Universidade Federal de Pelotas

Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel

Programa de Ps-Graduao em Agronomia
CENTRO DE GENOMICA E FITOMELHORAMENTO

Introduo Bioinformtica

Professores:
Luciano Maia
Antonio Costa de Oliveira

Primer design
ou

Desenho de oligos
ou

Desenho de primers
ou

Desenho de iniciadores

Luciano Maia

Qual a importncia do desenho de primers na

biologia molecular??

Borer et al. (1974)

Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.
J Mol Biol. 15;86(4):843-53.

Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.

Lembrando.termodinamica

Entalpia (H) :
Energia contida num sistema

Energia livre (G) :

a energia til para realizar o trabalho para se obter tal sistema
-chama energia livre de Gibbs.

Entropia (S):
diferena entre H e G
Depende da complexidade do sistema
Maior complexidade
= menor entropia
Menor complexidade
= maior entropia
....desordem

Lembrando.termodinamica

( TC, 1 atm)

H2 + Cl2

(25C, 1 atm)

=>

2 HCl + 184,9 kJ
H = -184,9 kJ
Exotrmica
Absorve energia

H2 + I2 + 51,8 kJ

=>

2 HI
H = +51,8 k
Endotrmica
Libera energia

Lembrando.termodinamica

Reao exotrmica:
reao qumica que libera calor
energia final dos produtos menor que a energia inicial dos reagentes
Disso se conclui que a variao de energia negativa.
Exemplo: COMBUSTIVEIS

Lembrando.termodinamica

Reao Endotrmica:
reao qumica que absorve calor
a energia final dos produtos maior que a energia inicial dos reagentes
Desta forma a variao de energia positiva

Lembrando.termodinamica

H2(g) + O2(g) = H2O

Energia liberada pela reao: H
H = - 68,3 kcal/mol
Energia gasta na organizao: S
S = - 11,6 kcal/mol

Energia livre (G) - Saldo de energia (energia til para realizar trabalho):
G = H T . S
G = - 68,300 + 11,6
G = - 56,6 kcal/mol

espontnea a reao
H

espontnea a reao
H
S (entropia desordem)

Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.

De 25 para 37C

Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.

De 25 para 37C

Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.

De 25 para 37C

OBTENO DE PRIMERS
...
BASEADO NAS PROPRIEDADES TERMODINAMICAS
DAS CADEIAS DE NUCLEOTIDEOS, SAL E TEMPERATURAS

R=
=
T0 =
t=
t

1.987 (cal/C mol)

50 109
273.15 C
21.6 C

is the molar gas constant,

concentration of the primer in its solution
is an empirical temperature correction.
may depend to ion concentration

OBTENO DE PRIMERS

OBTENO DE PRIMERS

Figure 2. The stability of a 25 base (CTG GTC TGG ATC TGA GAA CTT CAG G) varies with K+
and Mg2+ concentrations. Competitive binding of ions to DNA is observed.

Regras simples para desenho de primers

Tm vs Ta
DEFINIES...
GENERALIZAES...

Temperature melting
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

Temperatura de anelamento
.empirico
.experimental
Ta = Tm 3 C
Ta = Tm 5 C

??!!

Regras simples para desenho de primers

Devero ter entre 17-28 bases de tamanho

depende basicamente da TM e especifidade
A composio dever ter entre 40-60% de G+C (conteudo GC)
exceto regies de final de UTR 3
Se possvel, a posio 3' terminar com G, C, CG ou GC:
aumenta a estabilidade do emparelhamento
TMs devero ser entre 55-65C
Se possvel, evitar que a 3 seja complementar ao 5
para no formarem Loop
Se possvel, no deve haver complementaridade
para no formar hairpin

Tm

Primer length

G/C content

GC clamp

Self-Complementary
1)Hairpins : formado por interaes dentro do primer.
GGCGGT ATG ATCCCGCTA GTT AC

GGCGG T A
TA GTT ACCGCC
G
C T AT

2)Self Dimer : Dmero de primers senso

3)Cross Dimer: Dmero de primers antisenso

Self-Complementary

G: a energia requerida para quebrar a estrutura secundria.

