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CURSO 1
REVISÃO
Comissão de Formação do Colégio de Biologia Humana e Saúde da Ordem dos
Biólogos
Dra. Tânia Lapão – Especialista em Análises Clínicas
Dr. Jorge Reis – Especialista em Análises Clínicas
Dr. Jorge Pinheiro – Especialista em Análises Clínicas
Índice
Objetivos Específicos ..................................................................................................................... 4
Resumo.......................................................................................................................................... 4
1. Introdução ................................................................................................................................. 5
1.1 História da Citometria de Fluxo........................................................................................... 6
2. Sistemas de um Citómetro de Fluxo ......................................................................................... 9
2.1 Sistema de Fluídos............................................................................................................. 10
2.2 Sistema Ótico e Deteção de Sinal...................................................................................... 11
2.3 Processamento do Sinal e Análise de Dados..................................................................... 15
2.4 Princípios da Fluorescência ............................................................................................... 18
3. Controlo de Qualidade ............................................................................................................ 21
3.1 Controlo Negativo ............................................................................................................. 21
3.2 Controlo para Compensações ........................................................................................... 22
3.3 Controlo Isotipo................................................................................................................. 24
3.4 Controlo de Fluorescência Menos Um (Fluorescence Minus One – FMO) ....................... 25
3.5 Controlo Biológico ............................................................................................................. 26
3.6 Controlo Externo da Qualidade ......................................................................................... 26
4. Aplicações Gerais da Citometria de Fluxo ............................................................................... 27
4.1 Análise do Ciclo Celular ..................................................................................................... 27
4.2 Apoptose ........................................................................................................................... 28
4.3 Células T Reguladoras........................................................................................................ 29
4.4 Separador Celular .............................................................................................................. 30
5. Aplicação da Citometria de Fluxo em Hematologia ............................................................... 31
5.1 Análise Eritrocitária ........................................................................................................... 31
5.2 Hemoglobinúria Paroxística Noturna (HPN) ..................................................................... 32
5.3 Imunofenotipagem de Leucemias Agudas ........................................................................ 33
5.4 Doença Residual Mínima (DRM) ....................................................................................... 35
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6. Citometria de Fluxo no Diagnóstico de Imunodeficiências (ID) .............................................. 36
6.1 Infeção por HIV.................................................................................................................. 36
6.2 Imunodeficiências Primárias (IDP) .................................................................................... 37
6.2.1 Estudos de Função dos Linfócitos .................................................................................. 38
6.2.2 Agamaglobulinemia ligada ao X ..................................................................................... 39
6.2.3 Doença Granulomatosa Crónica (DGC) .......................................................................... 39
6.2.4 Estudos de Função dos Granulócitos e Monócitos – Explosão Oxidativa ...................... 40
6.2.5 Análise de Citocinas Intracelulares em Linfócitos ou Monócitos................................... 40
7. Conclusão ................................................................................................................................ 41
8. Bibliografia .............................................................................................................................. 42
9. Avaliação Final ......................................................................................................................... 45
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Objetivos Específicos
Resumo
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1. Introdução
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1.1 História da Citometria de Fluxo
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O sistema CD é normalmente usado como marcador celular e permite caracterizar as
células de acordo com as moléculas que estão presentes na sua superfície, sendo
utilizado para associar as células com as funções, propriedades imunes e estádios de
maturação (Tabela 1).
Tabela 1 – Relação entre alguns antigénios CD, células e funções (adaptado de abcam, 2013).
CD3 Mature T cells and thymocytes T cell activation signaling and regulation of T cell
receptor (TCR) expression
CD4 Thymocyte subsets, T helper cells, T cell activation, thymic differentiation and receptor
regulatory T cells, monocytes and for HIV
macrophages
CD5 Thymocytes, T and B cell subsets and B-cell Regulates T cell: B cell interactions. Interacts with
chronic lymphocytic leukemia cells CD72
CD7 Thymocytes, T cells, natural killer cells and T-cell costimulation. Interacts with Secreted and
pluripotent hematopoietic stem cells transmembrane protein 1 (SECTM1)
CD8 Thymocyte subsets and cytotoxic T cells Co-receptor for MHC class I molecules
CD10 B and T cell precursors, fibroblasts, neurons Peptidase, regulates B cell growth
and bone marrow stromal cells
CD11b Granulocytes, monocytes, natural killer Cell adhesion, apoptosis and chemotaxis
cells, T and B cells and dendritic cells
CD15 Granulocytes, monocytes, neutrophils and Cell adhesion. Mediates phagocytosis and
eosinophils chemotaxis
CD16 Neutrophils, natural killer cells and Low affinity Fc receptor. Mediates phagocytosis and
macrophages antibody dependent cell mediated cytotoxicity
(ADCC)
CD19 B cells Regulates B cell development, activation and
differentiation. Signal transduction
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CD22 Mature B cells B cell adhesion and signal transduction
CD24 B cells, granulocytes, epithelial cells and Regulation of B cell proliferation and differentiation.
