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FORMAÇÃO CONTÍNUA ONLINE 2018

CURSO 1

Citometria de Fluxo: Fundamentos e Aplicações

Mestre Emília Maria dos Santos Cardoso


Especialista em Análises Clínicas
Instituto de Investigação e Inovação em Saúde I3S
Universidade do Porto

REVISÃO
Comissão de Formação do Colégio de Biologia Humana e Saúde da Ordem dos
Biólogos
Dra. Tânia Lapão – Especialista em Análises Clínicas
Dr. Jorge Reis – Especialista em Análises Clínicas
Dr. Jorge Pinheiro – Especialista em Análises Clínicas

Comissão de Formação do Colégio de Biologia Humana e Saúde (CF CBHS)


Sede Nacional – Rua Cidade de Rabat, n.º 38 – r/c | 1500-164 Lisboa Tel.: +351 220 169 962 / +351 924 172 830
Site: www.ordembiologos.pt Correio eletrónico: formacao.cbhs@ordembiologos.pt
Citometria de Fluxo: Fundamentos e Aplicações

Índice
Objetivos Específicos ..................................................................................................................... 4
Resumo.......................................................................................................................................... 4
1. Introdução ................................................................................................................................. 5
1.1 História da Citometria de Fluxo........................................................................................... 6
2. Sistemas de um Citómetro de Fluxo ......................................................................................... 9
2.1 Sistema de Fluídos............................................................................................................. 10
2.2 Sistema Ótico e Deteção de Sinal...................................................................................... 11
2.3 Processamento do Sinal e Análise de Dados..................................................................... 15
2.4 Princípios da Fluorescência ............................................................................................... 18
3. Controlo de Qualidade ............................................................................................................ 21
3.1 Controlo Negativo ............................................................................................................. 21
3.2 Controlo para Compensações ........................................................................................... 22
3.3 Controlo Isotipo................................................................................................................. 24
3.4 Controlo de Fluorescência Menos Um (Fluorescence Minus One – FMO) ....................... 25
3.5 Controlo Biológico ............................................................................................................. 26
3.6 Controlo Externo da Qualidade ......................................................................................... 26
4. Aplicações Gerais da Citometria de Fluxo ............................................................................... 27
4.1 Análise do Ciclo Celular ..................................................................................................... 27
4.2 Apoptose ........................................................................................................................... 28
4.3 Células T Reguladoras........................................................................................................ 29
4.4 Separador Celular .............................................................................................................. 30
5. Aplicação da Citometria de Fluxo em Hematologia ............................................................... 31
5.1 Análise Eritrocitária ........................................................................................................... 31
5.2 Hemoglobinúria Paroxística Noturna (HPN) ..................................................................... 32
5.3 Imunofenotipagem de Leucemias Agudas ........................................................................ 33
5.4 Doença Residual Mínima (DRM) ....................................................................................... 35

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6. Citometria de Fluxo no Diagnóstico de Imunodeficiências (ID) .............................................. 36
6.1 Infeção por HIV.................................................................................................................. 36
6.2 Imunodeficiências Primárias (IDP) .................................................................................... 37
6.2.1 Estudos de Função dos Linfócitos .................................................................................. 38
6.2.2 Agamaglobulinemia ligada ao X ..................................................................................... 39
6.2.3 Doença Granulomatosa Crónica (DGC) .......................................................................... 39
6.2.4 Estudos de Função dos Granulócitos e Monócitos – Explosão Oxidativa ...................... 40
6.2.5 Análise de Citocinas Intracelulares em Linfócitos ou Monócitos................................... 40
7. Conclusão ................................................................................................................................ 41
8. Bibliografia .............................................................................................................................. 42
9. Avaliação Final ......................................................................................................................... 45

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Objetivos Específicos

Compreender os sistemas constituintes da tecnologia de citometria de fluxo.


Reconhecer alguns pontos importantes para a correta aplicação da mesma. Rever
algumas aplicações da citometria de fluxo no Laboratório de Patologia Clínica,
nomeadamente em Hematologia e Imunologia na área das Imunodeficiências.

Resumo

A citometria de fluxo (CF) é uma técnica de medição, altamente sofisticada e


multiparamétrica de propriedades celulares, que permite obter informação relativa ao
tamanho, granulosidade, capacidade funcional, perfil fenotípico, etc.
A medição de tais parâmetros depende de algumas características de dispersão da luz
e da utilização de fluorocromos conjugados com anticorpos monoclonais (mAbs), que
estabelecem ligações com moléculas extracelulares ou/e intracelulares.
Estas características técnicas fazem com que a citometria de fluxo seja uma
ferramenta com um grande poder de detalhe na análise de populações mistas ou
raras. Esta técnica permite obter grandes quantidades de informação com um
excelente tempo de resposta.
Desde há muitos anos que a citometria de fluxo multiparamétrica (multiparametric
flow cytometry - MFC), fruto da sua capacidade de estudar simultaneamente vários
parâmetros numa única célula, se tem afirmado como uma ferramenta de utilidade
reconhecida na área clínica, designadamente no diagnóstico, prognóstico e
monitorização terapêutica de hemopatias malignas, na monitorização da infeção pelo
vírus da imunodeficiência humana (human immunodeficiency virus - HIV), na
investigação clínica e fundamental.

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1. Introdução

A citometria de fluxo é uma técnica qualitativa e quantitativa de análise celular,


desenvolvida na década de 70. Permite avaliar, em simultâneo, várias características
biofísicas e bioquímicas de células em suspensão, orientadas em fluxo laminar e
intercetadas por um feixe de luz.
O princípio básico da citometria de fluxo consiste em fazer passar as partículas,
presentes numa suspensão, de forma alinhada por um feixe de luz com comprimento
de onda constante, geralmente um laser. As células ao serem intercetadas pelo feixe
de luz geram sinais que são captados e transformados por detetores apropriados. Os
sinais produzidos são proporcionais ao tamanho, complexidade interna e intensidade
de fluorescência relativos à célula analisada.
Em 1949 Wallace H Coulter desenvolveu um sistema com capacidade de contar células
sanguíneas. O sistema desenvolvido por Coulter baseava-se na medição da interrupção
da corrente gerada por dois elétrodos (método de impedância). A amplitude da
interrupção do sinal e o número de vezes que o sinal é interrompido são proporcionais
ao tamanho e número das células em suspensão. Este príncipio ficou conhecido como
príncipio de Coulter e tornou-se a base da tecnologia da citometria de fluxo, que é
usada nos dias de hoje para determinar parâmetros celulares de organismos vivos ou
qualquer outra partícula: microrganismos, núcleos, cromossomas, vesículas etc.
A versão mais atual da MFC é designada por fluorescence activated cell sorting (FACS),
sendo o resultado da evolução e combinação de várias tecnologias. Fornece
informações rápidas e precisas com a identificação de inúmeras características
intrínsecas e/ou extrínsecas das células, a sua separação física, sendo possível a
continuação de estudos: funcionais, cultura celular, estudos de ativação, extração de
ácidos nucléios etc.
No laboratório de Patologia Clínica a MFC veio revolucionar áreas como Hematologia e
Imunologia. É parte integrante da tecnologia dos laboratórios modernos e um
componente fundamental no diagnóstico de leucemias. A MFC inclui os procedimentos
de diagnóstico, prognóstico e monitorização de doentes.
A evolução desta tecnologia e a sua utilização em centros de investigação ou em
centros clínicos, tem sido possível devido ao desenvolvimento de novas fontes
luminosas, sondas, fluorocromos e conjugação com anticorpos monoclonais e à
evolução da eletrónica e dos computadores.

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1.1 História da Citometria de Fluxo

Até ao aparecimento da citometria de fluxo, a vizualização das células sanguíneas era


efetuada por microscopia óptica em lâminas com esfregaços corados com coloração
tipo Romanowsky ou por epifluorescência com recurso a fluorocromos. Embora os
citómetros de fluxo (equipamento que comporta a tecnologia) estivessem disponíveis
comercialmente desde o início dos anos 70, o seu uso estava restrito aos grandes
centros de investigação devido ao elevado custo e à complexidade da técnica.
Em 1953, Crosland e Taylor, baseando-se no princípio de Gucker Jr., desenvolveram
uma câmara em que as células eram injetadas no centro de um fluxo de revestimento,
o qual era atravessado por um capilar de maior diâmetro, evitando assim o
entupimento e melhorando a focagem das amostras pela fonte de luz. Essa câmara
tornou-se a referência para as câmaras de fluxo atuais. Em 1965, Katmentsky criou o
espectrofotómetro celular rápido, que usou a espectrofotometria para medir o
tamanho celular e quantificar o DNA, introduzindo, assim, a análise multiparamétrica
de luz dispersa e histogramas biparamétricos.
Em 1965, Fuwyler registou o processo de separação eletrostático (sorting), com o
auxílio tecnológico de impressora de jato de tinta. No ano de 1972, foi apresentado o
fluorescence activated cell sorting (FACS), que permitiu que as células fossem
sinalizadas com fluorocromos e classificadas eletrostaticamente (Bonner et al.).
A primeira grande aplicação clínica da citometria de fluxo surgiu aquando do
aparecimento da infeção por HIV – SIDA por todo o mundo, e com a descoberta de que
o HIV destruia, principalmente, as células T CD4+ e que a sua quantificação, no sangue
periférico, era um bom marcador para monitorizar a progressão da doença e também
para o diagnóstico.
Os anticorpos para as proteínas de membrana de CD3, CD4 e CD8 expressas pelas duas
subpopulações de células T (T helper e T citotóxicas) foram os primeiros anticorpos
monoclonais caracterizados.
A nomenclatura Cluster of Differentiation (CD) foi proposta e estabelecida no primeiro
workshop de Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA). Este
sistema tinha como objetivo a classificação de anticorpos monoclonais, gerados por
vários laboratórios contra epítopos na superfície de moléculas dos leucócitos. Essa
mesma classificação foi expandida para outras células, existindo mais de 320 clusters
(CDs) e subclusters.

