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IMUNO ENSAIOS USANDO

CONJUGADOS

REAES USANDO REAGENTES MARCADOS

Conjugado: molcula constituda por duas substncias


ligadas covalentemente e que mantm as propriedades
funcionais de ambas
Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com
isotiocianato de fluorescena (FITC)

HRP: enzima peroxidase

IMUNO ENSAIOS UTILIZANDO


CONJUGADOS
Antgenos

usados nos imuno ensaios:


patgeno inteiro, molculas derivadas de
patgenos, hormnios

Anticorpos

usados: policlonais ou
monoclonais

Ensaios

manuais e automatizados

TCNICAS

1 TCNICAS QUE USAM FLUORESCNCIA


Fluorescncia:

emisso de luz de uma cor aps


irradiao com luz de cor diferente:

FITC: absoro mxima (490-495 nm), emisso


mxima (517 nm)
Tcnicas: imunofluorescncia, citometria de fluxo

Alguns fluorocromos

FITC: isotiocianato de fluorescena

PE: ficoeritrina

Rodamina

IMUNOFLUORESCNCIA

Lmina de imunofluorescncia

Antgeno usado: pode-se usar Ag comercial ou


pesquisar Ag (micrbio) num material coletado do
paciente (ex: secreo)

Exemplo: IMUNOCRUZI: Ag de Trypanosoma cruzi


liofilizado obtido por cultivo em meio de LIT

CONJUGADO E MONTAGEM DA LMINA

Antissoro (anti IgG ou anti IgM): gama globulina


obtida em espcie heterloga (carneiro, cabra)
purificada e conjugada marcada - com
substncia fluorescente (fluorocromo)

Intensidade da luz emitida depende do pH (ao final,


lmina coberta com glicerina de alcalina e lamnula

KIT COMPLETO PARA


IMUNOFLUORESCNCIA

REAO DE
IMUNOFLUORESCNCIA
I - Reao de imunofluorescncia direta
(RIFD)
pesquisa do Ag em clulas ou tecidos
elevada sensibilidade e especificidade
Usa um conjugado para cada sistema

Reao de imunofluorescncia

II - Reao de imunofluorescncia
indireta (RIFI)
do sinal aumento da
sensibilidade em relao RIFD

amplificao

A - pesquisa de antgeno
mais sensvel, uso de um nico
conjugado para diferentes sistemas

Reao de imunofluorescncia

Reao de imunofluorescncia
indireta (RIFI)
B - pesquisa de anticorpo contra um agente
infeccioso
Ag do agente infeccioso (lmina) + soro do
paciente Ag-Ac

LAVAR

Ag-Ac + conjugado anti-IgG ou anti IgM


microscpio

RIFI PARA PESQUISA DE ANTICORPO ANTI

TOXOPLASMA GONDII NO SORO DO PACIENTE

RIFI PARA ANTICORPO SRICO ANTI


LEISHMANIA

DETERMINAO DA CLASSE DO AC

Uso de conjugado contra a classe de Ig que se


quer determinar:

Ex. de conjugado: globulina de carneiro


anti IgG humana marcada pelo FITC

DETERMINAO DO TTULO DE ANTICORPO

Como o resultado liberado:


Toxoplasmose IgG (imunofluorescncia):
Resultado: reagente (ou positivo at) 1:8.192

INTERFERENTES NA PESQUISA
DE IgM POR RIFI

Presena de fator reumatide (FR) falsopositivo:

Competio com IgG falso-negativo


Para eliminar falso positivo e falso negativo:
Usar o Removedor IgG/FR: soro do paciente + soro
com anti IgG humano seguido de centrifugao
usar sobrenadante para dosagem de IgM

KIT PARA IMUNOFLUORESCNCIA PARA AC


ANTI TRYPANOSOMA CRUZI

Desvantagens da RIFI:
Mais demorada, maior nmero de reagentes

Limitaes da reao de imunofluorescncia


Necessidade de microscpio de fluorescncia,
subjetividade, no automao

AUTOMAO NA IMUNOFLUORESCNCIA (E
ELISA)