monocytes
CD33 Monocytes, granulocytes, mast cells and lectin activity and adhesion. A receptor that inhibits
myeloid progenitors the proliferation of normal and leukemic myeloid
cells
CD34 Hematopoietic stem cells and progenitors Cell adhesion (via L-selectin). Possible role in early
and capillary endothelial cells hematopoiesis by mediating the attachment of stem
cells to the bone marrow extracellular matrix or
directly to stromal cells
CD41 Platelets and megakaryocytes Platelet activation and aggregation
CD45 Hematopoietic cells (not erythrocytes and Critical for B and T cell receptor mediated activation.
platelets) Also required for thymic selection
CD45RO Activated T cell subsets, memory B and T Critical for B and T cell receptor mediated activation
cell subsets, monocytes, macrophages,
granulocytes, cortical thymocytes and
dendritic cell subsets
CD45RA B and naïve T cell subsets, monocytes and Critical for B and T cell receptor mediated activation.
medullary thymocytes Also required for thymic selection
CD55 Epithelial cells and all cells that are in close Regulates complement activation. Ligand or
contact with plasma complement proteins protective molecule in fertilization. Signal
transduction
CD56 Neural tissues, natural killer cells, T cell Homophilic and heterophilic adhesion
subsets, small cell lung carcinoma
CD59 Hematopoietic and non-hematopoietic cells Prevents complement polymerization. Protects cells
from complement mediated lysis
CD61 With CD41 on platelets, with CD51 on Mediates cell adhesion to diverse matrix proteins
macrophages, endothelial cells, fibroblasts,
megakaryocytes, osteoclasts, mast cells and
macrophages
CD64 Monocytes and macrophages Binds to the Fc region of IgG with high affinity
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CD69 Activated leukocytes, natural killer cells, Signal transmitting receptor. Involved in early
thymocyte subsets, platelets, Langerhans events of T cell, natural killer cell, monocyte and
cells and activated macrophages platelet activation
CD71 Proliferating cells, reticulcytes, erythroid Controls iron uptake during cell proliferation
precursors and activated leukocytes
CD117 Hematopoietic stem cells and progenitors. Crucial for development of gonadal and pigment
stem cells
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2.1 Sistema de Fluídos
A câmara de fluxo, constituida por uma cuvete de quartzo preenchida por uma solução
salina (fluído de revestimento ou sheath fluid), apresenta pressão inferior à pressão da
suspensão celular. A diferença de pressões e o formato cónico da câmara de fluxo
(flow cell) criam um fluxo laminar (focagem hidrodinâmica), forçando as células a
passar individualmente pelo centro da câmara de fluxo, sendo intercetadas pelo laser
que incide perpendicularmente sobre elas (ponto de interrogação) (Figura 1).
Figura 1 - O sistema de fluídos consiste num canal central onde a amostra é injetada. A suspensão celular está
imersa num líquido envolvente - sheath fluid, que cria uma pressão positiva e faz com que as partículas sejam
forçadas a moverem-se, em fila, no centro do fluído (sample core) por um processo designado por focagem
hidrodinâmica. A pressão da amostra deve ser sempre superior à pressão do sheath fluid, podendo ser ajustada
para aumentar ou diminuir a largura da passagem da amostra. Quando a pressão da amostra é baixa, o fluxo de
passagem é estreito e o nº de eventos é reduzido. Se a pressão for elevada, o fluxo de eventos é superior. Se o
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sample core for demasiado âmplo algumas células podem passar pelo laser fora do centro e intercetá-lo a uma
intensidade de excitação inferior à óptima, tendo como consequência uma redução de fiabilidade de resultados
(adaptado de Cossarizza et al., 2017).