Valores de G muito negativos indicam grampos estveis e indesejados
1)Hairpins : formado por interaes dentro do primer.
GGCGGT ATG ATCCCGCTA GTT AC

GGCGG T A
TA GTT ACCGCC
G
C T AT

3end Hairpin:
Internal hairpin:

G -2 kcal/mol
G -3 kcal/mol

2)Self Dimer : Dmero de primers senso

3end Self Dimer:
G -5 kcal/mol
Internal Self Dimer: G -6 kcal/mol

3)Cross Dimer: Dmero de primers antisenso

3end Crossf Dimer:
Internal Cross Dimer:

G -5 kcal/mol
G -6 kcal/mol

Viso geral do desenho de primer

>seqncia_exemplo
ATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATA
TCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAATATCGGAGGGCGGGAGGATTT
GGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGG
CGAGGDGATATCGGAGGGCGGGATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA
TATATATATATAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATCGGAG
GGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCATCGATA
TCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCG
GAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGG
CGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGA
GGDGATATCGGAGGGCGGGA

PRIMER REVERSE

PRIMER FOWARD

>sequencia
exemplo

REGIO AMPLIFICADA

Desenho de primers
PROGRAMAS ON-LINE
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Padro ouro
Facilidade de uso
Disponibilidade on line

ROZEN, S.; SKALETSKY, H. Primer3 on the WWW for general users and for
biologist programmers. Methods in molecular biology, v.132, p.365-386, 2000.

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

PROGRAMAS ON-LINE (2)
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

1) Localizar sequencia

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

2) Identificar posicoes alvo na sequencia, onde o primer dever flanquear

start
1815258
1815258
1815582
1816286
1816531
1816612
1816766
1817043
1817258
1817351
1817469
1817685
1817896
1818133
1818195
1818306
1818525

stop
1818561
1815581
1816285
1816530
1816611
1816765
1817042
1817257
1817350
1817468
1817684
1817895
1818132
1818194
1818305
1818524
1818561

Accession Locus
NM_001063247.1
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
exon

O
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

CDS
CDS
CDS
CDS
CDS
CDS
CDS
CDS
UTR

324 bp
704 bp
245 bp
81 bp
154 bp
277 bp
215 bp
93 bp
118 bp
216 bp
211 bp
237 bp
62 bp
111 bp
219 bp
37 bp

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

3) Sequencia
>gi|115466225:1-1585 Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os06g0133900 (Os06g0133900)
mRNA, complete cds
ATGGCGGCGACCATGGCGTCCAACGCCGCGGCTGCGGCGGCGGTGTCCCTGGACCAGGCCGTGGCGGCGT
CGGCGGCGTTCTCGTCGCGGAAGCAGCTGCGGCTGCCCGCCGCGGCGCGCGGGGGGATGCGGGTGCGGGT
GCGGGCGCGGGGGCGGCGGGAGGCGGTGGTGGTGGCGTCCGCGTCGTCGTCGTCGGTGGCAGCGCCGGCG
GCGAAGGCGGAGGAGATCGTGCTCCAGCCCATCAGGGAGATCTCCGGGGCGGTTCAGCTGCCAGGGTCCA
AGTCGCTCTCCAACAGGATCCTCCTCCTCTCCGCCCTCTCCGAGGGCACAACAGTGGTGGACAACTTGCT
GAACAGTGAGGATGTTCACTACATGCTTGAGGCCCTGAAAGCCCTCGGGCTCTCTGTGGAAGCAGATAAA
GTTGCAAAAAGAGCTGTAGTCGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTTCCTGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAAG
TGCAACTCTTCTTGGGGAACGCTGGAACTGCAATGCGACCATTGACAGCAGCCGTGACTGCTGCTGGTGG
AAATGCAACTTATGTGCTTGATGGAGTGCCACGAATGAGGGAGAGACCGATTGGTGACTTGGTTGTCGGG
TTGAAACAACTTGGTGCGGATGTCGACTGTTTCCTTGGCACTGAATGCCCACCTGTTCGTGTCAAGGGAA
TTGGAGGACTTCCTGGTGGCAAGGTTAAGCTCTCTGGTTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCT
GATGGCTGCTCCTTTGGCCCTTGGGGATGTGGAGATCGAAATCATTGACAAACTAATCTCCATTCCTTAC
GTTGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAGGCAGAGCATTCTGATAGTTGGGACAGAT
TCTATATTAAGGGAGGGCAGAAGTACAAATCTCCTGGAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGC
GAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATCACTGGAGGCACTGTGACAGTTCAAGGTTGTGGTACGACCAGT
TTGCAGGGTGATGTCAAATTTGCTGAGGTACTTGAGATGATGGGAGCAAAGGTTACATGGACTGACACCA
GTGTAACCGTAACTGGTCCACCACGTGAGCCTTATGGGAAGAAACACCTGAAAGCTGTTGATGTCAACAT
GAACAAAATGCCTGATGTTGCCATGACCCTTGCCGTTGTTGCACTCTTCGCTGATGGTCCAACTGCTATC
AGAGATGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAAACCGAAAGGATGGTTGCAATTCGGACCGAGCTAACAAAGC
TGGGAGCATCGGTTGAAGAAGGTCCTGACTACTGCATCATCACCCCACCGGAGAAGCTGAACATCACGGC
AATCGACACCTACGATGATCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTCGCTGCCTGCGCCGACGTGCCCGTG
ACGATCAGGGACCCTGGTTGCACCCGCAAGACCTTCCCCAACTACTTCGACGTTCTAAGCACTTTCGTCA
GGAACTGAACTGAGCTTTTAAAAGAGTGAGGTCTAGGTTCTGTTG