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O sistema CD é normalmente usado como marcador celular e permite caracterizar as
células de acordo com as moléculas que estão presentes na sua superfície, sendo
utilizado para associar as células com as funções, propriedades imunes e estádios de
maturação (Tabela 1).

Tabela 1 – Relação entre alguns antigénios CD, células e funções (adaptado de abcam, 2013).

Antigénio Células Função


CD
CD2 Thymocytes, natural killer cells, T and B Adhesion between T cells and other cell types and T
cells cell activation

CD3 Mature T cells and thymocytes T cell activation signaling and regulation of T cell
receptor (TCR) expression

CD4 Thymocyte subsets, T helper cells, T cell activation, thymic differentiation and receptor
regulatory T cells, monocytes and for HIV
macrophages
CD5 Thymocytes, T and B cell subsets and B-cell Regulates T cell: B cell interactions. Interacts with
chronic lymphocytic leukemia cells CD72

CD7 Thymocytes, T cells, natural killer cells and T-cell costimulation. Interacts with Secreted and
pluripotent hematopoietic stem cells transmembrane protein 1 (SECTM1)

CD8 Thymocyte subsets and cytotoxic T cells Co-receptor for MHC class I molecules

CD10 B and T cell precursors, fibroblasts, neurons Peptidase, regulates B cell growth
and bone marrow stromal cells

CD11b Granulocytes, monocytes, natural killer Cell adhesion, apoptosis and chemotaxis
cells, T and B cells and dendritic cells

CD13 Granulocytes, monocytes (+precursors), Zinc binding metalloproteinase


endothelial cells and epithelial cells

CD14 Monocytes, macrophages (myelomoncytic Receptor for complex of lipopolysaccharide (LPS)


cells), Langerhans cells and granulocytes and LPS binding protein (LBP)

CD15 Granulocytes, monocytes, neutrophils and Cell adhesion. Mediates phagocytosis and
eosinophils chemotaxis

CD16 Neutrophils, natural killer cells and Low affinity Fc receptor. Mediates phagocytosis and
macrophages antibody dependent cell mediated cytotoxicity
(ADCC)
CD19 B cells Regulates B cell development, activation and
differentiation. Signal transduction

CD20 T and B cell subsets B cell activation and proliferation

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CD22 Mature B cells B cell adhesion and signal transduction

CD24 B cells, granulocytes, epithelial cells and Regulation of B cell proliferation and differentiation.
monocytes

CD25 Activated T and B cells, some thymocytes, Receptor for IL-2


pre B cells, regulatory T cells, and
oligodendrocytes
CD27 T cells, medullary thymocytes, B cell subsets Costimulation of B and T cell activation
and natural killer cells

CD33 Monocytes, granulocytes, mast cells and lectin activity and adhesion. A receptor that inhibits
myeloid progenitors the proliferation of normal and leukemic myeloid
cells
CD34 Hematopoietic stem cells and progenitors Cell adhesion (via L-selectin). Possible role in early
and capillary endothelial cells hematopoiesis by mediating the attachment of stem
cells to the bone marrow extracellular matrix or
directly to stromal cells
CD41 Platelets and megakaryocytes Platelet activation and aggregation

CD42 Platelets and megakaryocytes Platelet adhesion and aggregation

CD45 Hematopoietic cells (not erythrocytes and Critical for B and T cell receptor mediated activation.
platelets) Also required for thymic selection

CD45RO Activated T cell subsets, memory B and T Critical for B and T cell receptor mediated activation
cell subsets, monocytes, macrophages,
granulocytes, cortical thymocytes and
dendritic cell subsets
CD45RA B and naïve T cell subsets, monocytes and Critical for B and T cell receptor mediated activation.
medullary thymocytes Also required for thymic selection

CD55 Epithelial cells and all cells that are in close Regulates complement activation. Ligand or
contact with plasma complement proteins protective molecule in fertilization. Signal
transduction
CD56 Neural tissues, natural killer cells, T cell Homophilic and heterophilic adhesion
subsets, small cell lung carcinoma

CD59 Hematopoietic and non-hematopoietic cells Prevents complement polymerization. Protects cells
from complement mediated lysis

CD61 With CD41 on platelets, with CD51 on Mediates cell adhesion to diverse matrix proteins
macrophages, endothelial cells, fibroblasts,
megakaryocytes, osteoclasts, mast cells and
macrophages
CD64 Monocytes and macrophages Binds to the Fc region of IgG with high affinity

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CD69 Activated leukocytes, natural killer cells, Signal transmitting receptor. Involved in early
thymocyte subsets, platelets, Langerhans events of T cell, natural killer cell, monocyte and
cells and activated macrophages platelet activation
CD71 Proliferating cells, reticulcytes, erythroid Controls iron uptake during cell proliferation
precursors and activated leukocytes

CD79a B cells Subunit of B cell antigen receptor

CD117 Hematopoietic stem cells and progenitors. Crucial for development of gonadal and pigment
stem cells

CD127 B cell precursors, mature T cells, Receptor for IL-7


thymocytes and monocytes

Mais recentemente, surgiu a citometria de massa, na qual as células são também


marcadas com anticorpos conjugados com isótopos de metais raros e detetados por
espectrómetros de massa aliados ao citómetro. A capacidade multiparamétrica da
citometria de massa é maior que a de fluxo, com 44 parâmetros mensuráveis já
descritos e com a perspetiva de análise de 100, num futuro próximo.

2. Sistemas de um Citómetro de Fluxo

Um citómetro de fluxo não é mais que um contador de fotões emitidos pelos


fluorocromos ou moléculas fluorescentes presentes em alvos de interesse. Para que
isso seja possível, é necessária a coordenação de 3 sistemas dentro do citómetro: o
sistema de fluídos - responsável por transportar as células em fluxo laminar até ao
ponto de intercetação com o laser; o sistema ótico - formado por lasers
monocromáticos, filtros e espelhos que direcionam os sinais luminosos para detetores
apropriados; e sistema eletrónico - que converte os sinais luminosos em sinais
eletrónicos proporcionais, chamados pulsos de voltagem, que são armazenados e
posteriormente processados pelo computador.

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2.1 Sistema de Fluídos

Quando a amostra em suspensão entra no citómetro, as partículas estão


aleatoriamente distribuídas no espaço tridimensional. Esta suspensão é injetada
diretamente para o centro do citómetro - câmara de fluxo.

A câmara de fluxo, constituida por uma cuvete de quartzo preenchida por uma solução
salina (fluído de revestimento ou sheath fluid), apresenta pressão inferior à pressão da
suspensão celular. A diferença de pressões e o formato cónico da câmara de fluxo
(flow cell) criam um fluxo laminar (focagem hidrodinâmica), forçando as células a
passar individualmente pelo centro da câmara de fluxo, sendo intercetadas pelo laser
que incide perpendicularmente sobre elas (ponto de interrogação) (Figura 1).

Figura 1 - O sistema de fluídos consiste num canal central onde a amostra é injetada. A suspensão celular está
imersa num líquido envolvente - sheath fluid, que cria uma pressão positiva e faz com que as partículas sejam
forçadas a moverem-se, em fila, no centro do fluído (sample core) por um processo designado por focagem
hidrodinâmica. A pressão da amostra deve ser sempre superior à pressão do sheath fluid, podendo ser ajustada
para aumentar ou diminuir a largura da passagem da amostra. Quando a pressão da amostra é baixa, o fluxo de
passagem é estreito e o nº de eventos é reduzido. Se a pressão for elevada, o fluxo de eventos é superior. Se o

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sample core for demasiado âmplo algumas células podem passar pelo laser fora do centro e intercetá-lo a uma
intensidade de excitação inferior à óptima, tendo como consequência uma redução de fiabilidade de resultados
(adaptado de Cossarizza et al., 2017).

A velocidade de injeção da amostra pode ser manipulada pelo operador, tendo em


consideração o objetivo da análise. Por exemplo, fluxos altos são comuns em medições
qualitativas como a imunofenotipagem. Em contrapartida, análises que necessitam de
maior resolução, como a análise de conteúdo de DNA, devem utilizar velocidades
menores.
Pode ocorrer a chamada coincidência aquando da interseção da partícula com o laser,
que corresponde à intercecão de mais de uma partícula ao mesmo tempo. Este
fenómeno ocorre devido a elevadas concentrações celulares na suspensão ou à
formação de agregados, que não podem ser resolvidos como uma única partícula no
tempo. O operador deve assegurar-se de que este sistema se encontra livre de bolhas
de ar ou resíduos e que se encontra corretamente pressurizado.