Os lasers são as fontes luminosas de eleição, porque emitem luz com um comprimento
de onda estreito e constante, mantendo um espetro muito puro. Um grande número
de citómetros utilizam apenas um único laser (azul 488nm). No entanto, alguns
sistemas suportam já dois ou mais lasers, como seja: laser vermelho 603nm e/ou laser
violeta 405nm.
O sistema ótico é constituido por: fonte luminosa, lentes que captam a luz emitida
resultante da interação entre partícula e o laser; cabos de fibra ótica; sistema de
espelhos e filtros (que separam e direcionam comprimentos de onda específicos da luz
captada) e detetores específicos (Figura 2).
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Figura 2 - Esquema do layout do citómetro FACS Calibur da Becton, Dickinson and Company (BD), com a capacidade
de detetar 4 cores. É constituido por dois lasers (azul de 488nm e o vermelho de 635 nm), uma câmara de fluxo e
uma combinação de lentes, filtros shortpass (SP) e longpass (LP), espelhos dicróicos (DM), detetores de dispersão e
4 detetores de fluorescência (FL1, FL2, FL3 e FL4) (adaptado de Virgo et al., 2012).
Os parâmetros medidos por este sistema podem ser detetados em canais óticos ou em
canais de fluorescência. Os canais óticos determinam características morfológicas da
célula, como tamanho e complexidade interna (através da dispersão da luz observada
durante a interação física do laser com a célula).
A luz difratada é captada por lentes e direcionada para um detetor de fotodiodo que
capta a intensidade da luz dispersa frontalmente, forward-scatter (FSC), e fornece
informações sobre o tamanho da célula.
A luz refratada e refletida é captada por lentes localizadas perpendicularmente à fonte
luminosa e transmitem o sinal para um tipo de detetor muito sensível, chamado de
photomultiplier tubes (PMTs), que capta a intensidade da luz dispersa lateralmente
(90º), designado de side-scatter (SSC), que fornece informações sobre a complexidade
e granulosidade interna da célula.
É necessário utilizar um detetor muito sensível para SSC, porque a dispersão lateral
corresponde a cerca de 10% do sinal de luz emitida (Figura 3).
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Figura 3 – Análise das características físicas da célula: a luz frontal (FSC) é proporcional ao tamanho celular e a luz
lateral (SSC) fornece informação sobre a complexidade interna ou granulosidade da célula (adaptado de Adan et al.,
2015).
Figura 4 - As células ou outras partículas quando iluminadas pelo laser provocam a dispersão da luz. São medidos
dois parâmetros de dispersão: a dispersão frontal (FSC) e a dispersão lateral (SSC). O FSC é uma medida do tamanho
da célula, ou seja, os linfócitos são mais pequenos que os monócitos e granulócitos. O SSC é medido num ângulo de
90º em relação ao FSC, sendo uma medição da granulosidade e complexidade nuclear. Por este motivo, os
monócitos e granulócitos apresentam um SSC maior que dos linfócitos. No entanto, estes parâmetros devem ser
utilizados com algum cuidado: as células pilosas, características de um tipo da leucemia de células pilosas ou
cabeludas, aparecem maiores que os linfócitos normais, isto porque as vilosidades (projeções citoplasmáticas)
destes linfócitos aumentam o FSC (adaptado de Rahman, 2014).
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Ao serem excitados pelo laser, fluorocromos ou compostos celulares com
fluorescência intrínseca, absorvem energia que emitem sob a forma de fluorescência
por emissão de um fotão (com maior comprimento de onda e menor energia).
A fluorescência, assim como a dispersão lateral da luz, é detetada pelos PMTs, sendo a
sua intensidade proporcional à quantidade de marcadores presentes na célula.
A fluorescência é também selecionada e direcionada por filtros óticos altamente
específicos para os PMTs que captam e convertem os sinais luminosos em pulsos
eléctricos. Os citómetros de fluxo utilizam diferentes tipos de filtros e espelhos que
permitem a passagem de comprimentos de onda específicos tornando possível a
deteção simultânea de diferentes fluorescências: os filtros do tipo longpass (LP)
transmitem comprimentos de onda iguais ou maiores ao especificado; enquanto que
os filtros shortpass (SP) transmitem comprimentos de onda iguais ou menores; os
filtros do tipo bandpass (BP) transmitem apenas uma faixa de comprimento de onda
sendo, desta forma, mais específicos.