A) Sem especificar uma regio alvo

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

4) Inserir (copiar/colar) sequencia na pagina do Primer3

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

5) Configurar informaes/restries para o Primer3

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

6) Resultado (Parte 1)

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

6) Resultado (Parte 2)

B) Especificar uma regio alvo

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

Especificando uma regiao para ser flanqueada

start
1815258
1815258
1815582
1816286
1816531
1816612
1816766
1817043
1817258
1817351
1817469
1817685
1817896
1818133
1818195
1818306
1818525

stop
1818561
1815581
1816285
1816530
1816611
1816765
1817042
1817257
1817350
1817468
1817684
1817895
1818132
1818194
1818305
1818524
1818561

Start = 324
End = 324 + 704 = 1.028

Accession Locus
NM_001063247.1
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
exon

O
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

CDS
CDS
CDS
CDS
CDS
CDS
CDS
CDS
UTR

324 bp
704 bp
245 bp
81 bp
154 bp
277 bp
215 bp
93 bp
118 bp
216 bp
211 bp
237 bp
62 bp
111 bp
219 bp
37 bp

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

1) Especificando uma regio

Especificando uma regiao para ser flanqueada

Start = 324
End = 324 + 704 = 1.028

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

2) Resultado (Parte 1)

Especificando uma regiao para ser flanqueada

Start = 324
End = 324 + 704 = 1.028

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

2) Resultado (Parte 2)

Especificando uma regiao para ser flanqueada

Start = 324
End = 324 + 704 = 1.028

Desenho de primers Exemplo como usar Primer3

2) Resultado (Parte 3)

Especificando uma regiao para ser flanqueada

Start = 324
End = 324 + 704 = 1.028

Desenho de primers
PROGRAMAS stand-alone
Vector NTI
Facilidade de uso
Disponibilidade programa livre

Desenho de primers
Vector NTI
1) Obter sequencia gravar em arquivo fasta

Desenho de primers
Vector NTI
2) Abrir arquivo fasta contendo no Vector

Desenho de primers - VectorNTI

3) Interface do arquivo carregado no VectorNTI

Desenho de primers - VectorNTI

4) Selecao de uma regiao para o desenho de primers

Desenho de primers - VectorNTI

5) Menu para localizao de Primers

Desenho de primers - VectorNTI

6) Menu para localizao de Primers

Desenho de primers - VectorNTI

7) Resultados (1)

Desenho de primers - VectorNTI

7) Resultados (2)

Desenho de primers - VectorNTI

7) Resultados (3)

Selecionando uma regiao para localizar primers no Vector

Desenho de primers - VectorNTI

1) Marcar regiao

Start = 324

End = 324 + 704 = 1.028

Desenho de primers - VectorNTI

1) Marcar regiao

Start = 324

End = 324 + 704 = 1.028

Desenho de primers - VectorNTI

2) Resultado

Start = 324

End = 324 + 704 = 1.028

?????

lucianoc.maia@gmail.com