2.2 Sistema Ótico e Deteção de Sinal

Os lasers são as fontes luminosas de eleição, porque emitem luz com um comprimento
de onda estreito e constante, mantendo um espetro muito puro. Um grande número
de citómetros utilizam apenas um único laser (azul 488nm). No entanto, alguns
sistemas suportam já dois ou mais lasers, como seja: laser vermelho 603nm e/ou laser
violeta 405nm.
O sistema ótico é constituido por: fonte luminosa, lentes que captam a luz emitida
resultante da interação entre partícula e o laser; cabos de fibra ótica; sistema de
espelhos e filtros (que separam e direcionam comprimentos de onda específicos da luz
captada) e detetores específicos (Figura 2).

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Figura 2 - Esquema do layout do citómetro FACS Calibur da Becton, Dickinson and Company (BD), com a capacidade
de detetar 4 cores. É constituido por dois lasers (azul de 488nm e o vermelho de 635 nm), uma câmara de fluxo e
uma combinação de lentes, filtros shortpass (SP) e longpass (LP), espelhos dicróicos (DM), detetores de dispersão e
4 detetores de fluorescência (FL1, FL2, FL3 e FL4) (adaptado de Virgo et al., 2012).

Os parâmetros medidos por este sistema podem ser detetados em canais óticos ou em
canais de fluorescência. Os canais óticos determinam características morfológicas da
célula, como tamanho e complexidade interna (através da dispersão da luz observada
durante a interação física do laser com a célula).
A luz difratada é captada por lentes e direcionada para um detetor de fotodiodo que
capta a intensidade da luz dispersa frontalmente, forward-scatter (FSC), e fornece
informações sobre o tamanho da célula.
A luz refratada e refletida é captada por lentes localizadas perpendicularmente à fonte
luminosa e transmitem o sinal para um tipo de detetor muito sensível, chamado de
photomultiplier tubes (PMTs), que capta a intensidade da luz dispersa lateralmente
(90º), designado de side-scatter (SSC), que fornece informações sobre a complexidade
e granulosidade interna da célula.
É necessário utilizar um detetor muito sensível para SSC, porque a dispersão lateral
corresponde a cerca de 10% do sinal de luz emitida (Figura 3).

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Figura 3 – Análise das características físicas da célula: a luz frontal (FSC) é proporcional ao tamanho celular e a luz
lateral (SSC) fornece informação sobre a complexidade interna ou granulosidade da célula (adaptado de Adan et al.,
2015).

A utilização de apenas estes dois parâmetros permite identificar subpopulações


celulares numa suspensão heterogénea. Podemos facilmente distinguir 3 populações
com base apenas no tamanho e complexidade (Figura 4).

Figura 4 - As células ou outras partículas quando iluminadas pelo laser provocam a dispersão da luz. São medidos
dois parâmetros de dispersão: a dispersão frontal (FSC) e a dispersão lateral (SSC). O FSC é uma medida do tamanho
da célula, ou seja, os linfócitos são mais pequenos que os monócitos e granulócitos. O SSC é medido num ângulo de
90º em relação ao FSC, sendo uma medição da granulosidade e complexidade nuclear. Por este motivo, os
monócitos e granulócitos apresentam um SSC maior que dos linfócitos. No entanto, estes parâmetros devem ser
utilizados com algum cuidado: as células pilosas, características de um tipo da leucemia de células pilosas ou
cabeludas, aparecem maiores que os linfócitos normais, isto porque as vilosidades (projeções citoplasmáticas)
destes linfócitos aumentam o FSC (adaptado de Rahman, 2014).

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Ao serem excitados pelo laser, fluorocromos ou compostos celulares com
fluorescência intrínseca, absorvem energia que emitem sob a forma de fluorescência
por emissão de um fotão (com maior comprimento de onda e menor energia).
A fluorescência, assim como a dispersão lateral da luz, é detetada pelos PMTs, sendo a
sua intensidade proporcional à quantidade de marcadores presentes na célula.
A fluorescência é também selecionada e direcionada por filtros óticos altamente
específicos para os PMTs que captam e convertem os sinais luminosos em pulsos
eléctricos. Os citómetros de fluxo utilizam diferentes tipos de filtros e espelhos que
permitem a passagem de comprimentos de onda específicos tornando possível a
deteção simultânea de diferentes fluorescências: os filtros do tipo longpass (LP)
transmitem comprimentos de onda iguais ou maiores ao especificado; enquanto que
os filtros shortpass (SP) transmitem comprimentos de onda iguais ou menores; os
filtros do tipo bandpass (BP) transmitem apenas uma faixa de comprimento de onda
sendo, desta forma, mais específicos.
A configuração de um citómetro pode ainda apresentar espelhos dicróicos, que
podem ser filtros longpass ou shortpass, colocados num ângulo de 45º que divide os
comprimentos de onda de luz em duas direcções (Figura 5).

Figura 5 – Representação dos vários tipos de filtros e espelhos que podem fazer parte do sistema ótico de um
citómetro de fluxo (adaptado de abcam).

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2.3 Processamento do Sinal e Análise de Dados

Quando a luz atinge um PMT, uma pequena corrente (alguns microamperes) é criada.
A voltagem gerada tem uma amplitude proporcional ao número total de fotões
recebidos pelo detetor e é, então, ampliada por uma série de amplificadores (Amp)
lineares ou logarítmicos e, analogamente, transformada em sinais elétricos (5-10
voltes) por convertores digitais (ADC) (Figura 6).

Figura 6 - A fluorescência, uma vez no detetor, é convertida em electrões e o sinal é multiplicado


proporcionalmente. O sinal sai do detetor como corrente eléctrica - fotocorrente, chega ao amplificador e é
convertida em pulso de voltagem. O pulso é posteriormente transformado em número digital através dos
convertores digitais em: altura, largura e área. Finalmente estes números podem ser armazenados no computador
em forma de dados que podem ser análisados. Anatomia de um pulso: quando uma partícula inícia a passagem à
frente do laser, atinge a intensidade máxima ou altura quando atinge o centro do mesmo, onde o feixe e a
intensidade do sinal são mais brilhantes. O pico da intensidade ou altura do pulso são medidos nesse momento,
como pode ser observado na sequência de imagens de A a E (adaptado de Bushnell, 2015).

A medição de cada detetor corresponde a um parâmetro, por exemplo: FSC, SSC ou


fluorescência. Os dados obtidos para cada parâmetro são designados de eventos e
correspondem ao número de células ou partículas que apresentam aquela
característica física ou marcador de interesse. A análise gráfica pode ser interpretada
em uma, duas ou três dimensões (Figura 7).

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Figura 7 - Possíveis representações gráficas dos parâmetros FSC e SSC. Cada evento é colocado no canal
correspondente ao valor do sinal: sinais brilhantes são visualizados em canais mais à direita em relação a sinais
menos intensos. Os dados podem ser representados em gráficos biparamétricos (plots): um parâmetro no eixo do x
e o outro no y, sendo que a contagem surge como densidade ou contorno. Um dot plot mostra 2 parâmetros e cada
dot representa um evento. Em contrapartida, um density plot representa os dados como frequência. No color dot
plot a cor é utilizada para identificar diferentes frequências de eventos. O contour plot é igual ao density plot mas
as células são apresentadas em linhas. Um histograma é a representação gráfica de apenas um parâmetro, onde no
eixo do x está representado o valor do sinal em canais numéricos e no do y estão representados o nº de eventos por
canal numérico (adaptado de Betters, 2015).

A estratégia de análise de dados é a fase mais crítica de uma experiência biológica. A


estratégia mais comum inicia-se com a representação gráfica de FSC e SSC, que
permite a identificação da população de interesse no estudo.
Uma população ou subpopulação pode ser definida recorrendo a um processo
designado de gating: região numérica ou gráfica que pode ser utilizada para definir
características das partículas para análise posterior, limitando o número de eventos
adquiridos com determinadas características.
Desta forma, é possível direcionar o estudo apenas para um grupo ou subgrupo de
células ou outras partículas em análise. Em muitos casos, o estudo da expressão de um
antigénio é apenas relevante num tipo de células (como por exemplo em linfócitos ou
plaquetas). Nestas situações, a análise de todas as células adquiridas não teria
qualquer interesse para o estudo, dificultando a interpretação de resultados (Figura 8).

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Figura 8 – A combinação mais frequente na criação de gates é a estruturação sequencial: os leucócitos do sangue
periférico foram marcados com CD20-FITC (marcador para as células B), CD2-PE (marcador das células T) e CD8-ECD
(marcador das células T citotóxicas). A gate designada de lymphs foi desenhada à volta dos linfócitos de acordo com
o seu FSC e SSC. Esta primeira gate foi utilizada para criar o segundo plot de fluorescência CD20/CD2, para limitar a
análise apenas aos linfócitos T (CD2+CD20-). No terceiro plot – CD8/CD2, já são apenas vizualizadas estas mesmas
células, sendo possível observar uma subpopulação de células T CD2+CD8+ - linfócitos T citotóxicos (adaptado de
Ormenod, 2008).

