UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA

DISCIPLINA: MELHORAMENTO ANIMAL

SEXAGEM DE SÊMEN

DANIELLA CARVALHO
     HANNAH CECÍLIA
  THAIS ALMEIDA

RECIFE- PE
NOVEMBRO/2010
 Introdução

O rebanho bovino brasileiro ocupa um lugar de destaque no cenário mundial,

sendo o Brasil um dos maiores produtores e exportadores de carne (Anualpec, 2005).
Desta maneira a utilização de ferramentas que venham a possibilitar uma melhoria no
processo produtivo são sempre bem vistas e bastante utilizadas. As biotécnicas da
reprodução, como inseminação artificial, fertilização in vitro, transferência de embriões,
sexagem de sêmen,entre outras, já são bastante utilizadas e concentram resultados
positivos quando empregadas (Freitas, 2007).
A sexagem de sêmen é uma biotécnica que nos permite identificar o sexo do
espermatozóide mesmo antes que ocorra a fecundação, separando-os em populações
com cromossomos X (que darão origem a fêmeas) e com cromossomos Y (que darão
origem a machos), possibilitando a otimização da cadeia produtiva, permitindo assim o
rápido avanço genético e a produção de animais do sexo desejado. Isto permite ao
produtor direcionar os nascimentos de seu rebanho de forma que atenda as suas
necessidades de acordo com a sua cadeia produtiva ou as carências do mercado (Neto,
2007). No setor da produção leiteira o desejo do criador é que ocorra o nascimento
apenas, ou em sua maioria, de fêmeas e no segmento de gado de corte o nascimento de
bezerros é sempre melhor visto, a possibilidade de “planejar” o nascimento de machos e
fêmeas é um trunfo que possibilita melhorar a rentabilidade na produção (Hohenboken,
1999).
Após 20 anos de estabelecimento do conteúdo do DNA iniciou-se a aplicação da
tecnologia da sexagem de sêmen (Garner, 2006)
Em um programa de melhoramento genético, os bezerros nascidos de sêmen
sexado são geneticamente superiores, podendo assim, serem utilizados como
reprodutores (Seidel, 2007).
O sêmen sexado pela técnica de citometria de fluxo está disponível
comercialmente no Brasil desde 2004. A acurácia do resultado esperado no sexo dos
bezerros é elevada, sendo anunciado um mínimo de 85% pelas empresas processadoras
do sêmen (Lima, 2005). Apesar de muitos criadores almejarem a utilização desta
tecnologia, são poucos os que usam e têm o capital necessário para implementar e
manter tal programa (Garner, 2006).
 A aplicação de uma técnica que irá direcionar o sexo dos animais de um rebanho
associada a um teste de progênie possibilita ao produtor a diminuição de custos, visto
que este investirá apenas nos animais que realmente atendam as suas necessidades
produtivas da forma mais eficiente possível (Hohenboken, 1999).

