Oncobiologia

Caderno de Exercícios de Aplicação de Conhecimentos

Cecília Reis Alves Santos

2022-23
1. Identifique os tecidos e estruturas apresentados nas seguintes imagens
a. esófago

b. Colon

c. Intestino delgado
d. Traqueia
2. Distinga entre carcinoma das células pavimentosas e adenocarcinoma.
Na figura seguinte, localize as células que podem dar origem a carcinomas (de
que tipo?) e a sarcomas (de que tipos?)

3. O teste de Ames faz com que seja possível avaliar quantitativamente a

potência de um composto mutagénico. O composto (X) ou uma mistura deste com
um homogeneizado de fígado é aplicado a uma placa de bactérias da espécie
Salmonella que necessitam do aminoácido histidina no seu meio de cultura para
crescerem. Quando o meio não contém histidina, apenas as bactérias que são
mutadas para um genótipo (e fenótipo) independente da histidina conseguem
crescer e formar colónias.

a) Explique a ausência de colónias na placa da direita sabendo que em ambos

os casos as placas não têm histidina.
b) Como se designam os compostos que induzem o crescimento das
salmonelas na ausência de histidina sem serem misturadas com o
homogeneizado de fígado?
c) Como se designam os compostos que só induzem o crescimento das
salmonelas se forem misturados com o homogeneizado de fígado?
3. Neste gráfico, as potências relativas de um grupo de produtos químicos
cancerígenos (ordenada) utilizados para induzir tumores em animais (ratos e
ratinhos) estão representados como uma função do seu potencial mutagénico
medido pelo teste de Ames. Tanto as ordenadas como as abcissas estão
representados graficamente como a quantidade de composto necessária para
provocar um efeito observável (produzindo tumores em 50% dos animais
tratados ou 100 colónias de bactérias de Salmonella mutantes (que crescem no
meio sem histidina).
a) Indique os 2 compostos com maior potencial mutagénico.
b) Indique os 2 compostos com menor potencial carcinogénico.
c) O que pode concluir sobre a relação entre o potencial mutagénico e o
potencial carcinogénico destas substâncias?
4. O microRNA-10b (miR-10b) está normalmente elevado no glioblastoma
(GBM), mas não é expresso em tecidos normais do cérebro. A inibição de miR-
10b tem efeitos pleiotrópicos nas linhas de células derivadas de GBM,
nomeadamente o crescimento de GBM em modelos animais, sem afetar os
neurónios normais e astrócitos. Estes dados sugerem a possibilidade de
desenvolver uma terapia para o GBM tendo este miR10b como alvo.

A fig. 1 mostra a análise da proliferação celular em 2 linhas de glioblastoma (A172

e LN215) usando a quantificação da fase S usando BrdU (A e B). Tanto para
aplicação de uma técnica como da outra, as células foram transfectadas com
oligonucleótidos para inibir o miR-10b ou com um oligonucleótido controlo
(“mock transfection”). Note que as duas linhas celulares foram também
analisadas quanto à expressão de p21 por Western blot (sem serem transfectadas)
(C) e de 3 formas de E2F, com e sem transfecção (D).
a) Faça uma breve pesquisa sobre o BrdU e explique de que modo é que
usando este marcador podemos avaliar a fase S do ciclo celular
b) Como é que acha que variou a expressão de ciclina D nestas amostras? E a
expressão da CDK4/6?
c) Qual o impacto da inibição do miR-10b na quantidade de células em fase
S?
d) Como variam os níveis de p21 nestas linhas celulares de GBM? Como
associa o p21 à proliferação celular?
e) De que modo a inibição do miR-10b afeta a expressão destas formas de
E2F?
f) O que é o E2F? O que poderá ter acontecido upstream para a sua expressão
aumentar?
g) Quais poderão ser as consequências do seu aumento?
h) Relacione a hiperfosforilação da proteína Rb com a atuação do E2F
i) Faça uma pesquisa e identifique técnicas laboratoriais para avaliar a
proliferação celular
5. A galectina-8 é uma das galectinas sobre-expressas em células de
glioblastoma reconhecida pela capacidade de estimular a motilidade
bidimensional das células tumorais. Como a Gal-8 induz a proliferação e a
apoptose noutros modelos celulares, o seu efeito foi também avaliado num
modelo celular de glioblastoma, na linha celular U87.

Utilizou-se western blot e RT-PCR para análise da expressão de Gal-8, e

shRNA na para silenciamento da Gal-8. A proliferação celular, ciclo celular e
apoptose foram analisados por FACS.