Como já foi referido anteriormente, a representação gráfica de FSC/SSC permite obter


uma aproximação à morfologia em termos de tamanho e estrutura das células. Uma
segunda estratégia de gating pode ser utilizada – CD45/SSC (CD45 marcador pan-
leucocitário): os blastos apresentam uma expressão fraca deste marcador
comparativamente aos restantes leucócitos, utilizando o dot plot FSC/SSC seria quase
impossível a sua separação da população dos linfócitos.
Da mesma forma, os grandes linfócitos, que podem ser observados em doentes
infetados com HIV, saiem “fora” da gate normal dos linfócitos, mas apresentam a
mesma intensidade de expressão do marcador CD45. Ou seja, a criação da estratégia
de plots e gating a utilizar deve basear-se no conhecimento prévio das células que
pretendemos estudar.
Outra estratégia é o gating reverso ou backgating. Quando não se conhece onde as
células de interesse se encontram no plot FSC/SSC, recorre-se em primeiro lugar ao
gating no parâmetro de fluorescência para o antigénio de estudo, traduzindo-se, em
seguida, para o plot FSC/SSC.

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Este processo permite caracterizar as células alvo em termos de tamanho e
complexidade e afinar a estratégia de análise (Figura 9).

Figura 9 – É prática corrente a estratégia de gates desenhadas a partir da população selecionada no plot FSC/SSC.
No entanto, e em alguns casos, não é claro onde essa região deve ser criada: células tumorais humanas de
carcinoma de ovário foram adicionadas a células de sangue periférico e marcadas com Ber-EP4-FITC (marcador de
células de ovário). (B) No plot Ber-EP4/SSC foi desenhada uma primeira gate a delimitar as células Ber-EP4 positivas,
que foi utilizada como referência para evidênciar essa mesma subpopulação no plot FCS/SSC (A) e (C). Os leucócitos
foram identificados baseados no seu side scatter e na falta de expressão do marcador Ber-EP4-FITC, servindo como
controlo negativo (adaptado de Ormenod, 2008).

2.4 Princípios da Fluorescência

O número de componentes fluorescentes de uma célula é limitado mas de extrema


importância para a obtenção de informação sobre a caracterização celular. Por este
motivo, as células são normalmente marcadas com fluorocromos, permitindo
caracterizar componentes que de outra forma seriam “invisíveis” na análise
citométrica.

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As sondas fluorescentes são usadas numa grande variedade de aplicações, desde:
identificação de subpopulações, identificação de recetores de superfície ou organelos
intracelulares, imunofenotipagem, determinação do conteúdo em DNA, medições de
actividades enzimáticas, estudos de viabilidade, etc.
Os fluorocromos são moléculas capazes de aceitar (absorver) energia luminosa de um
determinado comprimento de onda e re-emitir luz com menor energia e maior
comprimento de onda (Lei de Stokes), estes dois processos são designados de
excitação e emissão, respectivamente. Todos os fluorocromos apresentados na Figura
10 são excitados pelo laser azul 488 nm, mas apresentam diferenças nos espetros de
emissão. Sendo assim, é possível utilizar mais do que um fluorocromo em simultâneo
na marcação das células, permitindo obter informação sobre a co-expressão de vários
marcadores na mesma célula.

Figura 10 - Espetros de emissão de alguns fluorocromos mais utilizados em citometria de fluxo. Todos são
excitados pelo mesmo laser azul 488nm mas apresentam espetros de emissão diferentes (adaptado de Bushnell,
2015).

A escolha dos fluorocromos é um ponto importante e a sua combinação num painel


depende de alguns fatores: o tipo, número de lasers e detetores ditam se o sistema
ótico consegue excitar um determinado fluorocromo e captar a fluorescência
correspondente.
O layout do sistema ótico também afeta a eficiência na deteção de um determinado
fluorocromo, bem como os settings do citómetro, incluindo as voltagens aplicadas aos
detetores.

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Desta forma, e para além das considerações anteriores, existem algumas regras
básicas para a escolha dos fluorocromos e as suas combinações: devemos optar pelos
fluorocromos mais brilhante (de acordo com o stain index é possível comparar o brilho
relativo entre fluorocromos, como pode ser avaliado na Tabela 2); minimizar o
potencial de sobreposição dos espetros ou spillover entre fluorocromos; e reservar os
fluorocromos mais brilhantes para os anticorpos com expressão celular mais fraca.

Tabela 2 – stain Index de alguns fluorocromos com muita expressão em citometria de fluxo. O stain Index é definido
como D/W, onde D é a diferença entre a população negativa e positiva, e W é 2SD da população negativa (adaptado
de Maecker et al., 2012).

A lista de fluorocromos disponíveis tem crescido com o aparecimento de novas formas


de os conjugar e de novos anticorpos monoclonais. Alguns dos flurocromos mais
utilizados em análise citométrica encontram-se, normalmente, conjugados com
anticorpos monoclonais e são eles: a Fluoresceína (FITC), Ficoeritrina (PE) e
Aloficocianina (APC). O FITC apresenta várias conjugações com diferentes anticorpos
disponíveis no mercado, no entanto, a sua fluorescência é sensível ao pH e sujeita a
fotodegradação. Para resolver este problema foram desenvolvidos derivados de FITC -
AlexaTM, com maior fotoestabilidade.
O desenvolvimento de fluorocromos Tandem, que aplicam o princípio de fluorescence
resonance transfer (FRET) entre um fluorocromo dador e um segundo aceitador, tem
permitido que mais fluorocromos possam ser excitados pelo mesmo laser e obter
espetros de emissão diferenciados (PE-Cy5, APC-Cy7, etc).

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Mais recentemente, têm sido desenvolvidas nanopartículas com propriedades de
semicondutores (Quantum Dots). Estas partículas são muito estáveis e apresentam
espetros de emissão muito estreitos e diferenciados, úteis em protocolos
multiparamétricos.

3. Controlo de Qualidade

Um dos objetivos frequentes de uma análise citométrica consiste em classificar as


células como negativas ou positivas relativamente a um marcador, ou determinar a
frequência das mesmas. Para tal, é necessária uma boa reprodutibilidade do citómetro
e o uso adequado de controlos para análise e interpretação dos dados.
O uso de controlos é essencial em MFC, pois fornecem pontos de referência para a
interpretação das amostras em análise e por esta razão, qualquer experiência deve
incluir pelo menos 3 tipos de controlos: controlo do equipamento (settings), controlos
de especificidade ou gating e controlos biológicos.
Os controlos do equipamento ou dos settings são utilizados para definir corretamente
ou verificar o alinhamento óptico, voltagens, ganhos e compensações dos PMTs; Os
controlos de especificidade ou gating são usados para verificar ligações específicas e
não específicas. São frequentemente utilizados para definir gates ou regiões gráficas
usadas para classificar as células e para definir a fronteira entre o sinal negativo ou
positivo para um marcador. Os controlos biológicos fornecem informação relevante
para comparação entre condições. Por exemplo, entre amostras não estimuladas ou
amostras de dadores saudáveis.

3.1 Controlo Negativo

Qualquer tipo de estratégia multiparamétrica, onde possa ocorrer sobreposição de


espetros de emissão, deve incluir 2 elementos: controlo negativo para ajuste de
voltagens e controlos para compensações, que determinem o grau de sobreposição
dos espetros dos fluorocromos.
O controlo negativo corresponde à suspensão das células ou partículas que não
reagiram com nenhum anticorpo/fluorocromo, permitindo estabelecer o ponto de
referência.

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O FSC e SSC são usualmente ajustados para que as células apareçam em escala.
Conjuntamente, a sensibilidade dos PMTs é verificada para que as células apareçam
com fluorescências negativas, mas dentro da escala. Este controlo negativo permite,
também, ao operador avaliar a auto-fluorescência natural das células e estabelecer
uma fronteira entre o negativo e intensidades de fluorescência superiores.
A auto-fluorescência é a fluorescência natural que ocorre na célula devido a alguns
componentes da mesma: compostos cíclicos como NADP(H), colagéneo, riboflavina,
aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano, fenilalanina). Estes compostos absorvem
luz entre UV até azul (355-488 nm) e emitem no azul a verde (350-550 nm). As
consequências da auto-fluorescência podem ser a perda de resolução e sensibilidade
do sinal nos intervalos de comprimentos de onda referidos.

3.2 Controlo para Compensações

A sobreposição de espetros de emissão (spillover) é talvez a maior fonte de erro na


análise de dados.
Os controlos para compensações são usados quando há a necessidade de introduzir
vários fluorocromos no mesmo painel. Deve proceder-se ao ajuste de possíveis
sobreposições de espetros de emissão, mensuráveis em mais do que um detetor. Este
processo é crítico para uma correta identificação das populações pois erros de
compensação para um fluorocromo podem ser propagados para outro detetor,
resultando em populações positivas “virtuais” e percentagens erradas devido a um
gating incorreto.
Os espetros de emissão são amplos, por este motivo, é possível que a mesma
fluorescência seja captada por mais que um detetor e não apenas pelo detetor
específico. Para garantir que o comprimento de onda detetado corresponde
unicamente a um fluorocromo específico, é necessário compensar a sobreposição de
espetros dos restantes fluorocromos (Figura 11 (A)).
Ao fazer isso, somos capazes de subtrair eletronicamente a sobreposição de sinal dos
outros detetores. Ou seja, o processo de compensação permite distinguir células que
são verdadeiramente positivas para um determinado fluorocromo, daquelas que
parecem ser positivas devido à sobreposição (Figura 11 e 12).