Histórico

A primeira descrição do sêmen data de 460-377 a.C. com Hipócrates que

acreditava que o sêmen possuía um papel importante no desenvolvimento da criança,
onde um sêmen forte originaria um menino e um sêmen fraco uma menina (Garner &
Seidel, 2008).
Filósofos da Grécia Antiga como Democritus de Abadera (460-370 dC),
acreditavam que os machos provinham dos testículo direito e as fêmeas do esquerdo,
desta forma ocorreram na reprodução humana, casos de castração do testículo
“indesejado” para a obtenção da prole com o sexo desejado (Klinc & Rath, 2006).
Há muitas diferenças teóricas entre a produção de espermatozóides de macho e
fêmea como as diferenças físicas do tamanho, peso e densidade; velocidade; cargas
elétricas de superfície; proteínas macromoleculares de superfície; efeitos diferenciais de
pH e diferentes efeitos da pressão atmosférica (Seidel, 1988). Porém essas diferenças
são tão pequenas que atualmente é difícil sua diferenciação, logo os espermatozóides
são considerados idênticos em suas características (Garner & Seidel, 2008).
Na primeira metade do século XX, houve um maior desenvolvimento no ramo
das ciências biológicas, em particular a genética que recebeu grande impulso com a
descoberta dos cromossomos sexuais (Klinc & Rath, 2006).
Os primeiros estudos com sexagem de sêmen ocorreram com sêmen de coelho e
suíno, onde a tentativa de separação foi através da centrifugação (Garner, 2006).
No final da década de 60, a utilização do citômetro de fluxo aumentou o
interesse em mensurar o DNA das células, esta técnica também era utilizada em análises
de células tumorais e outros diagnósticos (Klinc & Rath, 2006).
Antes da década de 1980, eram precários métodos precisos para a determinação
do sexo dos espermatozóides. A partir de 1981, após a iniciativa do empresário Sr.
William Goddard juntamente com os Drs. Rupert Amann e George Seidel, onde
promoveram a realização de um simpósio sobre os aspectos básicos e relevantes da
biologia do sêmen, sendo este o principal avanço nos estudos para o aprimoramento da
biotecnologia do sêmen sexado (Amann & Seidel, 1982).
Determinação do sexo
A determinação do sexo era atribuído apenas ao cromossomo X no início do
século
XX, sendo a classificação do macho X0 e da fêmea XX. Em 1914 Bridges descobriu
que o sexo masculino era determinado pela associação de um cromossomo X com outro
morfologicamente distinto, denominando-o de Y . Nos mamíferos, a principal regulação
da determinação do sexo depende somente da informação cromossômica. Os
espermatozóides transportam um cromossomo X ou Y.
A seleção do sexo nos animais domésticos tornou-se um dos principais objetivos
quando a capacidade de sexagem dos espermatozóides X e Y foram atingidas. Um
importante atributo que difere o espermatozóide dos mamíferos é a forma da cabeça. Os
espermatozóides na maioria dos mamíferos têm a cabeça achatada e oval (Austin,
1965), essa forma da cabeça orienta melhor o espermatozóide na sexagem com o uso da
hidrodinâmica quando comparados aos gametas com cabeças arredondadas ou
angulares.
Com a utilização da técnica de citometria de fluxo foi possível identificar das
diferenças do conteúdo de DNA entre raças de bovinos, que ocorre no núcleo dos
espermatozóides X e Y nas raças européias (Bos taurus) e nas raças zebuínas devido aos
diferentes tamanho do cromossomo Y.