A configuração de um citómetro pode ainda apresentar espelhos dicróicos, que
podem ser filtros longpass ou shortpass, colocados num ângulo de 45º que divide os
comprimentos de onda de luz em duas direcções (Figura 5).
Figura 5 – Representação dos vários tipos de filtros e espelhos que podem fazer parte do sistema ótico de um
citómetro de fluxo (adaptado de abcam).
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2.3 Processamento do Sinal e Análise de Dados
Quando a luz atinge um PMT, uma pequena corrente (alguns microamperes) é criada.
A voltagem gerada tem uma amplitude proporcional ao número total de fotões
recebidos pelo detetor e é, então, ampliada por uma série de amplificadores (Amp)
lineares ou logarítmicos e, analogamente, transformada em sinais elétricos (5-10
voltes) por convertores digitais (ADC) (Figura 6).
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Figura 7 - Possíveis representações gráficas dos parâmetros FSC e SSC. Cada evento é colocado no canal
correspondente ao valor do sinal: sinais brilhantes são visualizados em canais mais à direita em relação a sinais
menos intensos. Os dados podem ser representados em gráficos biparamétricos (plots): um parâmetro no eixo do x
e o outro no y, sendo que a contagem surge como densidade ou contorno. Um dot plot mostra 2 parâmetros e cada
dot representa um evento. Em contrapartida, um density plot representa os dados como frequência. No color dot
plot a cor é utilizada para identificar diferentes frequências de eventos. O contour plot é igual ao density plot mas
as células são apresentadas em linhas. Um histograma é a representação gráfica de apenas um parâmetro, onde no
eixo do x está representado o valor do sinal em canais numéricos e no do y estão representados o nº de eventos por
canal numérico (adaptado de Betters, 2015).
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Figura 8 – A combinação mais frequente na criação de gates é a estruturação sequencial: os leucócitos do sangue
periférico foram marcados com CD20-FITC (marcador para as células B), CD2-PE (marcador das células T) e CD8-ECD
(marcador das células T citotóxicas). A gate designada de lymphs foi desenhada à volta dos linfócitos de acordo com
o seu FSC e SSC. Esta primeira gate foi utilizada para criar o segundo plot de fluorescência CD20/CD2, para limitar a
análise apenas aos linfócitos T (CD2+CD20-). No terceiro plot – CD8/CD2, já são apenas vizualizadas estas mesmas
células, sendo possível observar uma subpopulação de células T CD2+CD8+ - linfócitos T citotóxicos (adaptado de
Ormenod, 2008).
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Este processo permite caracterizar as células alvo em termos de tamanho e
complexidade e afinar a estratégia de análise (Figura 9).
Figura 9 – É prática corrente a estratégia de gates desenhadas a partir da população selecionada no plot FSC/SSC.
No entanto, e em alguns casos, não é claro onde essa região deve ser criada: células tumorais humanas de
carcinoma de ovário foram adicionadas a células de sangue periférico e marcadas com Ber-EP4-FITC (marcador de
células de ovário). (B) No plot Ber-EP4/SSC foi desenhada uma primeira gate a delimitar as células Ber-EP4 positivas,
que foi utilizada como referência para evidênciar essa mesma subpopulação no plot FCS/SSC (A) e (C). Os leucócitos
foram identificados baseados no seu side scatter e na falta de expressão do marcador Ber-EP4-FITC, servindo como
controlo negativo (adaptado de Ormenod, 2008).
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As sondas fluorescentes são usadas numa grande variedade de aplicações, desde:
identificação de subpopulações, identificação de recetores de superfície ou organelos
intracelulares, imunofenotipagem, determinação do conteúdo em DNA, medições de
actividades enzimáticas, estudos de viabilidade, etc.
Os fluorocromos são moléculas capazes de aceitar (absorver) energia luminosa de um
determinado comprimento de onda e re-emitir luz com menor energia e maior
comprimento de onda (Lei de Stokes), estes dois processos são designados de
excitação e emissão, respectivamente. Todos os fluorocromos apresentados na Figura
10 são excitados pelo laser azul 488 nm, mas apresentam diferenças nos espetros de
emissão. Sendo assim, é possível utilizar mais do que um fluorocromo em simultâneo
na marcação das células, permitindo obter informação sobre a co-expressão de vários
marcadores na mesma célula.