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Figura 11 – Spillover e compensação: (A) Espetros de emissão dos fluorocromos PerCP-Cy5.5 e PE-Cy7. (B) Linfócitos
do sangue periférico marcados com CD4-PerCP-Cy5.5: o sinal do fluorocromo PerCPCy5.5 entra no detetor PE-Cy7,
sem compensação aplicada (esquerda), e com compensação aplicada (direita) (adaptado Cossarizza et al., 2017).

Figura 12 - Sobreposição de espetros e compensação de fluorescência. (a) Mostra uma correta aplicação de
compensação em células marcadas com FITC no detetor FL1. A imagem (b) exemplifica um caso de compensação
excessiva, onde as células aparecem compactadas no eixo, sendo difíceis de visualizar. (c) Mostra a fluorescência
específica do detetor FL1 a ser captada no detetor FL2 (adaptado de Virgo et al., 2012).

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3.3 Controlo Isotipo

O controlo isotipo tem uma longa história em citometria de fluxo, sendo definido
como a quantidade mínima ou irrelevante de anticorpo (Ac) da mesma classe da
imunoglobulina (Ig) do Ac alvo utilizado no painel em MFC. Funciona como controlo
negativo, revelando a fluorescência basal emitida pela célula alvo marcada com
anticorpo não específico a nenhuma proteína desta célula. Desta forma, a principal
função do controlo isotipo é permitir, padronizar o limite acima do qual os sinais de
fluorescência serão interpretados como positivos ou verdadeiros e não apenas
"ligações não específicas".
É de realçar que o controlo isotipo não é um controlo negativo perfeito, devido à
variabilidade durante a purificação do Ac e da conjugação dos fluorocromos entre os
diferentes lotes e fabricantes.
Durante a pesquisa de antígeno expresso com baixa intensidade, em que não há clara
separação entre população positiva e negativa, o controlo isotipo pode ser bastante
válido. Apesar de não garantir a estimativa exata da percentagem de células positivas,
contribui para estabelecer que a população positiva realmente expressa o antigénio
pesquisado.
Da mesma forma, na marcação intracelular é apropriado o uso de controlo isotipo para
monitorizar os efeitos do procedimento de fixação, permeabilização e lavagem sobre a
auto-fluorescência e ligações de anticorpos não específicas.
Em resumo, tradicionalmente, o controlo isotipo é usado para estimar o número de
células que reagem de forma não específica com o anticorpo investigado.
Para alguns autores, a sua utilização pode ser preterida devido à presença de um
controlo negativo, o que não é incorreto quando a população positiva de interesse é
claramente separada da negativa. Neste caso, a população negativa pode ser usada
como fronteira entre células positivas e negativas, sem interferir na percentagem de
células positivas, além da redução de custo dos testes.

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3.4 Controlo de Fluorescência Menos Um (Fluorescence Minus One –
FMO)

Quando os anticorpos monoclonais conjugados são utilizados nas concentrações


adequadas, tendem a apresentar baixa marcação basal. Ou seja, em experiências com
várias marcações os erros relacionados com sinal inespecífico terão origem na
sobreposição de fluorescências. Por este motivo, a utilização de controlos FMO
tornou-se uma metodologia amplamente utilizada.
Estes controlos são amostras marcadas com todos os anticorpos conjugados exceto
um. Sendo assim, uma experiência que envolva 5 fluorescências necessitara de 5
controlos FMO (Figura 13).
É importante compreender a relevância da utilização de um controlo do tipo FMO:
permite determinar os efeitos da propagação (spread) de populações de outras
marcações num determinado canal. Esta medição pode tornar-se muito importante no
desenvolvimento de novos painéis, onde a maior resolução e sensibilidade em canais
específicos se podem tornar cruciais para a obtencão de grande precisão de
resultados. No entanto, é importante reter que o facto de um controlo FMO não
conter o anticorpo no canal de interesse não fornece o grau de ligações inespecíficas
que podem estar presentes quando esse mesmo anticorpo se encontra na amostra a
analisar.

Figura 13 - Exemplo de um controlo FMO num painel com 3 fluorocromos. Os density dots evidenciam a diferença
no canal de PE entre o controlo negativo e o controlo FMO. O controlo FMO permite delimitar com maior precisão a
fronteira entre a expressão negativa e positiva relativamente ao sinal no canal de PE (adaptado de Bushnell, 2015).

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3.5 Controlo Biológico

O controlo biológico funciona como um controlo positivo, crucial em estudos


funcionais. Pode ser constituido por amostras previamente estimuladas com
mitógenos como sejam: Staphyloccal enterotoxin B (SEB), Phorbol 12-mynistete 13-
acetato (PMA) + ionomicina ou peptídeos com espetros de ativação mais alargados. O
objetivo deste controlo é validar os possíveis resultados negativos na amostra em
estudo, garantindo que a experiência foi realizada corretamente e que os resultados
negativos não se devem a falhas de reagentes no protocolo experimental ou falta de
viabilidade celular, mas sim a um défice real nas células em estudo.
Estudos para diagnóstico ou estadiamento de doença necessitam também de
controlos biológicos para comparação. Por exemplo, comparação de fenótipos entre
doentes e indivíduos saudáveis.

3.6 Controlo Externo da Qualidade

À medida que a citometria de fluxo se tornou uma ferramenta essencial ao diagnóstico


e monitorização de algumas patologias, tornou-se evidente a necessidade de assegurar
a exatidão de resultados. Protocolos padronizados, análise de dados intra e inter-
laboratoriais, permitem avaliar a reprodutibilidade de resultados. Programas de
controlo externo da qualidade, regulados por entidades externas, são responsáveis
pela monitorização da precisão e exatidão dos resultados emitidos pelos laboratórios
inscritos nesses mesmos programas. As amostras, que podem ser frescas ou
estabilizadas, são distribuídas regularmente e devem ser processadas como uma
amostra integrante da rotina laboratorial. Os resultados são submetidos à entidade
externa que emite um relatório referente à performance para cada participante.
Este tipo de avaliação, nacional ou internacional, regula todo o processo que vai desde
a parte técnica até ao processamento da amostra (marcação, análise de dados e
interpretação de resultados). A participação neste tipo de programas é cada vez mais
frequente, sendo em muito casos uma exigência da certificação e/ou acreditação em
Patologia Clínica (exemplos de programas são os: United Kingdom External Quality
Assessment Schemes for Leucocyte Immunophenotyping – UK-NEQAS, acreditado por
Clinical Pathology Acreditation UK Lda., e a Sociedade Ibérica de Citometria - SIC).

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4. Aplicações Gerais da Citometria de Fluxo

4.1 Análise do Ciclo Celular

A avaliação do conteúdo de DNA celular é uma das principais aplicações da citometria


de fluxo. A utilização de corantes fluorescentes (iodeto de propídeo (PI), anexina V,
etc) permitem marcar o DNA celular de forma estequiométrica, ou seja, a quantidade
de corante é diretamente proporcional à quantidade de DNA no interior da célula. Esta
relação é representada gráficamente através do histograma de DNA (Figura 14).
A análise deste gráfico permite a obtenção de 2 tipos de informação biológica: a
indicação sobre a existência, ou não, de alterações clonais no conteúdo de DNA celular
– conteúdo de DNA aneuplóide – e, por outro lado, a distribuição das populações
celulares presentes na amostra ao longo das diferentes fases do ciclo celular, tendo
especial interesse a fração de células em fase S, como indicador de proliferação
celular.

Figura 14 – Histograma de DNA (adaptado de Ormenod, 2008).

Numa população homogénea, as células em fase S são células com um conteúdo de


DNA superior ao das células em fase G1, e menor ao das células em fase G2/M.
A aneuploidia de DNA entende-se como todas as alterações quantitativas de DNA nas
células. As células denominadas aneuplóides, demonstram uma quantidade de DNA
diferente daquela que é detetada nas células normais diplóides, na mesma fase do
ciclo celular.

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A alteração pode ser por excesso ou por defeito, sendo designadas, respectivamente,
por hiperploidia ou hipoploidia de DNA. Para se avaliar o grau de alteração é utilizado
o índice de DNA. Este representa o quociente entre a quantidade de fluorescência
detetada para a moda de células patológicas nas fases G0/G1 e a moda de
fluorescência obtida para as células normais diplóides nas mesmas fases do ciclo
celular. Desta forma, quando o índice de DNA é igual a 1 é considerada diploidia de
DNA, e nos casos em que o índice é diferente de 1 considera-se aneuploidia de DNA
(superior a 1 é hiperploidia, inferior a 1 é hipoploidia).
Um conteúdo anormal em DNA, aneuplóide, pode ser determinado numa população
de células tumorais, estando associado a malignidade e a um mau prognóstico em
alguns tipos de cancro. A análise de DNA é uma aplicação importante na MFC, pois
tanto as anomalias fenotípicas como no DNA demonstraram vantagem no
conhecimento da agressividade clínica e da resposta ao tratamento, assim como na
distinção entre gamapatia monoclonal e mieloma. Por este motivo, após o diagnóstico
destas patologias é necessário o estudo do seu DNA.