Sexagem dos Espermatozóides

 A separação dos espermatozóides contendo o cromossomo X daqueles contendo
o cromossomo Y é possível através da detecção de pelo menos uma diferença fenotípica
entre essas células, podendo ser: antígenos de superfície e conteúdo de DNA .  
Diferença nos antígenos de superfície:
Em 1955 Eichwald e Silmser descreveram pela primeira vez o antígeno H–Y
sendo este um antígeno específico relacionado ao sexo masculino. Alguns autores
relataram a identificação e o isolamento das proteínas específicas do sexo sendo
possível a obtenção de anticorpos específicos do sexo masculino e do sexo feminino.
Após a incubação com espermatozóides bovinos, os anticorpos antiproteínas específicas
do sexo feminino promoveram a aglutinação de 50% daquelas células. As células que
não sofreram aglutinação produziram in vitro 106 embriões, dos quais apenas 72
puderam ser sexados pela técnica de citogenética sendo 92% destes do sexo masculino.
A identificação de genes codificando o epitopo H–Y nos últimos anos
demonstram que os epitopos H–Y são pequenos peptídeos contendo de 8 à 11
aminoácidos. Os peptídeos H–Y são apresentados como um grande complexo de
histocompatibilidade de moléculas sobre a superfície da célula, assim, sendo possível a
sexagem dos espermatozóides em larga escala através das proteínas de superfície por
anticorpos específicos, anti-espermatozóide X e anti-espermatozóide Y.
Ali (1987), baseado nesta hipótese, sexou espermatozóides de bovino de acordo
com a expressão do antígeno H–Y, tratando-os com anticorpo monoclonal anti H–Y e
anticorpo conjugado, e submetendo-os a “Fluorescente Activivated Cell Sorted’”. Cerca
de 8% dos espermatozóides fluorescentes (H-Y positivo), eram portadores do
cromossomo Y e 70% dos não fluorescentes (H-Y negativo), eram portadores do X.
Outros autores relataram que a separação dos espermatozóides X e Y, pode
chegar a acuidade de 98%, utilizando anticorpos monoclonais anti-H-Y associados a
cotas de polímeros magnetizados. Não há relatos se a incubação de espermatozóides
com anticorpos antiproteínas macho específica também promoveu o desvio da
proporção sexual em favor ao sexo feminino.
A análise de mais de mil membranas de espermatozóides X ou Y por estudos
eletroforéticos, separados por citômetria de fluxo, demonstrou que não e possível
identificar as diferenças entre as proteínas de membrana dos portadores do cromossomo
X ou Y. Com o aprimoramento deste novo método será possível desenvolver uma
técnica imunológica de separação de espermatozóides portadores do cromossomo X e Y
eficiente.
Diferenças no conteúdo de DNA:
Nos bovinos, o espermatozóide X contém, aproximadamente, 4% mais DNA que
o espermatozóide Y. Apesar desta diferença ser pequena, é possível medir o conteúdo
de DNA de cada um dos espermatozóides com precisão suficiente para distinção entre
espermatozóides X e Y. Com base nesta diferença, existem duas técnicas que podem ser
utilizadas para a seleção do sexo dos espermatozóides: a centrifugação em gradiente de
densidade e a citometria de fluxo.
O conteúdo de DNA do sêmen é determinado usando corantes fluorescentes, o
corante Hoechst 33342 foi escolhido por ser o menos tóxico entre os corantes de DNA
com potencial de penetração na membrana plasmática de células vivas. A coloração liga
seletivamente a regiões ricas de DNA e permite a detecção de pequenas diferenças do
conteúdo de DNA.
Assim, o espermatozóide X recebe cerca de 4% mais corante vinculado ao seu
DNA, do que o espermatozóide Y. Tal corante fluoresce apenas quando exposto a uma
específica onda de luz, e esta é, normalmente, fornecida por raio laser. A fluorescência é
medida por um detector e analisado por computador fornecendo uma medida exata do
teor do conteúdo de DNA.
Centrifugação em gradiente de densidade:
A sexagem dos espermatozóides através da técnica de centrifugação em
gradiente de densidade baseia-se na diferença de densidade existente entre os
cromossomos X e Y. Analisando a cabeça dos espermatozóides através da técnica de
microinterferometria, foi verificado que o cromossomo X contém mais conteúdo de
DNA e proteína nuclear que os espermatozóides Y, assim, causando diferença de peso
e, consequentemente, na densidade entre os dois tipos celulares.
Alguns experimentos foram realizados utilizarando centrifugação em gradiente
de Percoll para a separação dos espermatozóides bovinos portadores do cromossomo X
ou Y. O gradiente consistiu de 10 camadas de 0,6 ml de soluções de Percoll com
concentrações variando entre 22% e 48%. Este método propiciou um enriquecimento de
mais de 75 % de espermatozóides X ou Y nas frações inferior e superior,
respectivamente. Após as duas centrifugações, os espermatozóides de ambas frações
não demonstraram nenhuma diferença significativa quanto à morfologia. A indução da
reação acrossômica demonstrou capacitação normal. Os espermatozóides de ambas
frações foram utilizados para produção in vitro de embriões que foram sexados por
PCR, o que demonstrou que a utilização de espermatozóides da fração superior e
inferior resultaram em 75 % e 92 % de embriões do sexo masculino e feminino,
respectivamente.
Em outro estudo, relizando-se a separação de espermatozóides, através de
sedimentação em diferentes gradientes de Percoll, obteve para oito e doze gradientes
diferentes sendo 74,45% para X e 74,55% para Y, quando corados com Quimacrina
mostarda.
As injúrias causadas nos espermatozóides pelas sucessivas centrifugações e
manipulações são possíveis serem minimizadas através da diminuição do número de
centrifugações, pois não altera na acuidade da separação dos espermatozóides X e Y,
assim, sendo preservada a resistência dos mesmos ao processo de congelação.
Citômetro de fluxo:
O citômetro de fluxo foi desenvolvido no Laboratório Nacional Lawrence
Livermore pelo Dr. Daniel Pinkel, onde os espermatozóides eram orientados para obter
medições precisas do conteúdo de DNA . O método inicial de seleção pelo citômetro de
fluxo danificava muito o espermatozóide, de maneira que sua cauda e membranas
desprendiam-se antes de serem corados pelo corante Hoechst 33342, tornando o
processo impraticável.
A adaptação do tubo de injeção para forma triangular e da inclusão de um
segundo detector de luz foram necessárias para obter maior resolução para análise das
células planas. Por conseguinte, alguns autores modificaram o sistema através da
orientação dos espermatozóides na frente do raio laser. Tais melhorias no citômetro de
fluxo foram pré-requisitos para detectar diferenças de conteúdo de DNA dos
cromossomos X e Y dos espermatozóides. A precisão da identificação do conteúdo de
DNA pelocitômetro de fluxo é necessária para a determinação da diferença de conteúdo
de DNA entre os mamíferos.
A acurácia do processo de seleção é de, aproximadamente, 90%, podendo variar
entre 87% e 95% dependendo do operador, velocidade e variações individuais do
ejaculado. A eficácia da sexagem dos espermatozóides não depende só das relativas
diferenças do DNA, mas também da capacidade de orientação precisa desses gametas
pelo citômetro de fluxo.
O Processo de sexagem pelo citômetro de fluxo:
 O fluxo de fluidos é quebrado em poucas gotas por um cristal vibrador,formando
cerca de 70.000 a 80.000 gotas por segundo. Cerca de um terço das gotículas contêm
um espermatozóide e cerca de dois terços são vazias; algumas gotas contêm dois ou
mais espermatozóides. A gotícula que contém o espermatozóide com o cromossomo X
analisado pelo computador, recebe uma carga elétrica positiva, a gotícula que contém o
espermatozóide com o cromossomo Y, recebe uma carga negativa e se a gota não
contém nenhum espermatozóide, espermatozóides danificados, ou espermatozóides
indistinguíveis em relação ao conteúdo de DNA, nenhuma carga é acrescentada.
Quando as gotículas saem no bico do citômetro de fluxo, a uma velocidade cerca de 80
km por hora, passam por campos elétricos sendo um lado positivo e o outro negativo.
Cargas elétricas opostas são atraídas, a gotícula com carga positiva contendo o
espermatozóide X, avança em direção ao campo negativo, os espermatozóides Y com
carga negativa avançam em direção ao campo positivo, e aqueles com nenhuma carga
continuam para baixo. Deste modo, três fluxos de gotículas são produzidos e colhidos
em tubos de ensaio. Em média, a fração final contém 20% de espermatozóides X, 20%
de espermatozóides Y e 60% danificados ou não sexados por alguma razão.

