa as percentagens
de avidez da IgG variaram de 52% a 97%, reforçando o conceito que nas infecções que ocorreram há longo tempo, a
avidez do anticorpo pelo antígeno é bastante elevada.
Nos 7 pacientes que apresentaram soroconversão, e nos 16 pacientes que apresentavam quadro clínico de
toxoplasmose aguda, as amostras de sangue colhidas nos primeiros 60 dias após o início da infecção mostraram
percentagens de avidez sempre inferiores a 30 %. Por outro lado, percentagens de avidez de IgG maiores que 52%,
semelhantes às detectadas nos indivíduos com infecção pregressa, e que traduziam maturação dos anticorpos IgG,
eram mais facilmente detectadas nas amostras colhidas após 60 dias do início da infecção. Numa pesquisa
complementar realizada nos soros de pacientes que apresentavam índices positivos de anticorpos IgM específicos
para toxoplasmose e superiores a 4, foi constatado que as percentagens de avidez eram sempre inferiores a 30%, e
retrospectivamente constatado que provinham de soros de pacientes com quadro clínico de toxoplasmose aguda.
Estes dados permitiram que o setor de imunologia do Fleury montasse um fluxograma para auxiliar a liberação
dos resultados dos testes sorológicos para toxoplasmose, envolvendo os índices de anticorpos IgG, IgM e percentagem
de avidez quando realizado, para auxiliar o obstetra na interpretação do resultado, sugerindo inclusive o período mais
provável da infecção, desde que percentagens inferiores a 30% sugeririam que a infecção teria ocorrido nos últimos
60 dias e que percentagens de avidez maiores que 60% traduziriam infecção há mais de 60 dias. Percentagens de
avidez entre 31 e 59% não permitiriam qualquer tipo de conclusão.
Então, na rotina diária, dependendo da análise dos resultados dos anticorpos IgG e IgM específicos para
toxoplasma em uma única amostra de soro, o teste de avidez poderá ser agregado ou não ao resultado como um
diferencial. Assim sendo, quando numa reação sorológica a pesquisa de IgM é negativa, independente se os índices
de IgG são elevados ou não, o teste de avidez não é realizado, pela simples razão que a doença não é aguda e sim
pregressa, pois não foram detectados anticorpos IgM específicos. Dentro de um raciocínio científico, fica sem sentido
a realização do teste de avidez pela própria propositura da introdução do mesmo como um teste auxiliar. Deixamos
de realizar também o teste de avidez, quando o índice da concentração de IgM é superior a 4 pelas razões acima
expostas.
O teste sempre é realizado quando os índices de IgM são inferiores a 4. O achado de índices de IgM inferiores
a 4, num soro, é o que causa maior preocupação para o obstetra, principalmente quando a amostra é de uma gestante
assintomática para toxoplasmose. Para piorar a interpretação do teste, deve ser lembrado que, em cerca de 80% dos
pacientes, a infecção aguda pelo toxoplasma ocorre sem nenhuma manifestação clínica. Nestes casos, se a
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percentagem de avidez da IgG for maior que 60%, é provável que a infecção tenha ocorrido há mais de 60 dias e o
anticorpo IgM presente passa a ser considerado como um anticorpo residual. Se a amostra de sangue da gestante foi
colhida dentro dos ultimos 60 dias, o obstetra poderá supor que a infecção tenha ocorrido antes da paciente
engravidar e provavelmente nenhum risco existe para o feto. Existem raros relatos na literatura de infecção pelo
toxoplasma 1 a 2 meses antes do início da gestação e ocorrência posterior de infecção fetal. Como este evento é uma
exceção, não deve ser valorizado quando da interpretação do teste de avidez.
Lembramos que a avidez de anticorpos para um dado antígeno é um fenômeno biológico e, por esta razão, variações
individuais da resposta imunológica podem naturalmente ser encontradas. Em indivíduos cuja infecção ocorreu há
mais de 60 dias o achado de uma percentagem de avidez em torno de 30% seria considerado anômala, pois um valor
maior seria o esperado. Em outras palavras, o teste de avidez é somente mais uma ferramenta auxiliar utilizada para
definir o provável e não o exato período de uma infecção, quer seja pelo vírus da rubéola ou citomegalovírus.
Um fato que precisa ficar claro para o clínico geral, para o infectologista ou para o obstetra é que as reações
sorológicas com IgM positivas devem ser interpretadas com a cautela necessária para saber se a sua presença traduz
uma infecção aguda, uma infecção pregressa ou não apresenta nenhum significado, por ser decorrente de uma reação
cruzada, um falso positivo. Existem laboratórios que fornecem o resultado da sorologia para IgM simplesmente como
positivo/reagente, não indicando qual o título ou a densidade ótica ou o índice da reação impossibilitando qualquer
identificação quanto a ser ou não um anticorpo residual. O clínico na tentativa de melhor interpretar o resultado
solicita um teste de avidez de IgG, mas não tendo conhecimento de como é feito o teste de avidez e da correta
interpretação da percentagem de avidez, pode ser induzido a um raciocínio errôneo quanto a IgM ser residual ou não,
e ao provável período que a infecção ocorreu.
A mensagem que fica é que o teste de avidez de IgG é um teste auxiliar para caracterizar se a infecção é aguda
ou pregressa quando a reação sorológica com IgM é positiva num paciente assintomático. Dependendo da
percentagem de avidez da IgG e dos índices de
anticorpos específicos IgG e IgM para toxoplasma, o laboratório pode inferir se a infecção é aguda ou crônica e
consequentemente qual o período mais provável que a infecção ocorreu. Por esta razão o teste de avidez não deve
ser solicitado isoladamente. Ele deve fazer parte do conjunto dos testes sorológicos que o laboratório realiza e o laudo
final deve ser fornecido por aqueles que tenham real conhecimento e domínio da técnica empregada.