4.2 Apoptose

Necrose e apoptose são as duas formas de morte celular e podem ser diferenciadas
com base nas características morfológicas, bioquímicas e moleculares de cada
processo. A necrose é um processo desordenado, que ocorre em condições
patológicas e que se caracteriza pela perda de integridade da membrana plasmática. A
apoptose é um evento programado, com a função de manter a homeostase do
organismo e que se caracteriza por manter a integridade da membrana.
Devido a uma grande diversidade de moléculas que podem ser avaliadas para
caracterizar os eventos apoptóticos, a citometria de fluxo é uma ferramenta cada vez
mais utilizada no estudo de diversas doenças associadas a este processo.
Uma das estratégias muito utilizadas é a conjugação de PI + Anexina-V (Figura 15). A
membrana plasmática integra é impermeável ao PI, e a Anexina-V tem a capacidade de
se ligar à fosfatidilserina. No processo incial de apoptose, a fosfatidilserina é
translocada para a superfície externa da membrana celular, permitindo então a ligação
da Anexina-V.

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Figura 15 - Conjugação de Anexina-V e PI para a avaliação da necrose e apoptose celular. As células necróticas são
positivas apenas para a marcação com PI, as células em apoptose inicial (ainda com a membrana integra) são
positivas apenas para Anexina-V, e as células em apoptose tardia são positivas para as duas marcações.

4.3 Células T Reguladoras

As células T reguladoras (Tregs) possuem um papel importante na modulação da


resposta imune, incluindo prevenção do desenvolvimento de patologias autoimunes,
respostas imunes em transplantes, alergias, resposta a tumores e doenças infeciosas.
As células T reguladoras naturais diferenciam-se das células T convencionais
principalmente pela expressão elevada (bright) da molécula de superfície CD25 e pela
expressão intracelular do fator de transcrição Foxp3. Além disso, expressam níveis
muito baixos (dim) ou não expressam CD127 (IL-7Rα).
Uma das estratégias para identificar esta subpopulação de linfócitos T CD4+, é a
utilização de um painel com anticorpos anti-Foxp3, anti-CD25 e anti-CD127 (Figura 16).

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a b

Figura 16 - Expressão de FoxP3 nos diferentes subgrupos de células T humanas CD4+CD127+/-. A maior
parte das células CD4+CD25+, especialmente as células com expressão forte de CD25, expressam níveis
baixos de CD127 (a). Mais importante, a análise por citometria de fluxo da expressão de FoxP3 nas
células T CD127+/- e CD127+, revelou que a maior percentagem de células T FoxP3+ são CD127+/- (b)
(adaptado de Liu, et al., 2006).

Alterações na frequência dessa população de células têm sido encontradas em


diferentes doenças de natureza autoimune.

4.4 Separador Celular

Existem citómetros especializados com capacidade de classificar ou separar


fisicamente partículas de interesse. A seriação é conseguida por vibração da corrente
de fluido por aplicação de uma frequência muito elevada – formação de gotículas com
uma partícula incorporada (idealmente). O sinal de cada partícula é analisado assim
que passam pelo feixe de laser. Se as partículas satisfizerem os critérios impostos o
equipamento induz uma carga eléctrica à gotícula com a partícula. Ao cairem, as
gotículas passam por duas placas metálicas fortemente carregadas, positivamente e
negativamente, sendo conduzidas pelas placa de polaridade oposta para um
compartimento de recolha (Figura 17).

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Figura 17 – Imagem real das placas defletoras que integram o Sorter BD FACS ARIA II, pertencente à Plataforma
Científica - Translational Cytometry, do I3S Instituto de Investigação e Inovação em Saúde.

5. Aplicação da Citometria de Fluxo em Hematologia

Muitas proteínas de superfície, glicoproteínas de eritrócitos, leucócitos e plaquetas


têm sido alvo de estudo detalhado, o que permitiu o desenvolvimento de anticorpos
monoclonais dirigidos a estas proteínas, assim como também para proteínas
intracelulares, como por exemplo, a mieloperoxidase (MPO).
A identificação e quantificação de antigénios celulares marcados com anticorpos
monoclonais e conjugados com fluorocromos – imunofenotipagem, é uma das maiores
aplicações da citometria de fluxo. A imunofenotipagem é utilizada para auxiliar no
diagnóstico de doenças hemato-oncológicas, nomeadamente linfomas e leucemias,
permitindo acompanhar a eficácia dos tratamentos clínicos.

5.1 Análise Eritrocitária

O uso da MFC na deteção e quantificação de glóbulos vermelhos fetais na corrente


sanguínea materna aumentou nos últimos anos. Se existe suspeita de hemorragia
fetomaterna, o sangue materno é analisado para verificar a presença de células
vermelhas fetais. Esta abordagem mais sensível permite distinguir as células fetais de
glóbulos vermelhos adultos que contém hemoglobina F.

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5.2 Hemoglobinúria Paroxística Noturna (HPN)

A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma doença hemolítica adquirida, de


natureza clonal, que se caracteriza por uma hipersensibilidade dos eritrócitos à lise
mediada pelo complemento. A susceptibilidade aumentada é atribuída à deficiência
parcial ou total da expressão de proteínas de membrana reguladoras da atividade lítica
do complemento, especialmente a CD55 (decay accelerating factor – DAF) e à CD59
(membrane inhibitor of reactive lysis – MIRL). Esta deficiência afeta também a série
granulócitica, monocítica e megacariocítica.
Em doentes afetados é possível identificar duas ou mais populações distintas, com
diferentes níveis de expressão dos dois marcadores (Figura 18).

Figura 18 - Diagnóstico de HPN. (A) Mostra a expressão alta de CD55 e CD59 nos glóbulos vermelhos de um
indivíduo normal. Na imagem (B) alguns clones de células estaminais produzem glóbulos vermelhos com expressão
baixa de CD55 e CD59 (adaptado de Brown et al., 2000).

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5.3 Imunofenotipagem de Leucemias Agudas

As leucemias representam um grupo heterogéneo de doenças clonais de precursores


hematopoiéticos, caracterizadas por alterações quantitativas e qualitativas. Devido à
extrema heterogeneidade das entidades englobadas sob a mesma denominação, tanto
no aspeto clínico como no comportamento biológico, é fundamental a utilização de
critérios diagnóstico precisos para a sua classificação. Recentemente, métodos mais
sofisticados (imunológicos e moleculares) redefiniram a classificação das leucemias de
acordo com a origem celular, linfóide (B ou T e maturidade celular) e mielóide, além do
tipo de anormalidade genética envolvida.
Existem 4 grandes grupos de leucemias: leucemia mielóide aguda (LMA), a leucemia
mielóide crónica (LMC), a leucemia linfóide aguda (LLA) e a leucemia linfóide crónica
(LLC).
Apesar de grande parte das leucemias ser de difícil classificação apenas por
imunofenotipagem, a MFC consegue ser muito eficiente em distinguir linhagem
miéloide da linfóide, e na diferenciação de algumas leucemias mielóides agudas, como
por exemplo a leucemia promielocitíca aguda. A MFC pode ser também aplicada na
identificação de leucemias resistentes à terapêutica: no caso de leucemia linfoblástica
aguda, onde o fenótipo se relaciona com o prognóstico.
Diferentes leucemias apresentam características muito subtis no perfil antigénico e um
diagnóstico diferenciado depende da combinação e interpretação de padrões de
anticorpos e intensidade de fluorescências. Na imunofenotipagem existem diversos
marcadores de todas as linhagens, como cCD22, cCD3, CD79a, MPO, CD10, CD2, CD5,
CD13, CD33, CD20, CD8, CD117, CD19, TdT, CD7, CD14, CD15, CD24, CD64 entre
outros.
A caracterização imunofenótipica das leucemias agudas inicia-se pela identificação da
linhagem celular.
Marcadores mielóides: MPO, CD13 e CD33;
Marcadores linfóides: CD3, CD79a, CD19 e cTdT.
Seleccionam-se os marcadores a ser utilizados de acordo com a linhagem inicialmente
identificada.
Marcadores da linhagem mielóide (Figura 19) : percursores hematopoiéticos (CD117 e
CD34); granulócitos (CD13, CD15, CD33); monócitos (CD14 e CD33); percursores
eritróides (glicoforina A); megacariócitos (CD41, CD42 e CD61);
Marcadores para caracterização da linhagem linfóide: linfócitos B (CD19, CD20, CD22 e
CD10); linfócitos T (CD2, CD3, CD5 e CD7).

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A inclusão de um maior número de marcadores aumenta a probabilidade de localizar
um clone anormal.

Figura 19 - Imunofenotipagem de leucemia mielóide aguda. O dot plot SSC/CD45 permite discriminar várias
populações de leucócitos no sangue periférico. A gate A inclui os linfócitos maduros; gate B os monócitos; gate C
granulócitos; gate D células mielóides imaturas. A população D expressa CD13 e CD34, um marcador da linhagem
mielóide e de células estaminais, respetivamente. A co-expressão, no sangue periférico, é sugestivo de leucemia
mielóide aguda (adaptado de Brown et al., 2000).