Figura 10 - Espetros de emissão de alguns fluorocromos mais utilizados em citometria de fluxo. Todos são
excitados pelo mesmo laser azul 488nm mas apresentam espetros de emissão diferentes (adaptado de Bushnell,
2015).
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Desta forma, e para além das considerações anteriores, existem algumas regras
básicas para a escolha dos fluorocromos e as suas combinações: devemos optar pelos
fluorocromos mais brilhante (de acordo com o stain index é possível comparar o brilho
relativo entre fluorocromos, como pode ser avaliado na Tabela 2); minimizar o
potencial de sobreposição dos espetros ou spillover entre fluorocromos; e reservar os
fluorocromos mais brilhantes para os anticorpos com expressão celular mais fraca.
Tabela 2 – stain Index de alguns fluorocromos com muita expressão em citometria de fluxo. O stain Index é definido
como D/W, onde D é a diferença entre a população negativa e positiva, e W é 2SD da população negativa (adaptado
de Maecker et al., 2012).
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Mais recentemente, têm sido desenvolvidas nanopartículas com propriedades de
semicondutores (Quantum Dots). Estas partículas são muito estáveis e apresentam
espetros de emissão muito estreitos e diferenciados, úteis em protocolos
multiparamétricos.
3. Controlo de Qualidade
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O FSC e SSC são usualmente ajustados para que as células apareçam em escala.
Conjuntamente, a sensibilidade dos PMTs é verificada para que as células apareçam
com fluorescências negativas, mas dentro da escala. Este controlo negativo permite,
também, ao operador avaliar a auto-fluorescência natural das células e estabelecer
uma fronteira entre o negativo e intensidades de fluorescência superiores.
A auto-fluorescência é a fluorescência natural que ocorre na célula devido a alguns
componentes da mesma: compostos cíclicos como NADP(H), colagéneo, riboflavina,
aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano, fenilalanina). Estes compostos absorvem
luz entre UV até azul (355-488 nm) e emitem no azul a verde (350-550 nm). As
consequências da auto-fluorescência podem ser a perda de resolução e sensibilidade
do sinal nos intervalos de comprimentos de onda referidos.
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Figura 11 – Spillover e compensação: (A) Espetros de emissão dos fluorocromos PerCP-Cy5.5 e PE-Cy7. (B) Linfócitos
do sangue periférico marcados com CD4-PerCP-Cy5.5: o sinal do fluorocromo PerCPCy5.5 entra no detetor PE-Cy7,
sem compensação aplicada (esquerda), e com compensação aplicada (direita) (adaptado Cossarizza et al., 2017).
Figura 12 - Sobreposição de espetros e compensação de fluorescência. (a) Mostra uma correta aplicação de
compensação em células marcadas com FITC no detetor FL1. A imagem (b) exemplifica um caso de compensação
excessiva, onde as células aparecem compactadas no eixo, sendo difíceis de visualizar. (c) Mostra a fluorescência
específica do detetor FL1 a ser captada no detetor FL2 (adaptado de Virgo et al., 2012).
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3.3 Controlo Isotipo
O controlo isotipo tem uma longa história em citometria de fluxo, sendo definido
como a quantidade mínima ou irrelevante de anticorpo (Ac) da mesma classe da
imunoglobulina (Ig) do Ac alvo utilizado no painel em MFC. Funciona como controlo
negativo, revelando a fluorescência basal emitida pela célula alvo marcada com
anticorpo não específico a nenhuma proteína desta célula. Desta forma, a principal
função do controlo isotipo é permitir, padronizar o limite acima do qual os sinais de
fluorescência serão interpretados como positivos ou verdadeiros e não apenas
"ligações não específicas".
É de realçar que o controlo isotipo não é um controlo negativo perfeito, devido à
variabilidade durante a purificação do Ac e da conjugação dos fluorocromos entre os
diferentes lotes e fabricantes.
Durante a pesquisa de antígeno expresso com baixa intensidade, em que não há clara
separação entre população positiva e negativa, o controlo isotipo pode ser bastante
válido. Apesar de não garantir a estimativa exata da percentagem de células positivas,
contribui para estabelecer que a população positiva realmente expressa o antigénio
pesquisado.
Da mesma forma, na marcação intracelular é apropriado o uso de controlo isotipo para
monitorizar os efeitos do procedimento de fixação, permeabilização e lavagem sobre a
auto-fluorescência e ligações de anticorpos não específicas.