Bibliografia
1. Remington, J. S.; McLeod, R. & Desmonts. – Toxoplasmosis In Remington J.S. & Klein, J. O.(eds) - Infectious
Diseases of the Fetus Newborn Infant – 4th ed. W.B. Saunders Company. 1995. pp 140 - 267.
2. Camargo, M. E., Leser, P.G. & Leser, W. S. P. - Definição de perfis sorológicos na toxoplasmose. Importância
diagnóstica e epidemiológica. - Rev. Bras. Patol. Clin. 13 : 113- 127, 1977.
3. Stepick-Biek, P. Thulliez, P., Araujo, F.G. & Remington, J.S. - IgA antibodies for diagnosis of acute congenital
and acquired toxoplasmosis. - J. Infect. Dis. 162 : 270-273, 1990.
4. Pinon, J.M., Toubas, D., Marx, C et al. - Detection of specific immunoglobulin E in patients with toxoplasmosis.
- J. Clin. Microbiol. 28 : 1739-1743, 1990.
5. Camargo, M.E., da Silva, S.M., Leser, P.G. & Granato, C. H. - Avidez de anticorpos específicos como marcadores
de infeção primária recente pelo Toxoplasma gondii. - Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 33 : 213-218, 1991.
6. Eisen, H.N. & Siskind, G.W. - Variations in affinities of antibodies during the immune response. - Biochemistry
3 : 996-1008, 1964.
7. Hedman, K. & Seppälä, I. - Recent rubella virus infection indicated by a low avidity of specific IgG. - J. Clin.
Immunolol. 8 : 214-221, 1988.
8. Hedman, K., Lappalainen, M., Seppälä I. & Mäkelä O. - Recent primary toxoplasma infection indicated by a low
avidity of specific IgG. - J. Infect. Dis. 159 : 736-740, 1989.

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Exercício de aplicação:

A partir dos dados descritos neste estudo o laboratório Fleury montou um fluxograma para auxiliar a liberação dos
resultados dos testes sorológicos para toxoplasmose, incluindo os índices de anticorpos IgG, IgM e porcentagem de
avidez IgG, para auxiliar o obstetra na interpretação do resultado, sugerindo inclusive o período mais provável de
infecção.

Complete o fluxograma do Fleury:

Infecção recente (< 3 meses)

Infecção pregressa (> 3 meses)
Infecção pregressa ( > 1 ano, geralmente)
Infecção em momento indeterminado
Não-imune

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IX. AVALIAÇÃO DA IMUNOCOMPETÊNCIA: Estudo dirigido

1. Introdução

• O que são imunodeficiências primárias (IDP)?

As IDPs são um grupo heterogêneo de distúrbios caracterizados por defeitos no desenvolvimento e / ou função do
sistema imunológico. Esses defeitos são causados por mutações herdadas em qualquer um de um grande número de
genes que estão envolvidos ou controlam as respostas imunológicas. Já foram descritas mais de 400 imunodeficiências
primárias que afetam o desenvolvimento das células do sistema imunológico, sua função ou ambos.