5.3.1 Caso Clínico


Criança de 4 anos de idade letárgica há 3 semanas, sem causa aparente, com petéquias
nas pernas e braços. Hemograma completo indica contagem de plaquetas baixa,
esfregaço sanguíneo mostra algumas células imaturas (blastos). A criança é
referenciada para o Serviço de Hematologia e é realizado o estudo da medula óssea: o
medulograma revela uma grande população de pequenos blastos com citoplasma
escasso. Mais amostras são utilizadas para imunofenotipagem e são conduzidos
estudos genéticos.
Os painéis de MFC foram conduzidos baseados no diagnóstico de leucemia aguda:
CD2 (pan células T) e CD7 (pan células T);
CD10 (percursor células B) e CD19 (pan células B);
CD33 (células mielóide) e CD45 (pan leucocitário);
Citoplasmático CD3 (pan células T), citoplasmático CD79a (pan células B) e
citoplasmático mieloperoxidade (pan mielóide).
As células eram positivas para CD19, CD10 e CD79a (20%), sendo os restantes
marcadores negativos. Em conjunto com o resultado morfológico, os dados são
indicativos de um diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda de percursores de
células B.

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5.4 Doença Residual Mínima (DRM)

A investigação de doença residual mínima (DRM) por citometria de fluxo é aplicada em


diversos casos onco-hematológicos, com o objetivo de detetar células cancerígenas
residuais. É definida como sendo a população de células tumorais não detetável por
métodos morfológicos. A citometria de fluxo permite detetar 1 célula leucémica em
10000 células normais (0,01%) (Figura 20).
É um importante fator de prognóstico e fornece informações sobre risco de recaída e
avaliação da terapêutica.

Figura 20 – Células da medula óssea de uma criança diagnosticada com leucemia linfoblástica aguda (LLA) e
considerada em remissão. As células mononucleadas foram separadas e marcadas com 3 anticorpos associados ao
fenótipo de leucemia: CD19/CD34/CD13 e analisadas em conjunto com o controlo isotipo. O plot CD34/CD13 foi
construido a partir da gate de células CD34+CD19+, que representam as células que fazem parte da gate definida no
plot FSC/SSC. No controlo isotipo, 62 células eram CD34+CD13+, e na amostra positiva foram quantificadas 2021
células (Adaptado de Ormenod, 2008).

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6. Citometria de Fluxo no Diagnóstico de Imunodeficiências (ID)

A integridade do sistema imunitário (SI) é essencial para a defesa contra os


microrganismos infeciosos e os seus produtos tóxicos, manutenção da integridade do
próprio e na vigilância contra células tumorais. Defeitos num ou mais componentes do
SI podem causar doenças graves, por vezes fatais, designadas por imunodeficiências
(ID). As imunodeficiências são classificadas em primárias e secundárias. As
imunodeficiências secundárias, mais comuns, resultam de agressões extrínsecas ao SI,
como a malnutrição proteica calórica, infeções, entre as quais se realça a causada pelo
HIV, neoplasias e terapêuticas imunossupressoras.

6.1 Infeção por HIV

A deteção da imunodeficiência secundária - HIV, foi a primeira grande utilização da


citometria de fluxo na clínica, promovendo a sua utilização na área da Patologia
Clínica. O vírus HIV infeta linfócitos (Helper/Inducer) via o antigénio CD4 e após
infeção, os doentes exibem um declíneo nas contagens de células T CD4+, tipicamente
durante alguns anos, até desenvolverem manifestações avançadas de
imunodeficiência. As contagens absolutas de linfócitos T CD4+ permitem tomar
decisões em relação ao tratamento com drogas retrovirais, assim como à profilaxia
para infeções oportunistas. As contagens são reavaliadas a cada 3 ou 6 meses em
doentes não tratados ou de 2 a 4 meses em doentes com tratamento instituído.
Normalmente, quando um doente inícia a terapeutica retroviral o número deste
subtipo de linfócitos aumenta, sendo que a diminuição das contagens em doentes já
em tratamento pode ser indicatico de resistência ao retroviral.
A necessidade de contagens, relativas e absolutas, de linfócitos T CD4+ reprodutíveis e
precisas contribuíram para o desenvolvimento de instrumentação e de fluorocromos
aplicáveis em MFC, possibilitando uma maior compreensão da complexidade dos
subtipos dos linfócitos. Mais recentemente, a necessidade de simplificar e diminuir
custos estimulou o aparecimento de alternativas padronizadas nesta área:
equipamentos mais pequenos que usam a tecnologia numa única plataforma para
contagens de células CD4+, com número limitado de anticorpos e estratégias de gating
– pan leucogating.

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6.2 Imunodeficiências Primárias (IDP)

Alguns indivíduos nascem com anomalias genéticas em que o SI não atua de forma
eficaz em infeções, apresentando risco aumentando de doenças autoimunes e
neoplasias. Estas condições são definidas como imunodeficiências primárias (IDP).
Atualmente, conhecem-se mais de 130 tipos de IDP e a sua classificação baseia-se na
sua caracterização fenotípica e componente principal do SI afetado. As
imunodeficiências mais graves manifestam-se em idade pediátrica, sendo mortais
senão tratadas.
Outras, mais ligeiras, são apenas detetadas em idade adulta. A grande maioria das IDP
tem um denominador comum: o aumento da susceptibilidade a infeções que se
caracterizam por ser recorrentes, graves, causadas por agentes oportunistas ou por má
resposta à terapêutica. Algumas IDP estão associadas a alterações noutros sistemas,
como seja, o endócrino, gastrointestinal, neurológico, cardiovascular, osteoarticular.
Para a avaliação de doentes com suspeita de IDP, o hemograma com contagem
diferencial de leucócitos e estudos de imunidade humoral (avaliação de componentes
solúveis do SI do sangue, tais como, imunoglobulinas, complemento, etc) são
extremamente importantes numa primeira fase. Os resultados destes estudos, em
conjunto com a história clínica, estabelecem a necessidade de uma avaliação da
imunidade celular, que tem como objetivos quantificar e caracterizar subpopulações
celulares ou analisar determinada função celular.
Quando existe suspeita de IDP, o estudo de imunofenotipagem de 1ª linha visa
enumerar as principais populações linfocitárias (Figura 21).

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Figura – 21 Análise multiparamétrica das diferentes subpopulações linfocitárias, numa amostra de sangue
periférico. Os eixos ou cursores horizontais e verticais delimitam positividade ou negatividade para o marcador. Os
marcadores utilizados foram: CD45, CD3, CD19 e CD56 (cortesia do Serviço de Imunologia do CHP, Dra. Judite
Guimarães)

6.2.1 Estudos de Função dos Linfócitos

Um grande número de IDP são caracterizadas por alterações quantitativas e/ou


funcionais dos linfócitos. Através de estudos funcionais de ativação e/ou proliferação
in vitro de linfócitos por MFC, é possível distinguir e avaliar as várias fases associadas
ao processo de ativação, permitindo, com grande valor de diagnóstico no estudo das
IDPs, caracterizar o defeito eventualmente presente. É realizada a avaliação, em
linfócitos T CD4+ e T CD8+, da expressão de marcadores de ativação precoce (CD69),
intermédia (CD25) e tardia (CD71). Adicionalmente, é conduzida a análise da
proporção de células de grande tamanho em FSC/SSC, e a proporção de células que
entraram em prolifeção (fase S ou duplicação G2), ou em apoptose (pico pré G1),
através da análise do conteúdo de DNA determinado pela incorporação de iodeto de
propídeo.

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6.2.2 Agamaglobulinemia ligada ao X

A Agamaglobulinemia ligada ao X é uma IDP com incidência de 1/50000 a 1/100000 e é


causada por um défice da tirosinocinase de Bruton ou BTK, proteína que interfere na
diferenciação da linhagem B, resultando em hipogamabulinemia e linfopenia B grave
(< 2% dos linfócitos periféricos). As primeiras manifestações surgem entre os 6 meses
e 1 ano de idade, fase em que há perda das imunoglobulinas maternas. A maioria dos
doentes apresenta infeções bacterianas recorrentes (otites, sinusites, pneumonias)
nos primeiros anos de vida.

Caso Clínico
Sexo masculino, aos 9 meses gastroenterite. Desde os 2 anos otites supuradas
recorrentes com diminuição da acuidade auditiva. Pneumonia lobar aos 4 e 4.5 anos.
Resultados Laboratoriais: Hipogamaglobulinemia – IgG 720 mg/dL (724-1591), IgA <
0,1, IgM 15 mg/dL (25-182); Ausência de isohemaglutininas (anticorpos naturais do
tipo IgM) e défice de IgG em resposta a vacinas (anti-Pneumococos e anti-toxóide
tetânico); Hemograma normal; Imunofenotipagem dos linfócitos T e NK normal,
linfócitos B (CD19) < 0,01% (16-36%), 0/mm3 (260-1510).
Para rastreio de IDP, foi estudado o irmão de 4 meses de idade, sem quaisquer
manifestações clínicas, onde foi encontrada diminuição da IgA e IgM com IgG normal, e
0,4% de linfócitos B.
Défice de produção de anticorpos + linfopenia B (< 2%) em 2 irmãos permite
diagnosticar com alta probabilidade o Défice de BTK.

