Mtodos sorolgicos de

Diagnstico e Pesquisa

Reao Ag-Ac in vitro

Testes sorolgicos

Uso de soro ou outros fluidos biolgicos de

paciente p/ diagnstico laboratorial
Demonstrao de anticorpos especficos =
diagnstico presuntivo (indireto)
Demonstrao de agente infeccioso ou
antgeno do agente = diagnstico diret

Vantagens dos testes sorolgicos

Rapidez
Simplicidade
Possibilidade de automao
Armazenamento de material biolgico
Baixo custo operacional
Oferta de kits comerciais padronizados

Aplicaes dos testes sorolgicos

1 Diagnstico presuntivo e diferencial

2 Diferenciao de fases da doena
3 Diagnstico de alergias
4 Diagnstico de doenas autoimunes
5 Diagnstico de imunodeficincias congnitas
6 Seleo de doadores de sangue
7 Seleo de doadores de rgos para enxertos
8 Dosagens hormonais
9 - Prognstico da doena
10 Avaliao da eficcia da teraputica instituda
11 Avaliao da imunidade especfica (vacinao)
12 Pesquisa de antgenos em clulas ou tecidos
13 Pesquisas epidemiolgicas
14 - Pesquisa bsica e aplicada

reas de conhecimento que utilizam

mtodos sorolgicos

Imunologia
Patologia
Alergologia
Microbiologia (bact., vrus, fungos)
Morfologia
Hematologia
Endocrinologia
Oncologia

Foras de ligao envolvidas nas

reaes:

Conjunto de reaes fracas que

estabilizam a ligao entre
molculas de antgenos e de
anticorpos:

Pontes de hidrognio
Ligaes inicas
Foras hidrofbicas
Foras de Van der Waals

Fatores que interferem na ligao entre

Ag e Ac

Especificidade dos anticorpos

Afinidade dos Ac
Avidez dos Ac
Concentrao dos Ac e antgenos
Classe dos anticorpos envolvidos
Pureza dos antgenos utilizados

Afinidade x avidez

Afinidade: Fora de ligao resultante do

total de foras no-covalentes entre um
nico stio de ligao do Ac e um nico
eptopo do antgeno. Depende do grau de
complementariedade entre as duas
molculas.

Ac de baixa afinidade ligam-se de modo

fraco e tendem a se dissociar com
facilidade. Ac de alta afinidade
estabelecem ligaes fortes e mais
duradouras.

Afinidade x avidez

Avidez: Fora resultante de interaes mltiplas

entre uma molcula de anticorpo e os eptopos de
um antgeno complexo. Quanto mais stios de
ligao tiver um anticorpo (ex. Fragmento
Fab<IgG monomrica<dmero<pentmero).

Em geral quanto maior a avidez, melhor seu

efeito biolgico final (ex. reconhecimento de
antegos complexos sobre a superfcie de
patgenos)
A baixa afinidade de um Ac pode ser compensada
por sua elevada avidez.

Fatores que interferem na ligao entre

Ag e Ac

Concentrao dos anticorpos

(equilbrio entre concentrao de Ag
e Ac)
pH do meio de reao
Temperatura de reao
Tempo de reao

Equilbrio de concentrao de Ag e Ac

Fatores que interferem na ligao entre

Ag e Ac

Concentrao dos anticorpos (equilbrio entre

concentrao de Ag e Ac)
pH do meio de reao: pH cido=desfaz reao
Temperatura de reao: em geral o aumento de
temperatura torna a reao mais rpida. Cuidado:
no deixar denaturar os componentes da reao.
Reaes com complemento devem ser baixa
temperatura.
Tempo de reao: Quanto maior o tempo, mais
fortes as ligaes Ag-Ac e maior a probabilidade
de dar reao positiva. Algumas reaes ocorrem
em minutos, outros requerem muitas horas. Em
geral dependem da quantidade de reagentes
usados na reao.

Conceitos bsicos em sorologia

Ttulo
Teste de referncia
Sensibilidade
Especificidade
Falso-positivo, falso-negativo
Reao cruzada
Preciso
Acurcia ou exatido
Reprodutibilidade
Limiar de reatividade (cut off)

Ttulo

Ttulo de uma soro ou soluo de anticorpos

(Igs), refere-se mxima diluio na qual um
teste continuando dando reao positiva.
Por exemplo, quando dizemos que um soro deu
ttulo de 1:5000 para toxoplasmose, significa que
mesmo diluindo-se a amostra 5000 vezes, a
reao continua positiva.
Uma mesma amostra pode ter ttulo de 1:100 em
um tipo de teste (por exemplo no teste de
precipitao) e ttulo de 1:10.000 em outro teste
(por exemplo ELISA). Isso depender do limiar de
deteco de cada ensaio.