FIG. 1 Silenciamento de Gal-8 em células de glioma U87. As células U87 foram

transfectadas com partículas lentivirais contendo shRNAs (shGal-8 # 4 ou shGal-
8 # 5) ou shRNA irrelevante (shC). A expressão das isoformas de Gal-8 (Gal- 8S-
8L) foi determinada 3 dias pós-transfecção por RT-PCR semi-quantitativo (a)
qRT-PCR normalizado para a β-actina (b), e por Western blot, em extractos de
células (células) e 72 h condicionado (meio) (c).

a) Qual dos shGal-8, #4 ou #5 silenciou mais eficazmente a Gal-8?

b) Qual das duas formas foi mais eficazmente silenciada?

6. Noutra experiencia (Fig 2.) as células U87 foram tratadas com Gal-8S (50
ug / ml) durante 24 h na presença ou ausência de lactose 20 mM e avaliou-se a
proliferação celular pelo ensaio do violeta de cristal (a). Em (b) pode-se observar
o efeito do silenciamento da Gal-8 sobre o crescimento celular. As células U87
transfectadas com shGal-8 # 5 ou shRNA (SHC) foram cultivadas durante 1
semana durante 48 h e as células viáveis foram contadas após coloração com azul
de tripano. A figura mostra a percentagem de aumento do número de células em
duas experiências independentes em triplicado (* p <0,01). Em c) o efeito do
silenciamento da Gal-8 na proliferação foi avaliado por citometria de fluxo
através da marcação com CFSE (* P <0,05).

Fig. 2

a) De que modo o ensaio do violeta de cristal permite avaliar proliferação

celular? (Faça uma breve pesquisa)
b) Qual foi o efeito da adição de Gal-8S ao meio de cultura?
c) Qual o impacto da incubação com lactose às células tratadas com Gal-8S?
d) Se há menos células com o silenciamento não poderia estar também
relacionado com o aumento da morte celular?
e) Analise a figura c) . O facto do histograma referente ao silenciamento do
Gal-8S estar mais deslocado para a direita relativamente ao uso do silenciamento
irrelevante significa que as células proliferaram mais com o silenciamento?
f) Isto está de acordo com os resultados mostrados em a)?

7. Na fig. 3 estão representados os dados obtidos na análise da apoptose das

U87 após silenciamento da Gal-8 por citometria de fluxo do ciclo celular e
fragmentação do DNA (a). (b) avaliação da apoptose por ativação da caspase-3
medida por citometria de fluxo. (c) Detecção das células apoptóticas por
imunofluorescência da caspase-3 e do núcleo por coloração com Hoechst.
a) Com o silenciamento do Gal-8S que fase(s) do ciclo sofreu o maior

impacto?
b) O que se pode concluir do efeito do Gal-8S endógeno na apoptose das
células malignas usadas neste estudo?
8. Na polipose adenomatosa familiar (FAP) uma forma hereditária de cancro
do cólon, mutações no gene Apc comprometem o processo de diferenciação dos
enterócitos dando origem a pólipos percursores de tumores malignos (Fig. 1)

Fig 1. Mucosa do cólon de doente de FAP (esquerda) e mucosa cólon normal

(direita)

A fig. 2 mostra uma cripta do cólon onde residem células estaminais que dão
origem aos enterócitos que compõem o epitélio do cólon em contacto com o
lúmen. Estas células proliferam em resposta ao Wnt libertado pelas células do
estroma, mas à medida que atingem a região luminal deixam de proliferar e
começam a diferenciar-se.
Fig. 2-Cripta do cólon.

a) A que recetor se liga o Wnt? Explique a cascata de sinalização que acontece

em resposta à sua ativação.

b) Qual será o produto desta via de sinalização responsável pela indução da

proliferação celular na cripta?

c) Sabendo que as células à esquerda (wild-type) entram em processo de

diferenciação, explique porque é que as células à direita, Apc -/-, continuam a
proliferar e formar pólipos percursores de tumores malignos.

d) Se o individuo fosse Apc-/+, também se observaria este efeito?

e) Como classifica o gene Apc?

9. A expressão do miRNA519 foi comparada em 46 amostras de Glioblastoma

e 15 amostras de tecido normal do cérebro (NB), e em várias linhas de
glioblastoma humanos (U87-MG, T98G, A172 e U373) e numa linha de células
normais de astrócitos humana (NHA) por PCR em tempo real. A figura A mostra
os resultados obtidos para as amostras humanas e a figura B, os resultados
obtidos com as linhas de glioblastoma.
Nas figuras C e D estão representados as curvas de Kaplan-Meier de
sobrevivência e sobrevivência global livres de tumor de doentes em função dos
níveis de expressão do miRNA519.

a) Em que grupo de amostras humanas é mais elevada a expressão do

miRNA519 ?

b) E nas linhas celulares de glioblastoma?

c) Como se relaciona a sobrevivência dos doentes de glioblastoma com os

níveis de miRNA519?

d) Em qual dos gráficos (C ou D) é mostrada uma correlação mais robusta?

