Caso o paciente tenha o antígeno, ele ficará
na placa. Um conjugado de anticorpo +
1. Compreender os testes de
detecção viral (RT-PCR,
Sorologia, Teste Rápido).
Os testes rápidos sorológicos, por
imunoensaio enzimático (teste
Elisa) e por imunoensaio
quimioluminescente (teste Clia)
têm o objetivo de detectar
anticorpos específicos contra a
Covid-19 que o nosso organismo
produz em resposta à infecção viral,
visando controlar e eliminar tanto o
vírus como células infectadas.
Esses testes são indicados a partir
do sétimo dia de doença e os
resultados negativos não descartam
o contato prévio com o vírus, que
devem ser repetidos após uma
semana para confirmação.
1. Ensaio de Imunoabsorção
enzimática (ELISA – sigla do
inglês – Enzyme Linked
Immunoassay)
Baseia-se na quantificação de uma reação
enzimático associada com complexos
imunes. O teste detecta, identifica e
quantifica Antígeno e Anticorpo, utilizando
dois conjugados com enzimas.
O teste pode ser qualitativo ou quantitativo.
O produto final corado surge por ação da
enzima que converte um substrato incolor
em um produto colorido.
Principais enzimas:
Peroxidase, Fosfatase Alcalina, Beta-D-
Galactosidase
ELISA DIRETO
Para a detecção direta, o antígeno aderido à
placa é detectado por um anticorpo
diretamente ligado a uma enzima. Esse
método de detecção possui baixa
sensibilidade e é raramente usado.
enzima vai se ligar a esse antígeno, e essa
enzima vai reagir com o substrato,
formando a cor.
ELISA INDIRETO
O método indireto é o mais utilizado para
DETECÇÃO DE ANTICORPO.
No método indireto, o antígeno aderido a
placa é detectado em dois estágios.
Inicialmente, aplica-se um anticorpo
primário não marcado (amostra do
paciente), que é específico para o antígeno.
Em seguida, um antígeno secundário
marcado com uma enzima se liga ao
anticorpo primário
A placa é sensibilizada com o antígeno, e a
amostra do paciente é colocada na placa.
Caso haja o anticorpo especifico na amostra
do paciente, este se ligará ao antígeno na
placa. É coloca do, então, um conjugado
monoclonal (anticorpo + enzima –
anticorpo secundário – anti-imunoglobulina
humana) que vai reagir com o anticorpo do
paciente (se ligar a ele), e a enzima que está
ligada com esse anticorpo vai reagir com o
substrato e ‘’liberar a cor’’.
ELISA SANDUÍCHE
O método sanduiche, ou captura, é indicado
para IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS
E DE ANTICORPOS.
É o método mais utilizado, possui grande
sensibilidade e poder de amplificação do
sinal.
É adicionada a placa anticorpos de captura
específico. Posteriormente, a amostra do
paciente é adicionada na placa (caso se
queira identificar a presença de antígeno),
ou um antígeno específico é adicionado
para depois adicionar a amostra do paciente
(caso se queira identificar o anticorpo).
O antígeno ou o anticorpo presente na
amostra irá se ligar no anticorpo de captura.
Por último, o anticorpo ligado a enzima é
adicionado, e acontece a mudança de cor.
 ELISA DE COMPETIÇÃO
Usado para a identificação de antígenos.
Esse método evita o falso positivo.
Utiliza um antígeno marcado para competir
com o alvo. O antígeno marcado se liga
menos quando houver mais antígenos não-
marcados (da amostra do paciente) e assim,
a cor fica mais fraca quando houver muito do
alvo na amostra. É utilizado principalmente
quando o alvo possui poucos epítopos
(menor porção de antígeno com potencial de
gerar a resposta imune) de ligação ou é muito
pequeno.
2. Radioimunoensaios
Foram descobertos em 1956, com a
quantificação da insulina.
Utilizam anticorpos conjugados com
radioisótopos para quantificar os
ensaios.
- Alta sensibilidade
- Alto custo e risco operacional
3. PCR
A reação em cadeia da polimerase (PCR, de
polymerase chain reaction) é uma técnica em
que pequenas amostras de DNA podem ser
rapidamente amplificadas, isto é,
aumentadas em quantidades suficientes para
que a análise seja feita.
Cada fita do DNA-alvo servirá como molde
para a síntese do DNA. Acrescenta-se a esse
DNA um suprimento de quatro nucleotídeos
(para a montagem de um novo DNA) e a
enzima para catalisar a síntese, a DNA-
polimerase.
Fragmentos curtos de ácido nucleico,
chamados de iniciadores, também são
adicionados para auxiliar no início da
reação. Os iniciadores são complementares
às extremidades do DNA-alvo.
De- pois de cada ciclo de síntese, o DNA é
aquecido para converter todo o novo DNA
em fitas simples. Cada fita de DNA recém
sintetizada funciona, por sua vez, como
molde para novos DNAs.
No PCR em tempo real, ou PCR quantitativo
(qPCR), o DNA recém-formado é marcado
com um corante fluorescente, assim, os
níveis de fluorescência podem ser
mensurados após cada ciclo de PCR (por
isso, a denominação tempo real). Outra
modalidade da PCR, denominada PCR de
transcrição reversa, utiliza RNA viral ou
mRNA celular como molde. Nesse caso, a
enzima transcriptase reversa sintetiza uma
molécula de DNA a partir do RNA-molde, e
a seguir o DNA é amplificado.