•
Como as IDPs são classificadas ?
As IDPs podem ser classificadas com base no componente do sistema imunológico primariamente
comprometido, mesmo que, devido à integração de elementos ou mecanismos da resposta imunológica, defeitos em
um componente do sistema imunológico podem afetar a função de outros.

As IDP são classificadas de acordo com o componente do sistema

imunológico primariamente comprome8do:

1. Deficiências predominantemente de an3corpos;

2. Deficiências de células T e B;

3. Outras imunodeficiências bem definidas;

4. Doenças de desregulação imunológica;

5. Defeitos congênitos de fagócitos;

6. Defeitos da imunidade inata;

7. Síndromes auto-inflamatórias

8. Deficiências do sistema complemento.

•O que aprendemos com as imunodeficiências?

Ao examinar quais doenças infecciosas acompanham uma determinada imunodeficiência, verifica-se quais
componentes do sistema imune são importantes na resposta a determinados agentes infecciosos.
, assim como sobre a redundância dos mecanismos de defesa. Também revelam como as interações entre os
diferentes tipos de células imunes contribuem para a resposta imune e para o desenvolvimento de linfócitos T e B.
Finalmente, essas doenças hereditárias podem nos levar ao gene mutado, muitas vezes revelando novas informações
sobre a base molecular dos processos imunológicos.

• Quais as manifestações clínicas mais comuns?

As IDP causam aumento da suscetibilidade a infecções, consistente com o papel desempenhado pelo sistema
imunológico na vigilância contra patógenos. Porém, várias IDP também são caracterizadas pelo aumento da frequência
de autoimunidade e neuplasias, refletindo distúrbios da regulação imunológica e da vigilância do tumor.

Infecções são as manifestações clínicas

mais frequentes, geralmente por
patógenos iguais ou similares.

O #po de infecção é um
guia para qual parte do
sistema imunológico é
deficiente.

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• Infecções invasivas ou fatais;

• Infecções recorrentes ou prolongadas, associadas a retardo
do crescimento pondero-estatural;
• Infecções causadas sempre pelos mesmos microorganismos
ou por patógenos de baixa virulência;
• Infecções causadas por cepas provenientes de vacinas
atenuadas;
• Resposta lenta e/ou inadequada à anAbioAcoterapia
habitualmente uAlizada;
• Elevados riscos de complicações e hospitalizações devidos
as infecções.

As manifestações não infecciosas mais frequentemente

associadas às IDP:

• Autoimunidade – papel central de céls T na indução e coordenação

de respostas imunológicas.
P.ex: artrite reumatóide, LES, citopenias autoimunes;

• Neoplasias – vigilância de tumores, desregulação da proliferação e

diferenciação, presença de agentes infecciosos predispondo à
transformação celular.
Mais comuns: Linfoma não Hodgkin ou doença linfoproliferaGva de
células B, carcinomas de pele e gástricos.

2- Avaliação da imunocompetência

Uma vez existindo suspeita de imunodeficiência primária, o diagnóstico diferencial frequentemente exige
investigação de mais de um ramo da resposta imune que é chamada de primeira fase e pode ser realizada em qualquer
serviço de saúde por médicos generalistas.

Investigação inicial (Primeira fase)

Hemograma completo com avaliação da morfologia dos linfócitos, neutrófilos, monócitos e plaquetas no sangue
periférico
Radiografia simples de tórax (em PA e perfil) (visualização do timo), e de cavum (visualização das adenóides)
Níveis séricos de IgA, IgG e IgM
Avaliação da síntese ativa de anticorpos: títulos de iso-hemaglutininas (IgM) e dosagem de anticorpo anti-hepatite
B, CMV, sarampo, tétano (IgG e IgM)
Testes intradérmicos de leitura tardia (PPD)
Testes para HIV
Teste do NBT ( nitrobluetetrazolium )
Quantificação do CH50 e APH50

A segunda e terceira fases da avaliação deve se direcionar de acordo com o ramo afetado da imunidade, em
geral são realizadas em laboratórios especializados, sob a orientação de imunologistas clínicos. O diagnóstico precoce
e correto das imunodeficiências primárias, assim como a orientação quanto ao prognóstico e a orientação genética
familiar possibilitam melhora substancial de morbidade e mortalidade desses distúrbios.