Como o STAT3 é um dos alvos possíveis do miR-519, os níveis de STAT3 nas

amostras de glioblastoma dos doentes foram analisados por PCR em tempo real
e imunohistoquímica (Fig. A, B e C)
e) Como se correlacionam os níveis de STAT3 com os níveis de miR-519?

f) Os dados obtidos na análise do mRNA corroboram os dados obtidos na

análise da proteína?

A figuras C e D mostram a expressão de STAT3 e de alguns genes potencialmente

regulados por este fator de transcrição em linhas de glioblastoma transfectadas
com o miR-519 ou com um controlo negativo (miR-NC).

g) Qual foi o efeito da transfeção com o miR-519 na expressão do STAT3

nestas duas linhas de glioblastoma? E nos genes avaliados em D?
No final do estudo, os autores propuseram o modelo representado na figura D
(abaixo) para interpretar os resultados obtidos.

h) Descreva o modelo proposto

i) Identifique as funções das proteínas Mcl1, Bcl2, ciclina D1 e MMP2

j) Classifique os genes representados como proto-oncogenes ou genes

supressores de tumores

k) A que via de sinalização está associado o STAT3? Como pode ser ativado?

l) Discuta a seguinte afirmação

“Os miRNA podem funcionar como oncogenes ou genes supressores de tumores”.
Como classificaria o miR-519?

10. O glioblastoma multiforme é o tumor cerebral primário mais agressivo em

adultos. A sobre-expressão do recetor de EGF (EGFR) é reconhecida como uma
assinatura oncogénica generalizada em glioblastoma multiforme, mas a
complexidade das suas contribuições para o desenvolvimento dos tumores ainda
é pouco compreendida. A hipóxia induz a agressividade do glioblastoma
multiforme por induzir a glicólise aeróbica em vez da oxidação do piruvato na
mitocôndria (OXPHOS), uma característica geral da oncogénese.

Os níveis de expressão do EGFR e piruvato desidrogenase cinase (PDK1) foram

avaliados por PCR em tempo real (qRT-PCR) e Western blot em biópsias GBM
humano. Os resultados estão representados na figura 1, B e C, respectivamente.

a) Como se designa a indução da glicólise aeróbica em vez da oxidação do

piruvato na mitocôndria (OXPHOS) que acompanha o processo de malignização
dos tumores?

b) Há correspondência entre os níveis de mRNA e de proteína (de EGFR e

PDK1) nestas amostras de glioblastoma?

c) Como varia a expressão destes gene e das proteínas correspondentes no

glioblastoma? Identifique as amostras em que há aumento da sua expressão?

d) Para que serve o GAPDH?

Figura 1. Variação da expressão do EGFR e do PDK1 em amostras de glioblatoma
humano em comparação com amostras de cérebro normal por PCR em tempo
real (B) e Western blot (C).

11. Num estudo averiguou-se a relação entre o tamanho dos telómeros e a

atividade da telomerase com a capacidade invasiva de várias linhas celulares de
cancro da mama.

O tamanho dos telómeros foi avaliado por PCR quantitativo em cada linha celular
usando primers específicos que permitem ampliar toda a região telomérica. A
figura 1 mostra os resultados obtidos. Os níveis de proteína nas 4 linhas de cancro
foram comparados por Western blot usando anticorpo contra a proteína (Figura
2 A e B). A atividade da hTERT foi também avaliada nestas linhas celulares de
cancro da mama (Figura 2 C e D), pelo ensaio TRAP (TeloTAGGG Telomerase
PCR ELISA kit, Roche, EUA). A capacidade invasiva destas células foi testada em
camaras de invasão (Figura 3).
Fig. 1- Tamanho dos telómeros em linhas celulares de cancro da mama
(média ± SD). *p < 0.05, **p < 0.01

Fig. 2-Detecção da proteína hTERT e da actividade da telomerase em linhas

celulares de cancro da mama. A) Western blot para hTERT. As células HeLa e
PMN foram utilizadas como controlos positivos e negativos. B) Densitometria dos
sinais obtidos por Western blot representadas como unidades de densidade
óptica relativa (OD). C) Actividade relativa da telomerase (RTA) medida pelo
ensaio TRAP. D) Relação entre actividade de telomerase relativa / OD quantidade
da telomerase. Os valores referem-se à média ± DP de três experiências
independentes. A análise estatística foi realizada comparando as células MCF-7
com SKBR3, T47D e MDA-MB-231. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Fig. 3 Capacidade invasiva das células de cancro da mama. A Imagens

representativas de MCF-7, SKBR3, T47D e MDA-MB-231 na invasão.

a) Identifique as linhas celulares com telómeros de maior e menor tamanho?

b) Como varia a expressão da telomerase em função do tamanho dos

telómeros?

c) Como varia a actividade da telomerase em função do tamanho dos

telómeros?

d) Sugira explicações possíveis para não haver uma relação direta entre a
quantidade da proteína e a sua atividade

e) Existe alguma relação entre a capacidade invasiva destas células e a

atividade da telomerase?
f) Como espera que os níveis de p53 variem com o encurtamento dos
telómeros?

g) Quais as repercussões do encurtamento dos telómeros?

