UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ - DAB/CCS

DISCIPLINA: Imunologia Clínica Aplicada a Biomedicina

Curso de Biomedicina 2018

DAIs – PRÁTICA 2
Fator antinúcleo (FAN) /
Pesquisa de anticorpos contra antígenos celulares (PAAC)
E ELISA

Profª Izabel Galhardo Demarchi

 MÉTODOS SOROLÓGICOS para diagnóstico
de doenças auto-imunes (DAIs)

 Diferentes métodos de detecção de autoanticorpos:

 Aglutinação de partículas de látex;
 Imunofluorescência indireta (IFI);
 Hemaglutinação indireta (HAI);
 Ensaios imunoenzimáticos;
 Immunoblots (IB);
 citometria de fluxo;
 e métodos cinéticos como nefelometria e turbidimetria.
 MÉTODOS SOROLÓGICOS para diagnóstico
de doenças auto-imunes (DAIs)
 Diferentes métodos de detecção de autoanticorpos:
 Aglutinação de partículas de látex;
 Imunofluorescência indireta (IFI);
 Hemaglutinação indireta (HAI);
 Ensaios imunoenzimáticos;
 Immunoblots (IB);
 citometria de fluxo;
 e métodos cinéticos como nefelometria e turbidimetria.

Substrato cromogênico
1 2 3
YE COR
Anticorpo secundário E
Y
(Conjugado enzimático
Ac anti-IgG humana)
Y E
Y Anticorpo primário
Y
(Paciente) Y Y
Antígeno
 DAIs autoimunes - ELISA
 ELISA – DAIs

Jo-1
PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA
ANTÍGENOS CELULARES (PAAC)
 Imunofluorescência indireta (IFI)
 Antigo fator anti-núcleo (FAN)
 Anticorpos antinucleares (ANA), anticitoplasmáticos, e anti mitóticos:

C+ C- 1 2 3 4
C+
5 6 7 8 9 10

C-
 PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA
ANTÍGENOS CELULARES (PAAC)

 Imunofluorescência indireta (IFI)

 Antigo fator anti-núcleo (FAN)

 Anticorpos antinucleares (ANA),

anticitoplasmáticos, e anti mitóticos:

 Triagem das DAIs

 PAAC negativa: não exclui um diagnóstico de DAIs.
 PAAC positivo: outros testes de anticorpos para
confirmar o diagnóstico de DAIs.

 5% dos indivíduos normais + no FAN/PAAC

Chan et al. Report of the first international consensus on standardized nomenclature of antinuclear antibody HEp-2 cell patterns
2014–2015
 PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA
ANTÍGENOS CELULARES (PAAC)

 I, II, III, IV e V Consensos Brasileiros de Laudos de FAN em HEp-2 (células

epiteliais de carcinoma de laringe humana).

 uso de substrato de células HEp-2 epitelioma de laringe humana em

reação de IFI é o mais útil.
 células HEp-2 permitem o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrões nucleares, nucleolares, da membrana nuclear, do aparelho
mitótico e citoplasmáticos, dados por diferentes autoanticorpos.

 Vantagem do método: sensibilidade (triagem de uma gama imensa de

anticorpos).

Anticorpos antimitocrondriais
Padrão citoplasmaticogranular medio
disperso
PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENOS
CELULARES (PAAC)
Imunofluorescência Indireta (IFI)
Substrato: Células HEp-2
 Materiais e reagentes:
 lâminas contendo células HEp-2 cultivadas, são mantidas a 2 - 8°C;
 conjugado: anticorpos de cabra anti-imunoglobulinas IgG humano
conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) diluído em Azul de
Evans;
 PBS pH 7,2 – 7,4;
 soros controle negativo e controle positivo de padrão de fluorescência
conhecido;
 meio de montagem: glicerol 78%, fosfato de sódio 6mmol/l, fosfato de
potássio 1,6mmol/l, cloreto de sódio 60mmol/l, azida sódica 0,95 g/l;
 lamínulas, câmara úmida e pipetas;
 microscópio de imunofluorescência equipado com filtros de excitação de
495nm e de emissão de 525nm para visualização do FITC.