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3. Avaliação da imunocompetência do complemento

Para a avaliação inicial da cascata de complemento utilizam-se ensaios funcionais de triagem (primeira fase)
para a via clássica e para a via alternativa, que quantificam a capacidade de lise de alvos suscetíveis à destruição pelo
complexo de ataque à membrana (MAC) do sistema complemento. Esses ensaios são:
• Ensaio de CH50: avalia funcionalmente os componentes da via clássica e da via final comum (MAC).
Eritrócitos de carneiro pré-sensibilizados com anticorpos anti-hemácias são incubados a 37 °C com diluições do soro
do paciente. A atividade do complemento é determinada pela diluição do soro que consegue lisar 50% das hemácias,
comparadas ao 0% de lise (hemácias e solução salina isotônica) e aos 100% de lise (hemácias e água destilada)
• Ensaio de APH50: avalia funcionalmente os componentes da via alternativa. O soro do paciente deve ser
colhido com um quelante de cálcio como o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) para assegurar a inativação da
via clássica (Ca2+ é cofator de C1s e C1r). Eritrócitos de coelho são expostos a diluições da amostra e o resultado é
expresso pela diluição do soro que causa 50% de lise das hemácias, sempre comparadas com padrões de 0 e 100% de
lise. Esse teste avalia componentes unicamente presentes na via alternativa – fatores B, D e properdina, mas é
importante ressaltar que ambos (CH50 e APH50) avaliam os componentes C3 e C5-C9.
Com base nos resultados de CH50 e APH50, é possível direcionar a segunda fase da investigação, ou seja, a
avaliação dos componentes individuais da cascata por exemplo por ELISA ou nefelometria.

Figura: (A)Eritrócitos de carneiro sensibilizados com IgM (ou IgG) de coelho são incubados com diluições soro do
paciente. O complexo C1 se liga e inicia a formação da C3 convertase, levando à clivagem de C3, montagem do
complexo C5b-9 e subsequente lise dos eritrócitos. (B) Ensaio de CH50. Titulação da quantidade de soro necessária
para lisar 50% de uma quantidade limitada e fixa de células no ensaio CH50. As curvas mostram três indivíduos com
diferentes níveis de função do complemento.

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4. Deficiência do complemento e correlação clínica

Questões de aplicação:
1- Defeitos nos componentes iniciais da via alternativa ou em C3 levam à suscetibilidade a patógenos
extracelulares, particularmente bactérias piogénicas. P.ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae e Meningococcus. Qual a função do complemento frente a infecção por bactérias que possuem
cápsula polissacarídica?
2- Defeito em algum componente do complexo de ataque à membrana (C5-C9) está associado apenas à
suscetibilidade às espécies de Neisseria. Qual a função do complemento frente a infecção por Neisseria,
bactéria encapsulada e de vida intracelular?
3- Defeito em algum componente inicial da via clássica (C1, C2 ou C4) pode estar associado a doenças autoimunes
por imunocomplexos. Como é possível explicar essa afirmativa?

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X. AVALIAÇÃO DA IMUNOCOMPETÊNCIA: Estudo dirigido baseados em casos

Avaliação laboratorial da imunidade humoral:

• Dosagem de imunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgE) e subclasses de IgG – sempre comparado a controles da mesma
faixa etária.
• Dosagem de anticorpos específicos (sarampo, rubéola, polio, tétano, difteria) em resposta à imunização a estes
antígenos – a medida de anticorpos específicos após a imunização é a melhor forma de se avaliar a integridade da
imunidade humoral.
• Isohemaglutininas – teste útil para triagem da função linfocitária em lactentes até mesmo de 2 a 6 meses, que não
sejam do tipo sanguíneo AB. Avalia produção de anticorpos da classe IgM.

Avaliação laboratorial da imunidade celular (exemplos):

• Contagem absoluta de linfócitos no hemograma completo
• FACS (citometria de fluxo) – identificação do fenótipo de cada célula individualmente e consequente contagem das
populações celulares.
• Testes de funcionalidade celular- capacidade de reconhecimento, ativação e proliferação frente a um estímulo.

CASO 1:
O paciente BG foi bem até os 10 meses de idade. Nos anos subsequentes foi diagnosticado com pneumonia
por três vezes e apresentou vários episódios de otite média.
Com 2 anos e 3 meses, os níveis de imunoglobulinas totais foi investigado. Encontrou-se 80 mg dl-1 IgG (normal
600-1500 mg dl-1), 10 mg dl-1 IgM (normal 75-150 mg dl-1) e IgA indetectável.
Através do hemograma, foi verificado que a contagem de células brancas era normal. A análise realizada pelo
FACS encontrou 85% de linfócitos T (anti-CD3); sendo 55%, células T auxiliares (anti-CD4) e 29% células T citotóxicas
(anti-CD8), o que é normal. Porém, nenhuma célula sanguínea do paciente estava ligada com anticorpo contra o
marcador de células B (CD19), o normal seria 12% de células B.