Em resumo, tradicionalmente, o controlo isotipo é usado para estimar o número de
células que reagem de forma não específica com o anticorpo investigado.
Para alguns autores, a sua utilização pode ser preterida devido à presença de um
controlo negativo, o que não é incorreto quando a população positiva de interesse é
claramente separada da negativa. Neste caso, a população negativa pode ser usada
como fronteira entre células positivas e negativas, sem interferir na percentagem de
células positivas, além da redução de custo dos testes.
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3.4 Controlo de Fluorescência Menos Um (Fluorescence Minus One –
FMO)
Figura 13 - Exemplo de um controlo FMO num painel com 3 fluorocromos. Os density dots evidenciam a diferença
no canal de PE entre o controlo negativo e o controlo FMO. O controlo FMO permite delimitar com maior precisão a
fronteira entre a expressão negativa e positiva relativamente ao sinal no canal de PE (adaptado de Bushnell, 2015).
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3.5 Controlo Biológico
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4. Aplicações Gerais da Citometria de Fluxo
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A alteração pode ser por excesso ou por defeito, sendo designadas, respectivamente,
por hiperploidia ou hipoploidia de DNA. Para se avaliar o grau de alteração é utilizado
o índice de DNA. Este representa o quociente entre a quantidade de fluorescência
detetada para a moda de células patológicas nas fases G0/G1 e a moda de
fluorescência obtida para as células normais diplóides nas mesmas fases do ciclo
celular. Desta forma, quando o índice de DNA é igual a 1 é considerada diploidia de
DNA, e nos casos em que o índice é diferente de 1 considera-se aneuploidia de DNA
(superior a 1 é hiperploidia, inferior a 1 é hipoploidia).
Um conteúdo anormal em DNA, aneuplóide, pode ser determinado numa população
de células tumorais, estando associado a malignidade e a um mau prognóstico em
alguns tipos de cancro. A análise de DNA é uma aplicação importante na MFC, pois
tanto as anomalias fenotípicas como no DNA demonstraram vantagem no
conhecimento da agressividade clínica e da resposta ao tratamento, assim como na
distinção entre gamapatia monoclonal e mieloma. Por este motivo, após o diagnóstico
destas patologias é necessário o estudo do seu DNA.
4.2 Apoptose
Necrose e apoptose são as duas formas de morte celular e podem ser diferenciadas
com base nas características morfológicas, bioquímicas e moleculares de cada
processo. A necrose é um processo desordenado, que ocorre em condições
patológicas e que se caracteriza pela perda de integridade da membrana plasmática. A
apoptose é um evento programado, com a função de manter a homeostase do
organismo e que se caracteriza por manter a integridade da membrana.
Devido a uma grande diversidade de moléculas que podem ser avaliadas para
caracterizar os eventos apoptóticos, a citometria de fluxo é uma ferramenta cada vez
mais utilizada no estudo de diversas doenças associadas a este processo.
Uma das estratégias muito utilizadas é a conjugação de PI + Anexina-V (Figura 15). A
membrana plasmática integra é impermeável ao PI, e a Anexina-V tem a capacidade de
se ligar à fosfatidilserina. No processo incial de apoptose, a fosfatidilserina é
translocada para a superfície externa da membrana celular, permitindo então a ligação
da Anexina-V.
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Figura 15 - Conjugação de Anexina-V e PI para a avaliação da necrose e apoptose celular. As células necróticas são
positivas apenas para a marcação com PI, as células em apoptose inicial (ainda com a membrana integra) são
positivas apenas para Anexina-V, e as células em apoptose tardia são positivas para as duas marcações.
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a b
Figura 16 - Expressão de FoxP3 nos diferentes subgrupos de células T humanas CD4+CD127+/-. A maior
parte das células CD4+CD25+, especialmente as células com expressão forte de CD25, expressam níveis
baixos de CD127 (a). Mais importante, a análise por citometria de fluxo da expressão de FoxP3 nas
células T CD127+/- e CD127+, revelou que a maior percentagem de células T FoxP3+ são CD127+/- (b)
(adaptado de Liu, et al., 2006).
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Figura 17 – Imagem real das placas defletoras que integram o Sorter BD FACS ARIA II, pertencente à Plataforma
Científica - Translational Cytometry, do I3S Instituto de Investigação e Inovação em Saúde.