C+ C- 1 2 3 4

5 6 7 8 9 10
 PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENOS
CELULARES (PAAC)

• Técnica de PAAC: diferentes antígenos fixados em lâminas de

imunofluorescência.

Ex.: fígado e rins de camundongo, leucócitos humanos, timo de bezerro

ou coelho, cultura de células tumorais e cultura de fibroblastos
humanos.

hemoflagelado Crithidia luciliae:

um cinetoplasto rico em DNA

de dupla fita e sem histonas  seu uso
confere alta especificidade ao teste para o
diagnóstico de LES (70%), 

testes confirmatórios para o diagnóstico de

LES.
 PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENOS
CELULARES (PAAC)
 Procedimento técnico: Seguir prescrição do kit
 Retirar as lâminas e os reagentes do refrigerador e esperar adquirir a
temperatura ambiente;
 Seguir as instruções do fabricante;
 Preparar diluição 1/40 – 1/80, dependendo do indicado pelo fabricante, do soro
controle positivo e amostras em PBS;
 Transferir cada soro diluído para uma das divisões da lâmina,
 Incubar em câmara úmida a 25°C por 30’;
 Lavar 2 vezes em PBS, sendo de 10’ cada lavagem;
 Adicionar o conjugado, cobrindo todos poços;
 Incubar em câmara úmida em 25°C por 30’;
 Lavar 2 vezes em PBS, sendo de 10’ cada lavagem;
 Secar cuidadosamente a lâmina; colocar 1 gota de glicerol tamponado, cobrir
com lamínula;
 Proceder à leitura por no máximo 24 h, se armazenado em geladeira, em
câmara úmida e no escuro.

C+
 PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENOS
CELULARES (PAAC)

 Leitura:
 Observar os controles:
 controle positivo: fluorescência do padrão esperado.
 controle negativo: núcleo e citoplasma corados em vermelho.
 e a diluição é considerada quando o padrão ainda é distinguido.
 Quando isso não ocorrer: erro nas diluições, soro controle
deteriorado, conjugado diluído de forma errada, kit vencido. Repetir
a reação após sanar os problemas.

 Semi-quantitativa
 Título:
 Se diluição inicial da amostra (1/40 – 1/80) for positiva (fluorescente)
 diluições maiores até negativação (sem fluorescência).
 Títulos >=80 = DAIs com níveis baixos de autoanticorpos
 Títulos 160/320: títulos moderados
 >=640 títulos altos
PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENOS
CELULARES (PAAC)
 FAN - método de triagem, faz-se necessário a determinação das
especificidades dos autoanticorpos envolvidos nas doenças
autoimunes.
 Especificidades : úteis ao médico para o estabelecimento do
diagnóstico correto, prognóstico e seguimento clínico e terapêutico
do paciente.

 imunodifusão dupla, contraimunoeletroforese, hemaglutinação

passiva, ELISA, imunoprecipitação, imunodot e western-blot.
 Roteiro para interpretação da PAAC
 A partir de sua interpretação em associação com a clínica, pode-
se concluir pelo melhor diagnóstico. Assim, quando se obtiver:

 PAAC negativo: 5% dos pacientes com LES têm PAAC negativo,

porém não em LES ativo.

 PAAC negativo + clínica suspeita: solicitar anti-Ro/SSA e/ou

anti-Jo-1 e/ou antifosfolípideos.