Vantagens da sexagem de sêmen

A principal vantagem da sexagem de sêmen é a maximização da produção

animal. Um dos principais fatores para um bom desempenho na bovinocultura é o sexo
do bezerro. Com a possibilidade de existir no mercado consumidor  doses de sêmen
enriquecidas com espermatozóides de cromossomos X ou Y, a inseminação artificial
será amplamente difundida, gerando uma maximização do progresso genético do
rebanho de acordo com sua aptidão e o programa de melhoramento que foi adotado.
(Lima, 2006; Baruselli, et al., 2007 )
Outra vantagem decorrente dos avanços na técnica seria a reprodução assistida
de espécies ameaçadas de extinção. (Seidel & Johnson, 1999).
 Desvantagens da biotecnologia de sexagem de sêmen

Essa técnica provoca danos aos espermatozóides, deixando-os sensíveis ao

processo de criopreservação ( Hollinshead et al., 2003). O processo de seleção leva a
uma menor capacidade de fecundação dos espermatozóides após ser feita inseminação
artificial in vivo ou in vitro e menores taxas de prenhez quando comparados a sêmen
não-sexado ( Sartori et al., 2004). Isso ocorre devido ao estresse químico e físico que as
células são expostas durante o processo de sexagem (Seidel, 2003).
As principais fontes de agressão às células são corantes, raio laser, alta diluição,
campo elétrico e forças mecânicas com elevada pressão líquida, além de várias
mudanças na composição do meio que ocorrem durante o processo ( Maxwell &
Johnson, 1999).
A citometria de fluxo apresenta desvantagens próprias por sexar os
espermatozóides um de cada vez (Garner, 2006) , tornando a técnica cara, além da baixa
longevidade dos espermatozóides, frescos e criopreservados (Mocé et al, 2006).
Outros testes mas práticos continuam a ser aprimorados, mas, nenhum ainda
conseguiu reunir dois critérios essesnciais que são a precisão e a manutenção da
fertilidade dos espermatozóides (Seidel, 2007).
A sexagem de sêmen ainda precisa passar por aprimoramentos, pois cerca de
60% dos espermatozóides da amostra são perdidos devido a sexagem, centrifugação e
armazenamento (Garner & Seidel, 2003). Dessa forma, para que o sêmen sexado seja
economicamente viável, menos espermatozóides são utilizados por dose inseminante
quando comparados ao sêmen convencional (Seidel, 2007).
 Considerações Finais

A técnica de sexagem ainda precisa ser aprimorada para minimizar os danos

causados às células e às baixas taxas de prenhez. Com o avanço da técnica o sêmen
sexado poderá ser utilizado em larga escala, tornando a inseminação artificial mais
difundida e compatível com o mercado, melhorando a eficiência da produção, um maior
ganho genético, facilidades no manejo do rebanho e um maior ganho econômico com o
direcionamento da produção de animais compatíveis com a necessidade do produtor.
 Bibliografia

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