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5.2 Hemoglobinúria Paroxística Noturna (HPN)
Figura 18 - Diagnóstico de HPN. (A) Mostra a expressão alta de CD55 e CD59 nos glóbulos vermelhos de um
indivíduo normal. Na imagem (B) alguns clones de células estaminais produzem glóbulos vermelhos com expressão
baixa de CD55 e CD59 (adaptado de Brown et al., 2000).
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5.3 Imunofenotipagem de Leucemias Agudas
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A inclusão de um maior número de marcadores aumenta a probabilidade de localizar
um clone anormal.
Figura 19 - Imunofenotipagem de leucemia mielóide aguda. O dot plot SSC/CD45 permite discriminar várias
populações de leucócitos no sangue periférico. A gate A inclui os linfócitos maduros; gate B os monócitos; gate C
granulócitos; gate D células mielóides imaturas. A população D expressa CD13 e CD34, um marcador da linhagem
mielóide e de células estaminais, respetivamente. A co-expressão, no sangue periférico, é sugestivo de leucemia
mielóide aguda (adaptado de Brown et al., 2000).
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5.4 Doença Residual Mínima (DRM)
Figura 20 – Células da medula óssea de uma criança diagnosticada com leucemia linfoblástica aguda (LLA) e
considerada em remissão. As células mononucleadas foram separadas e marcadas com 3 anticorpos associados ao
fenótipo de leucemia: CD19/CD34/CD13 e analisadas em conjunto com o controlo isotipo. O plot CD34/CD13 foi
construido a partir da gate de células CD34+CD19+, que representam as células que fazem parte da gate definida no
plot FSC/SSC. No controlo isotipo, 62 células eram CD34+CD13+, e na amostra positiva foram quantificadas 2021
células (Adaptado de Ormenod, 2008).
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6. Citometria de Fluxo no Diagnóstico de Imunodeficiências (ID)
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6.2 Imunodeficiências Primárias (IDP)
Alguns indivíduos nascem com anomalias genéticas em que o SI não atua de forma
eficaz em infeções, apresentando risco aumentando de doenças autoimunes e
neoplasias. Estas condições são definidas como imunodeficiências primárias (IDP).
Atualmente, conhecem-se mais de 130 tipos de IDP e a sua classificação baseia-se na
sua caracterização fenotípica e componente principal do SI afetado. As
imunodeficiências mais graves manifestam-se em idade pediátrica, sendo mortais
senão tratadas.
Outras, mais ligeiras, são apenas detetadas em idade adulta. A grande maioria das IDP
tem um denominador comum: o aumento da susceptibilidade a infeções que se
caracterizam por ser recorrentes, graves, causadas por agentes oportunistas ou por má
resposta à terapêutica. Algumas IDP estão associadas a alterações noutros sistemas,
como seja, o endócrino, gastrointestinal, neurológico, cardiovascular, osteoarticular.
Para a avaliação de doentes com suspeita de IDP, o hemograma com contagem
diferencial de leucócitos e estudos de imunidade humoral (avaliação de componentes
solúveis do SI do sangue, tais como, imunoglobulinas, complemento, etc) são
extremamente importantes numa primeira fase. Os resultados destes estudos, em
conjunto com a história clínica, estabelecem a necessidade de uma avaliação da
imunidade celular, que tem como objetivos quantificar e caracterizar subpopulações
celulares ou analisar determinada função celular.
Quando existe suspeita de IDP, o estudo de imunofenotipagem de 1ª linha visa
enumerar as principais populações linfocitárias (Figura 21).
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Figura – 21 Análise multiparamétrica das diferentes subpopulações linfocitárias, numa amostra de sangue
periférico. Os eixos ou cursores horizontais e verticais delimitam positividade ou negatividade para o marcador. Os
marcadores utilizados foram: CD45, CD3, CD19 e CD56 (cortesia do Serviço de Imunologia do CHP, Dra. Judite
Guimarães)
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6.2.2 Agamaglobulinemia ligada ao X
Caso Clínico
Sexo masculino, aos 9 meses gastroenterite. Desde os 2 anos otites supuradas
recorrentes com diminuição da acuidade auditiva. Pneumonia lobar aos 4 e 4.5 anos.