 PAAC positivo, baixo título + clínica inespecífica: solicitar anti-

Ro/SSA e/ou anti-Jo-1 ou antifosfolípides. Pesquisar a
especificidade que mais se correlacione com a hipótese clínica.
 Roteiro para interpretação do PAAC
 PAAC positivo, baixo título + clínica altamente suspeita
de/solicitar:
 LE: anti-DNAn, anti-Sm, anti-Ro/SSA
 Esclerodermia: anti-Scl-70, anti-centrômero,
 S. Sjögren: anti-Ro/SSA, anti-La/SSB
 LE neonatal: anti-Ro/SSA, anti-La/SSB, anti-U1RNP

 PAAC positivo, alto título + clínica altamente suspeita: a

avaliação da localização e do padrão de depósito pode ser
suficiente para correlação com a especificidade do PAAC e
conclusão do diagnóstico;
 ou solicitar os autoanticorpos específicos para confirmação de
acordo com item anterior.

Retirado de: Artur Antonio Duarte – Fator anti-núcleo na dermatologia; An Bras Dermatol. 2005; 80(4):387-94.
 Padrões no PAAC (HEp-2)
 Padrão nuclear homogêneo (anti-dsDNA)
 Crithidia luciliae (anti-dsDNA)  (atividade da doença e
acompanhamento do paciente)
 Diagnóstico específico de LES (95%)

Atlas de imunofluorescência de autoanticorpos. A. R. Kraps; C.A. von Müller et al. 1996

 Padrões no FAN (HEp-2)
LES (nefrite)  Anti-DNA de hélice dupla

Padrão membrana nuclear

(periférico)

Atlas de imunofluorescência de autoanticorpos. A. R. Kraps; C.A. von Müller et al. 1996

Padrões no FAN (HEp-2)
 Padrão pontilhado grosso: anti-Sm (Smith)  específicos p/
LES (especifici// 99%).

Atlas de imunofluorescência de autoanticorpos. A. R. Kraps; C.A. von Müller et al. 1996

Padrões no FAN (HEp-2)

 Anti- U1/RNP (padrão pontilhado grosso):  presente em 30

a 40% LES e DMTC (AR, LES, PM/DM e esclerodermia; títulos
elevados).

Atlas de imunofluorescência de autoanticorpos. A. R. Kraps; C.A. von Müller et al. 1996

Padrões no FAN (HEp-2)

 Padrão pontilhado fino: anti-SSA-Ro  S. Sjögren (88-96%); AR

(3-10%) e LES (24-60%). Anti-SSB-La  maioria associado c/ anti-
SSA/Ro  SS (71-87%) e lúpus neonatal (75%).
Padrões no FAN (HEp-2)
 Padrão centromérico (CENP)  Sugestivo de síndrome CREST
(Calcinose, fenômeno de Raynauld, imobilidade do esôfago,
esclerodactilia e telangiectasia)  forma limitada de esclerodermia
(70%).
Padrões no FAN (HEp-2)
Padrão nucleolar: Scl70 (DNA-topoisomerase)  esclerodermia
(20 – 59%); Scl difusa  (70 – 76%) e PM/Scl (12%).
Padrões no FAN (HEp-2)
 Anti-Jo-1 - (RNA sintetase) padrão citoplasmático pontilhado:
PM (20 – 40%)  específico p/ polimiosite e fibrose pulmonar
intersticial (>95%).
 PADRÕES DE FLUORESCÊNCIA
ANTICORPO DOENÇAS ENCONTRADAS
Padrão nuclear homogêneo
Histonas Lúpus eritematoso sistêmico
dsDNA Lúpus eritematoso sistêmico
Artrite reumatóide
Padrão nuclear periférico
Lamininas
Gp210
Hepatopatias crônicas
Tpr
DsDNA (apenas em substrato de fígado de rato)
Padrão nuclear pontilhado grosseiro
Lúpus eritematoso sistêmico
Doença mista do tecido conjuntivo (DMTC)
U1-nRNP Fenômeno de Raynaud
Esclerose sistêmica
Superposição esclerose sistêmica/polimiosite
Sm Lúpus eritematoso sistêmico
 PADRÕES DE FLUORESCÊNCIA