6.2.3 Doença Granulomatosa Crónica (DGC)

A doença granulomatosa crónica (DGC) é uma IDP com incidência de 1:250000, mais
comumente ligada ao cromossoma X, que se caracteriza por incapacidade de formação
de produtos reativos de oxigénio pelas células fagocíticas (neutrófilos e monócitos)
devido a defeitos nos componentes do sistema da oxidade do NADPH (gp91, p22, p67
ou p47 phox). Há défice da atividade microbicida, sem défice da fagocitose e,
consequentemente, infeções graves por microrganismos produtores de catalase,
sobretudo bactérias e fungos (Aspergillus).
Anomalias dos leucócitos possíveis de analisar por MFC: Défice da explosão oxidativa;
Défice de gp91 phox (na forma ligada ao X), p22, p67 ou p47 phox.

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6.2.4 Estudos de Função dos Granulócitos e Monócitos – Explosão
Oxidativa

A explosão oxidativa ou burst oxidativo é um dos mais importantes mecanismos


microbicidas dos granulócitos e monócitos, através do qual estas células utilizam o
sistema oxidativo do NADPH para transferirem electrões ao oxigénio e produzirem ião
superóxido (O2-). Este é convertido em H2O2 e noutros metabolitos reativos de
oxigénio.
Um dos testes mais utilizados para avaliar a explosão oxidativa é o teste de oxidação
da dihidrorodamina 123 (bursttest), por MFC. É efetuada incubação da amostra de
sangue periférico a 37ºC com diferentes estímulos: E. Coli opsonizada, Phorbol 12-
myristate 13-acetate (PMA) (um potente ativador dos granulócitos) ou N-
Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) (estímulo fraco). Após ativação, os
fagócitos produzem H2O2 que converte, por reação de oxidação, o substrato
fluorigénico dihidrorodamina 123 (DHR123) em rodamina 123, substância fluorescente
que emite no verde.

6.2.5 Análise de Citocinas Intracelulares em Linfócitos ou Monócitos

Para a avaliação da produção de citocinas intracelulares em linfócitos T, as células são


estimuladas com PMA + Iomicina durante 4 a 6 horas a 37ºC em atmosfera
humidificada e com 5% de CO2, e é adicionado Brefeldina A como bloqueador da saída
das citocinas do interior das células (“Golgi stop”). Após ativação é feita marcação de
superfície com CD3 e CD8 e, após permeabilização, a marcação intracitoplasmática
para citocinas (IL-2, TNFα, INFƴ, IL-4).

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7. Conclusão

Um citómetro de fluxo é um equipamento que, através da emissão de um feixe de luz


laser, vai excitar diferentes componentes celulares, próprios ou adquiridos pelas
células. Assim, quando o laser incide sobre a célula, os diferentes elementos a ela
ligados passarão a emitir fluorescência, de forma específica.
Os detetores do citómetro, aliados a uma rede complexa de lentes e espelhos, vão
distinguir os diferentes sinais luminosos, numa caracterização multidimensional da
célula.
A expansão e melhoria técnica, tem transportado a citometria de fluxo para um
universo cada vez mais multicolor, permitindo encontrar espaço na investigação de
base em Ecologia ou Microbiologia, mas em particular na investigação Biomédica.
Perspectivam-se, também, novas áreas de intervenção, nomeadamente no estudo de
alterações periféricas (numéricas ou funcionais) que ocorrem nas células do sistema
imune, após terapêutica imunomoduladora, em particular com base em anticorpos
monoclonais, e que estão a ser cada vez mais utilizadas no tratamento de tumores.
Há mais de 50 anos atrás, quando o diagnóstico tinha como base a análise morfológia,
apenas se conheciam algumas neoplasias hematolinfóide. Um passo crítico na
classificação atual deste tipo de condições é a avaliação da linhagem celular (por
exemplo T ou B) e estado de diferenciação (percursor ou célula madura). Atualmente,
a classificação internacional de tais malignidades, salvo algumas exceções, exige que a
imunofenotipagem seja integrada com a morfologia, citogenética e genética molecular
para que o diagnóstico seja validado.
Finalmente, de referir que apesar dos avanços e novas aproximações metodológicas, é
necessária a presença de profissionais com elevadas competências e um profundo
conhecimento dos conceitos clínico-científicos e biológicos das aplicações base da
citometria (Hematologia, Imunologia, Microbiologia, entre outros). Esses profissionais
são a principal garantia da qualidade dos resultados obtidos na aplicação clínica da
citometria de fluxo.

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38. Zola Heddy, Swart Bernadette, Banham Alison, Barry Simon, Beare Alice, Bensussan
Armand et al. CD molecules 2006 – Human cell differentiation molecules. Journal of
Immunological and Methods. 2007; 319: 1-7

9. Avaliação Final
( Selecione a resposta mais correta/completa)

1 - Os citómetros de fluxo são resultado da fusão de várias ferramentas laboratoriais:


na área da computação; da biotecnologia (produção de anticorpos monoclonais e de
fluorocromos); da tecnologia laser; da electrónica, o que possibilitou a avaliação de
características físicas, químicas e biológicas de vários tipos celulares (humano, outros
animais, protozoários, fungos ou bactérias). Quais os principais sistemas de um
citómetro de fluxo:

a) Sistema de fluidos, sistema óptico e sistema de processamento de sinal


b) Sistema de pressões e sistema de análise de dados
c) Sistema de pressões, flow cell e sistema de análise de dados
d) Nenhuma das anteriores
e) Sistema de fluidos e sistema ótico

2 - No esquema apresentado, qual o comprimento de onda da luz que atinge o


detetor:

a) Toda a luz
b) Luz com comprimento de onda inferior a 550nm
c) Luz com comprimento de onda entre 550nm e 605nm
d) A luz não atinge o detetor
e) Luz com comprimento de onda superior a 550nm

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3 – A utilização de controlos em MFC é essencial, pois fornecem pontos de referência
para a interpretação de dados. Escolha a opção verdadeira:

a) Os tipos de controlos utilizados são controlo negativo e FMO


b) Os tipos de controlos utilizados são controlo para compensações
c) A seta a preto entre as duas fronteiras é representativa de spillover
d) A seta a preto entre as duas fronteiras é representativa de controlo positivo
e) Os tipos de controlos utilizados são controlo negativo e isotipo.

4 - A escolha dos fluorocromos a utilizar numa experiência é um ponto muito


importante e a sua combinação deve ter em conta alguns cuidados básicos:

a) Optar pelos fluorocromos que possam ser excitados pelo mesmo laser
b) Escolher os fluorocromos mais brilhantes, avaliar a sobreposição de espetros e
reservar o fluorocromo mais brilhante para os anticorpos com expressão mais forte
c) Utilizar o menor número possível de fluorocromos
d) Escolher os fluorocromos mais brilhantes, avaliar a sobreposição de espetros e
reservar o fluorocromo mais brilhante para os anticorpos com expressão mais fraca
e) Optar sempre pelos fluorocromos que possam ser excitados por lasers diferentes

5 – Apesar dos fluorocromos apresentarem um pico máximo de emissão, o espetro de


emissão de fluorescência é amplo. A consequência desta característica é a
sobreposição das cores. A seta azul na imagem apresentada representa o conceito:

a) Controlo biológico
b) Compensação
c) Spillover
d) gating
e) População CD45RA+
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6 – As células CD3+CD4+ presentes na gate, e de acordo com os marcadores presentes
são:

a) Leucémicas
b) Näive
c) Memória e Näive
d) Não é possível caracterizar as células na gate
e) Nenhuma das anteriores

7 - A Agamaglobulinemia é uma Imunodeficiência Primária, causada por um défice da


tirosinocinase de Bruton, que resulta em:

a) Hipogamabulinemia
b) Linfopenia B grave
c) Infeções recorrentes
d) Todas as anteriores
e) Nenhuma das anteriores

8 - Tendo em consideração o estudo das subpopulações dos linfócitos e pela análise


dos dot plots apresentados, estamos perante:

a) Ausência de linfócitos T
b) Ausência de linfócitos B e NK
c) Ausência de linfócitos B
d) Défice de linfócitos T e NK
e) Ausência de linfócitos B e T

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9 - Na construção da estratégia de análise é comum a utilização inicial de um dot plot
FSC/SSC porque:

a) Avalia a auto-fluorescência da população


b) Permite distinguir subpopulações de acordo com o seu tamanho e complexidade
c) Avalia a viabilidade celular
d) Permite obter a percentagem de células positivas para a marcação de interesse
e) Permite obter a percentagem de células positivas e negativas para a marcação de
interesse

10 - As principais funções de um controlo negativo são:

a) Ajustar o FSC e SSC para que as células apareçam em escala, ajustar a sensibilidade
dos PMTs para as fluorescências e estabelecer uma fronteira entre negativo e
intensidades de fluorescências
b) Ajustar o FSC e FL1 para que as células apareçam em escala, ajustar a sensibilidade
dos PMTs para as fluorescências e estabelecer uma fronteira entre negativo e
intensidades de fluorescências
c) Ajustar o FL1 e FL2 para que as células apareçam em escala, ajustar a sensibilidade
dos PMTs para as fluorescências e estabelecer uma fronteira entre negativo e
intensidades de fluorescências
d) Só deve ser utilizado quando existe uma clara separação entre população positiva
da negativa
e) Ajustar o FSC e SSC para que as células apareçam em escala

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