12. A identificação de populações de células estaminais tumorais nas massas

tumorais sugerem que estas são as principais responsáveis pelo crescimento dos
tumores, resistência à quimioterapia e reincidência. No cancro colorectal, o
antígenio CD133 define subpopulações de células estaminais tumorais; no
entanto, as propriedades de resistência às drogas dessas células CD133-positivas
não estão bem definidas. A proteína de resistência do câncer de mama (BCRP) /
ATP-binding cassette subfamília G membro da 2 (ABCG2) está presente na
membrana plasmática de muitos tipos de células cancerosas humanas e contribui
para a multirresistência durante a quimioterapia. Neste estudo foi-se averiguar o
impacto deste transportador na resistência de populações de células CD133+ à
quimioterapia.
Numa primeira fase determinou-se a percentagem de células CD133+ por FACS
em tumores do cólon (Fig. 1) e analisou-se a capacidade desta população CD133+
em formar neurosferas in vitro (Fig. 2).
Seguidamente foi-se estudar a expressão do transportador ABCG2 nas células
CD133+ (Fig. 3) e finalmente avaliou-se o efeito do silenciamento deste
transportador na resposta de tumores derivados de células CD133+ e de uma
outra linha celular LS174T à drogas quimioterapeuticas convencionais (Fig. 4).
Fig. 1- FACS de células de cancro do cólon positivas para o CD133

Fig. 2- Comparação da capacidade de formar neurosferas das células CD133+ com

as células CD133- obtidas de 4 amostras de cancro do cólon. Estão representadas
as médias e desvio padrão de 3 experiências independentes (p<0.05).
Fig. 3. Identificação de células positivas para CD133 e ABCG2 em biópsias de
cancro do colon. Nucleos corados com DAPI (azul). CD133 marcado a vermelho
e ABCG2 marcado a verde. As setas indicam exemplos de células que co-
expressam CD133 e ABCG2.

Fig. 4- Efeito do silenciamento do ABCG2 (siABCG2) no crescimento de tumores

derivados de células LS174T e células CD133 positivas tratados com 5-FU (A) ou
oxaliplatina (B) em murganhos imunocomprometidos (NOD/SCID mice). V/V0
representa o volume final do tumor em relação ao volume inicial (p<0.05 após 15
dias de tratamento nas células silenciadas para o ABCG2.

a) Indique a percentagem de células CD133+ nos tumores coloretais

b) Identifique as células com maior capacidade de formar neurosferas

c) As células CD133+ expressam ABCG2? Qual a percentagem de células CD133+

e ABCG2+?

d) Qual o impacto do silenciamento de ABCG2 na resistência à quimioterapia?

13. A figura 1 mostra imunocitoquímica de uma linha de células de cancro da

mama onde o efeito da quercetina foi avaliado quando administrado de diferentes
formas (1-controlo, 2-controlo da encapsulação, 3-quercetina livre, 4-quercetina
encapsulada). Foi detetada a expressão da proteína caderina E (a verde), e os
núcleos das células (marcados a azul) nas 4 condições acima descritas. Na figura
2 observamos os resultados do Western blot de extratos de proteína das amostras
L1-L4 feitos com um conjunto de anticorpos que permitem inferir sobre o
potencial angiogénico, invasivo e proliferativo das células sujeitas aos diferentes
tratamentos.

Figura 1
Figura 2
a) Que tipo de junções celulares são visíveis em 4?
b) Em que painéis as células apresentam mais características
mesenquimatosas? Porquê?
c) Como se relaciona a capacidade invasiva com os níveis de caderina E num
tumor de origem epitelial? Explique porquê

d) Onde são mais elevados os níveis de beta-catenina livre? Porquê?

e) Classifique a Caderina E em oncogene ou gene supressor de tumor e

explique o que é preciso acontecer aos alelos da caderina para haver a sua perda
de expressão

f) Associe os marcadores estudados na figura 2 aos potenciais angiogénico,

invasivo e proliferativo das células sujeitas aos diferentes tratamentos e explique
porquê.