ANTICORPO DOENÇAS ENCONTRADAS

Padrão nuclear pontilhado fino
SS-A/Ro Síndrome de Sjögren
Lúpus eritematoso sistêmico
Lúpus neonatal
Artrite reumatóide
SS-B/La Síndrome de Sjögren
Lúpus eritematoso sistêmico
Lúpus neonatal
 PADRÕES DE FLUORESCÊNCIA
ANTICORPO DOENÇAS ENCONTRADAS

Padrão nucleolar

Esclerose sistêmica
DNA topoisomerase
Superposição esclerose sistêmica/polimiosite

Superposição esclerose sistêmica/polimiosite

Esclerose sistêmica
Ku
Lúpus eritematoso sistêmico
Hipertensão pulmonar

Polimiosite
PM-Scl Esclerose sistêmica
Superposição esclerose sistêmica/polimiosite

Padrão centromérico

CREST (esclerose sistêmica de forma limitada)

Proteínas A, B e C do centrômero Cirrose biliar primária
 PADRÕES DE FLUORESCÊNCIA
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS
Padrão na fluorescência Antígeno Doença ou associação clínica
Miastenia gravis
Fibrilar segmentar α-actinina, vinculina Doença de Crohn
Colite ulcerativa

Doenças infecciosas e inflamatórias

Vimentina
Hemodiálise crônica
Fibrilar filamentar
Hepatopatia alcoólica
Queratina Doenças do tecido conjuntivo
Psoríase
Muitas das aminoacil-TRNA Polimiosite, Dermatomiosite
Pontilhado fino denso
sintetases (Jo-1, PL-7, PL-12) Miosite e pneumopatia intersticial
Homogêneo rRNP Lúpus neuropsiquiátrico

Retirado da Apostila: Arte e Ofício do FAN, de autoria de: von Mühlen, CA; Keiserman, MW; Rodrigues, TRSA; Lucena, D. 1996
e de Krapf, AR & von Mühlen, CA. Atlas of Immunofluorescent Autoantibodies. Ed. Urban & Schwarzenberg, 1996.
DAIs autoimunes - FAN
Estratégia p/ soltar laudos:

Consenso 2002 - Brasil

 Padrões no FAN (HEp-2)
 Interpretação: os padrões raramente são
específicos de qualquer auto-Ac ou doença 
indicativos de um auto-Ac.
 Verificar por testes mais específicos (antígenos
recombinantes purificados ou extratos teciduais brutos):
 Imunodifusão dupla;
 Imunobloting;
 Imunoprecipitação
 ELISA
 Hemaglutinação
 RIE
 DAIs –Bibliografia
 ABBAS AK, LICHTMAN AH, PILLAI S. Imunologia Celular e Molecular. 8ª ed. Rio de
Janeiro : Elsevier, 2015.
 VAZ AJ, TAKEI K, BUENO EC. Ciências Farmacêuticas. Imunoensaios.
Fundamentos e Aplicações. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan. 2007. 372 p.
 FERREIRA AW et al Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e
Auto-Imunes. 3ª Ed. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan. 2013.443 p.
 VERONESI R, FOCACCIA R. Tratado de Infectologia. São Paulo. Ed. Atheneu. 1997.
1764 p.
 FERREIRA, Antonio Walter, MORAES, Sandra do Lago. Diagnóstico laboratorial das
principais doenças infecciosas e autoimunes: correlações clínico-laboratoriais. 3. ed.
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
 JANEWAY CA, TRAVERS P, WALPORT M & CAPRA JD. Imunobiologia – O sistema
imunológico na saúde e na doença. 4ªed. Artmed editora. 2000.
 Bibliografia complementar:
Artigos de imunologia - Principais Periódicos
 Journal of Leukocyte Biology The Journal of
Immunology
 European Journal of Immunology Nature Reviews
 Base de dados, manuais, Guias técnicos, boletins epidemiológicos e outros em:
 www. datasus.gov.br www.saúde.gov.br www.aids.gov.br

 www.cdc.gov. www.who.org www.scielo.br

www.nlm.nih.gov (pubmed, MESH Database)