IMUNOLOGIA

Profª Esp. Renata Ellen dos Santos

Técnicas Imunológicas
Testes sorológicos no laboratório
➢ detecção e quantificação de antígeno e anticorpo:
▪ diagnóstico de doenças infecciosas, diferenciação da
fase da doença, avaliação de prognóstico, critério
de cura
▪ dosagem de hormônios

➢ reagentes não marcados ou marcados

➢ uso de peptídeos sintéticos e anticorpos
monoclonais
Hemoaglutinação
□ Hemoaglutinação direta:
Ex: grupo sangüíneo ABO e Rh

□ Hemoaglutinação indireta: hemácias

usadas como um suporte
Ex: pesquisa de Ac anti- Toxoplasma gondii
Reação de hemoaglutinação
 ELISA (enzyme linked
□
immunosorbent assay)
fase sólida: poliacrilamida, agarose, dextran,
poliestireno, polivinil, polipropileno

Placa de ELISA
Etapas do ELISA
□ sensibilização (ou cobertura) da fase
sólida: adição de Ag ou do Ac
□ bloqueio (proteína inerte: soro fetal
bovino, leite desnatado) 
□ adição da amostra (em diluente) *
□ adição do conjugado: anticorpo
purificado marcado com enzima (ex:
peroxidase) 

 lavagens
Etapas do ELISA
□adição do substrato cromogênico:
peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD
(ortofenilenodiamina)
□ interrupção da reação: SDS ou
ácido
□ leitura: leitor de ELISA

 lavagens
Etapas do ELISA
Reação de imunofluorescência direta
- A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de
fluorescência
Pesquisa de antígeno
• amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a

substância fluorescente (conjugado)*

•  microscópio de fluorescência
Reação de imunofluorescência direta
Reação de imunofluorescência indireta
A- pesquisa de antígeno
• amostra (Ag??) + Ac específico  Ag-Ac

*
• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina

*
•• *microscópio
lavagens de fluorescência
 Reação de imunofluorescência indireta
B- pesquisa de anticorpos
• Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??)  Ag-Ac

*
• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *

• microscópio

• determinação do título e classe do Ac

Reação de imunofluorescência indireta
RIFI para pesquisa de Ac anti -T. cruzi
 Citometria de fluxo
□ citômetro de fluxo ou FACS ( fluorescent-activated cell sorter)
□ fonte de excitação: lâmpada de argônio  raio laser (488 nm)

□ características detectadas: tamanho da célula, granulosidade

e fluorescênica emitida
■ tamanho da partícula: detectores situados à frente do raio laser
■ granulosidade: detectores a 900 do raio laser
■ intensidade de fluorescência:
• FL1: emissão na região de 530  30 nm (isotiocianato
de fluoresceína - FITC)
• FL2: emissão na região de 585  26 nm (ficoeritrina -
PE)
• FL3: emissão acima de 630 nm (peridina-clorofila)
 ETAPAS DA CITOMETRIA DE
FLUXO
□ coleta e processamento da amostra
(sangue total)
□ incubação das células com
anticorpos monoclonais
conjugados com fluorocromo
□ aquisição de dados no aparelho
□ análise dos dados: tamanho,
granulosidade e emissão de
fluorescência
Expressão dos resultados
□ gráfico de tamanho x granulosidade (FSC
x SSC): seleção da população a ser
analisada (linfócitos, monócitos,
neutrófilos e eosinófilos)
□ Gráfico de fluorescência (FL1 x
FL2): avaliação de características da
célula
Gráficos de citometria de fluxo
FSC x SSC FL1 x FL2
Aplicações da citometria de fluxo
□ infecção pelo HIV: contagem de linfócitos T
CD4+ e CD8+
□ classificação das imunodeficiências
e leucemias
□ diagnóstico da hemoglobinúria
paroxística noturna
OBRIGADO!!!