Diagnóstico: Agamaglobulinemia ligada ao X

Essa deficiência está relacionada com a incapacidade de produção de anticorpos o que resulta em infecções
de recorrência quase exclusivamente pelas bactérias extracelulares Haemophilus influenzae, Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus. Essas bactérias extracelulares, que são a maior causa
de infecções recorrentes nesta imunodeficiência, são as chamadas bactérias piogênicas.
O gene mutado BTK, mapeado no braço longo do cromossomo X, codifica uma tirosina quinase citoplasmática
que é encontrada nas células pré-B, células B e neutrófilos. Btk é requerida para a sobrevivência e diferenciação de
células B progenitoras, assim como para a sobrevivência de células B maduras.

Questões para discussão em grupo:

1- O paciente foi bem até os 10 meses de vida. Explique esse fato.
2- Levando em consideração que as infecções recorrentes encontradas nesta imunodeficiência são quase
exclusivamente por H. influenzae, S. pneumoniae, S. pyogenes e S. aureus. Qual outro defeito genético no
sistema imune poderia clinicamente mimetizar a agamaglobulinemia ligada ao X?
3- As crianças com agamaglobulinemia não apresentam tonsilas palatinas, o que caracteriza um importante
achado para o diagnóstico desta doença. Explique esse fato.

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CASO 2:
DF, sexo masculino, 5 anos de idade, apresenta sinusites recorrentes desde 1 ano de idade. Também já
apresentou pneumonia causada pelo fungo Pneumocystis jirovecii quando tinha 3 anos.
Recentemente foi diagnosticado com sinusite por Streptococcus β-hemolítico. Hemograma demonstrava
neutropenia, porém a contagem de linfócitos estava normal e monócitos aumentada.
Durante o período de internação, foram realizados os testes para detecção de anticorpos anti-estreptolisina
O e anticorpos contra antígenos de vacinas, além da dosagem de Igs séricas totais. Não foram detectados anticorpos
anti-estreptolisina O, os níveis de IgG detectados foram extremamente baixos, IgA indetectáveis e IgM elevado. DF
recebeu no primeiro ano de vida as doses da vacina tríplice bacteriana (DPT), não foram detectados anticorpos contra
toxóide tetânico nesta investigação.
Paciente do grupo O, apresenta dosagem de IgM anti-A e anti-B elevada.
Linfócitos do sangue periférico examinados por FACS apresentaram-se dentro da normalidade. Porém, todas
as células B (CD19) tinham IgM e IgD de superfície, ou seja, nenhuma célula B apresentando receptores IgG ou IgA
foram encontradas. As células T ativadas não ligaram CD40 solúvel marcada com um fluorocromo.

Diagnóstico: Síndrome Hiper-IgM ligada ao X

Sabe-se que a molécula CD40 é membro da família do receptor do fator de necrose tumoral, expresso em uma
variedade de células como, células B, macrófagos, células dendríticas. A ativação desta molécula é crucial para
proliferação da células B e troca de classe de imunoglobulina, ocorrendo através da interação de CD40 com seu ligante
expresso em células T ativas.
A síndrome Hiper-IgM ligada ao X é uma imunodeficiência primária caracterizada por níveis normais ou
elevados de IgM no soro, com ausência ou níveis muito baixos de outros isotipos. Este fato é decorrente de deficiência
da molécula CD40L, codificada por um gene localizado no cromossomo X (Xq26), expressa em células T, prejudicando
sua interação com a molécula CD40 de células B.

Questões para discussão em grupo:

1- Essa imunodeficiência é classificada como celular. Explique a relação com a infecção por Pneumocystis jiroveci.
2- Por que essa imunodeficiência atinge a resposta imune humoral?
3- Os anticorpos IgG são mais importantes que os anticorpos IgM na proteção contra bactérias piogênicas. Esta
afirmação está correta? Explique
4- Por que foi realizada a investigação da presença de anticorpos contra toxóide tetânico?
5- Justifique porque o paciente apresentava anticorpos contra os antígenos A e B e não contra estreptolisina?
6- Qual conclusão pode ser obtida a partir da observação de que nenhuma célula B apresentando receptores IgG
ou IgA foi detectada?

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