Resultados Laboratoriais: Hipogamaglobulinemia – IgG 720 mg/dL (724-1591), IgA <
0,1, IgM 15 mg/dL (25-182); Ausência de isohemaglutininas (anticorpos naturais do
tipo IgM) e défice de IgG em resposta a vacinas (anti-Pneumococos e anti-toxóide
tetânico); Hemograma normal; Imunofenotipagem dos linfócitos T e NK normal,
linfócitos B (CD19) < 0,01% (16-36%), 0/mm3 (260-1510).
Para rastreio de IDP, foi estudado o irmão de 4 meses de idade, sem quaisquer
manifestações clínicas, onde foi encontrada diminuição da IgA e IgM com IgG normal, e
0,4% de linfócitos B.
Défice de produção de anticorpos + linfopenia B (< 2%) em 2 irmãos permite
diagnosticar com alta probabilidade o Défice de BTK.
A doença granulomatosa crónica (DGC) é uma IDP com incidência de 1:250000, mais
comumente ligada ao cromossoma X, que se caracteriza por incapacidade de formação
de produtos reativos de oxigénio pelas células fagocíticas (neutrófilos e monócitos)
devido a defeitos nos componentes do sistema da oxidade do NADPH (gp91, p22, p67
ou p47 phox). Há défice da atividade microbicida, sem défice da fagocitose e,
consequentemente, infeções graves por microrganismos produtores de catalase,
sobretudo bactérias e fungos (Aspergillus).
Anomalias dos leucócitos possíveis de analisar por MFC: Défice da explosão oxidativa;
Défice de gp91 phox (na forma ligada ao X), p22, p67 ou p47 phox.
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6.2.4 Estudos de Função dos Granulócitos e Monócitos – Explosão
Oxidativa
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7. Conclusão
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9. Avaliação Final
( Selecione a resposta mais correta/completa)
a) Toda a luz
b) Luz com comprimento de onda inferior a 550nm
c) Luz com comprimento de onda entre 550nm e 605nm
d) A luz não atinge o detetor
e) Luz com comprimento de onda superior a 550nm
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3 – A utilização de controlos em MFC é essencial, pois fornecem pontos de referência
para a interpretação de dados. Escolha a opção verdadeira:
a) Optar pelos fluorocromos que possam ser excitados pelo mesmo laser
b) Escolher os fluorocromos mais brilhantes, avaliar a sobreposição de espetros e
reservar o fluorocromo mais brilhante para os anticorpos com expressão mais forte
c) Utilizar o menor número possível de fluorocromos
d) Escolher os fluorocromos mais brilhantes, avaliar a sobreposição de espetros e
reservar o fluorocromo mais brilhante para os anticorpos com expressão mais fraca
e) Optar sempre pelos fluorocromos que possam ser excitados por lasers diferentes
a) Controlo biológico
b) Compensação
c) Spillover
d) gating
e) População CD45RA+
Formação Contínua Online 2018 – Curso 1 – Citometria de Fluxo: Fundamentos e Aplicações
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6 – As células CD3+CD4+ presentes na gate, e de acordo com os marcadores presentes
são:
a) Leucémicas
b) Näive
c) Memória e Näive
d) Não é possível caracterizar as células na gate
e) Nenhuma das anteriores
a) Hipogamabulinemia
b) Linfopenia B grave
c) Infeções recorrentes
d) Todas as anteriores
e) Nenhuma das anteriores
a) Ausência de linfócitos T
b) Ausência de linfócitos B e NK
c) Ausência de linfócitos B
d) Défice de linfócitos T e NK
e) Ausência de linfócitos B e T
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9 - Na construção da estratégia de análise é comum a utilização inicial de um dot plot
FSC/SSC porque:
a) Ajustar o FSC e SSC para que as células apareçam em escala, ajustar a sensibilidade
dos PMTs para as fluorescências e estabelecer uma fronteira entre negativo e
intensidades de fluorescências
b) Ajustar o FSC e FL1 para que as células apareçam em escala, ajustar a sensibilidade
dos PMTs para as fluorescências e estabelecer uma fronteira entre negativo e
intensidades de fluorescências
c) Ajustar o FL1 e FL2 para que as células apareçam em escala, ajustar a sensibilidade
dos PMTs para as fluorescências e estabelecer uma fronteira entre negativo e
intensidades de fluorescências
d) Só deve ser utilizado quando existe uma clara separação entre população positiva
da negativa
e) Ajustar o FSC e SSC para que as células apareçam em escala
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