REAES DE
ENZIMAIMUNOENSAIO
Reao

Ag-Ac monitorada por medida da


atividade enzimtica

Alta

sensibilidade, reagentes estveis,


leitura visual ou fotomtrica, substratos
coloridos ou luminescentes

CLASSIFICAO DOS ENZIMAIMUNOENSAIOS

Ensaios homogneos: atividade da enzima


alterada como parte da atividade imunolgica,
no precisa de lavagem entre as etapas

Ensaios heterogneos: atividade da enzima


no alterada, precisa de lavagem entre as
etapas

ENZIMA IMUNOENSAIO HOMOGNEO


SLFIA (substrate-labelled fluorescent immunoassay)

A atividade da enzima alterada pela ligao do Ac ao substrato fluorognico

ENSAIOS HETEROGNEOS
I - ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay)

Uso de peptdeos sintticos ou


recombinantes e de anticorpos monoclonais
Fase slida: placas de poliestireno

Material da placa tem afinidade por


protena
Interao protena-placa no
covalente

PLACAS E TIRAS PARA ELISA

ETAPAS DO ELISA
sensibilizao

(ou cobertura) da fase slida:


adio de Ag do agente infeccioso (ou de Ac
contra o que se quer pesquisar)
Bloqueio: adio de protena inerte: soro fetal
bovino, leite desnatado
lavagens

ETAPAS DO ELISA
adio

da amostra do paciente (soro) na qual se


deseja pesquisar Ag ou Ac em diluente *
adio do conjugado: anticorpo marcado com
enzima (ex: peroxidase)
lavagens

ETAPAS DO ELISA
o

Adio do substrato cromognico:

peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD


(ortofenilenodiamina) ou ABTS (cido 5-amino
saliclico) (cromgenos)

ETAPAS DO ELISA
Interrupo da reao: adio de SDS ou H2SO4

Leitura do resultado
Leitor de ELISA: Fotmetro multicanal para tiras
ou placas
Filtros: 405, 450, 490, 630 nm
Leitura monocromtica: uso do comprimento de
onda no qual o produto da reao tem maior
absorbncia
Leitura bicromtica ou diferencial: uso de 2
filtros: o primrio e o diferencial

Elimina imperfeies do plstico


Leitura feita usando os 2 filtros, o aparelho libera
a diferena das 2 absorbncias

EXPRESSO DOS RESULTADOS

limiar de reatividade (cut-off): ponto de corte de


um teste sorolgico; pode-se trabalhar com maior
especificidade ou sensibilidade dependendo do
objetivo do teste (ex: seleo de doadores num
banco de sangue)

Cut-off (limiar de reatividade)

Corrigir: b: mxima sensibilidade e especificidade


g: mxima especificidade

Leitor de ELISA

Reao de ELISA
Lavadora de
placas

Pipeta
multicanal

ELISA: ENSAIOS PARA ANTICORPOS

ELISA: ENSAIOS PARA ANTGENOS

II - Western Blot

Pesquisa de antgenos e anticorpos


Exemplos:
- Caracterizar reatividade srica de paciente suspeito
de infeco pelo HIV (teste confirmatrio para
infeco pelo HIV)

II - WESTERN BLOT

Western blot para pesquisa de Ac anti HIV:


Fracionamento das protenas do HIV: separao de acordo
com peso molecular
Transferncia das protenas para membrana de nitrocelulose

Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA: nesse caso


pesquisa-se quais protenas do HIV o soro reconhece
Cromgeno usado deve originar produto insolvel

Western blot

Western Blot

ONDE ESTUDAR

Imunoensaios Fundamentos e Aplicaes. VAZ, TAKEI,


BUENO, 1 edio, 2007
OU

Diagnstico Laboratorial das Principais Doenas


Infecciosas e Auto-Imunes FERREIRA & VILA, 2a
edio, 2001.
OU

Imunologia Mdica - PARSLOW, 10a edio, 2004.


OU

Imunologia Clnica na Prtica Mdica VOLTARELLI,


DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI,
1 edio, 2008.