Teste de referncia

Teste j conhecido e usado para um

determinado propsito, com o qual uma
nova metodologia deve ser comparada
durante sua padronizao. So chamados
tambm de padro-ouro.
Por exemplo, qualquer teste sorolgico
proposto para o diagnstico da doena de
Chagas, deve ser comparado com o
xenodiagnstico, baseado na demonstrao
de que o paciente tem o parasita circulante.

Sensibilidade de um teste sorolgico

A sensibilidade de um teste sorolgico refere-se

percentagem de resultados positivos na
populao sabidamente doente, isto , a
proporo de resultados positivos verdadeiros.

Resultado falso-positivo = refere-se a reaes

positivas em indivduos sabidamente sadios

O termo sensibilidade tambm usado para

definir o limiar de deteco de um mtodo, isto
, a quantidade mnima de Ac detectvel.

Especificidade de um teste sorolgico

A especificidade definida pela

percentagem de resultados negativos em
pacientes sabidamente sadios, isto ,
proporo de resultados negativos
verdadeiros. Em outras palavras, um
teste com alta especificidade fornece
poucos dados falso-positivos.

Resultados falso-negativos: corresponde

s reaes negativas em pacientes
sabidamente doentes.

Reao-cruzada

Uma reao cruzada resultado da

similaridade tridimensional entre duas
molculas de antgenos diferentes.
Assim, um Ac gerado contra uma das
molculas pode reagir com a outra, ainda que
sua afinidade seja mais baixa.
Um exemplo prtico das reaes cruzadas a
que se observa entre alguns anticorpos
contra leishmania que reagem cruzadamente
com antgenos de tripanossomas

Preciso

Expressa a concordncia dos resultados

obtidos aps vrias repeties e traduz a
possibilidade de erro acidental do mtodo.
Quanto maior a preciso do teste, menor a
influncia que sofre das condies de
execuo (temperatura, pH, manuseio,
tempo, etc)
A

Exatido ou acurcia

Determina a capacidade do teste em

fornecer resultados muito prximos ao
verdadeiro valor do que est sendo
medido. Detecta erro do sistema ou
tendncia de desvio.
A

Reprodutibilidade

Refere-se obteno de resultados

iguais em testes realizados com a
mesma amostra, por pessoas
diferentes em locais diferentes.

Limiar de reatividade (cut off)

O limiar de reatividade ou cut off de um

teste entendido como o ponto de corte
de um teste, isto , o valor acima do qual
se dever considerar o resultado como
positivo.
A rigor, no existe um teste sorolgico
que estabelea claramente o que um
resultado positivo e um negativo, pois
sempre existem amostras cujos
resultados ficam em uma zona duvidosa

Limiar de reatividade (cut off)

%
a
b

Ttulos
A = no doentes; b = doentes

Antgenos solveis e antgenos

particulados

Reaes com antgenos Solveis:

Precipitao em gel
Precipitao em meio lquido
ELISA
Radioimunoensaio
Quimioluminscncia
Western-blot

Antgenos solveis e antgenos

particulados

Reaes com antgenos particulados:

Hemaglutinao
Aglutinao de ltex
Imunofluorescncia (citometria de
fluxo)
Imuno-histoqumica

Interao Ag Ac
Formao de complexos dependente da dose

Reao de precipitao em meio

lquido

Reao de precipitao - OUCHTERLONY

Imunodifuso dupla de Ouchterlony

Reao de precipitao MANCINI

Imunodifuso radial de Mancini

Nefelometria

Reao-cruzada tipagem ABO

Imunofluorescncia

Imunofluorescncia variaes do mtodo

Radiao
U.V. ou
laser

photo
n

Imunofluorescncia
indireta para Giardia

Deteco de autoanticorpos

FITC isotiocianato de fluorescena verde

Tex Texas red - vermelha

Ensaios
Imunoenzimticos (EIE)
UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA REAO
ANTGENO-ANTICORPO

Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay

ELISA - EnzymeEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Mtodo indireto

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Reao indireta

ELISA

Mtodo de captura ou sanduche

ELISA
Captura para IgM

ELISA
Competio com anticorpo marcado

ELISA
Competio com antgeno marcada

Western BLOTTING

Western BLOTTING

Immunoblotting

Imuno-histoqumica

Radioimunoensaio

Antgenos de agentes infecciosos

Hormnios
medicamentos

Radioimunoensaio