A PCR não pode ser utilizada para
amplificar um genoma inteiro.
Artigo Scielo 2022 - A detecção de SARS-
COV-2 em cotonetes nasofaríngeos e
salivas usando RT-PCR foi semelhante -
Brazilian Dental Journal
PCR – Saliva ou Swabs nasofaríngeo
O estudo teve como objetivo validar o uso de
saliva para detecção de SARS-CoV-2. Os
autores descobriram que a sensibilidade da
detecção de SARS-CoV-2 na saliva é
superior aos swabs nasofaríngeos na
hospitalização precoce e mais consistente
durante a hospitalização e a recuperação
prolongadas. Mais recentemente, Sakanashi
et al. 13 usaram 12 pares de NPS e amostras
de saliva coletadas de pacientes em vários
momentos após o início dos sintomas. Seus
resultados sugeriram que as amostras de
saliva eram uma alternativa prática não
invasiva ao NPS na detecção de SARS-CoV-
2 usando RT-PCR.
Em conclusão, a detecção de Sars-CoV-2
usando amostras de saliva mostrou alta
sensibilidade e especificidade em
comparação com swabs nasofaríngeos.
 2. Estudar as imunoglobulinas.
Os anticorpos são proteínas globulinas,
portanto, utilizamos o termo
imunoglobulinas (Ig) para os anticorpos. As
proteínas globulinas são compactas e
relativamente solúveis.
As imunoglobulinas podem estar
conectadas à membrana ou secretadas.
Funções:
- Opsonização e fagocitose
- Ativação do complemento
- Citotoxicidade celular dependente de
anticorpo
- Neutralização de vírus
- Neutralização de substâncias
Estrutura do Anticorpo
Cada anticorpo possui pelo menos dois
sítios idênticos de ligação ao antígeno que
se ligam aos epítopos. O número de sítios de
ligação ao antígeno de um anticorpo é
chamado de valência do anticorpo. Por
exemplo, a maioria dos anticorpos humanos
tem dois sítios de ligação, sendo, portanto,
bivalentes.
Um monômero típico de anticorpo tem
quatro cadeias proteicas: duas cadeias leves
idênticas e duas cadeias pesadas idênticas.
As cadeias são unidas por ligações dissulfeto
e por outras ligações, a fim de formar uma
molécula em forma de Y. A molécula em
forma de Y é flexível e pode assumir a forma
de um T. As duas partes localizadas nas
terminações dos braços do Y são chamadas
de regiões variáveis (V), é nas regiões
variáveis onde vao ter as proteínas CDR1,
CDR2 e CDR3 que são análogos aos ‘’dedos
da mao’’ no sentido de ‘’segurar’’ os
antígenos. Essas regiões se ligam ao
epítopo.
A haste do monômero e as partes inferiores
dos braços do Y são chamadas de regiões
constantes (C). Elas são iguais para uma
classe particular de imunoglobulinas.
Existem cinco tipos principais de regiões C,
que são responsáveis pelas cinco principais
classes de imunoglobulinas.
Classe de Imunoglobulinas
➢ IgG
O nome IgG é derivado da fração
gamaglobulina do san gue. A IgG é
responsável por cerca de 80% de todos os
anticorpos no soro. Em locais de
inflamação, esses monômeros de
anticorpos atravessam as paredes dos
vasos sanguíneos e penetram no fluido
tecidual. Os anticorpos IgG maternos, por
exemplo, podem atravessar a placenta e
conferir imunidade passiva ao feto. Os
anticorpos IgG protegem contra bactérias e
vírus circulantes, neutralizam toxinas
bacterianas, ativam o sistema
complemento e, quando ligados a
antígenos, intensificam a eficácia das
células fagocíticas.
➢ IgM
Os anticorpos da classe IgM (o M refere-se
a macro, que reflete o seu tamanho
grande) compõem aproximadamente 6%
dos anticorpos no soro. A IgM tem uma
estrutura pentamérica formada por cinco
monômeros que são mantidos unidos por
um polipeptídeo, chamado de cadeia de
junção. O grande tamanho da molécula
impede que a IgM se desloque livremente,
como faz a IgG, de modo que anticorpos
IgM geralmente permanecem nos vasos
sanguíneos sem penetrar os tecidos ao seu
redor.
O fato de a IgM ser a primeira
imunoglobulina a aparecer na resposta a
uma infecção primária e possuir uma vida
relativamente curta confere um valor
singular à molécula no diagnóstico de
doenças. A detecção de IgG, que é de vida
relativamente longa, deve indicar apenas
que a imunidade contra um patógeno em
particular foi adquirida há mais tempo.
➢ IgA
IgA é responsável por apenas 13% dos
anticorpos no soro, mas é certamente a
forma mais comum encontrada nas
membranas mucosas e nas secreções do
corpo, como o muco, a saliva, as lágrimas e
o leite materno. Se levarmos isso em
consideração, a IgA é a imunoglobulina
mais abundante no corpo.
A forma circulante do IgA no soro, a IgA
sérica, é geralmente encontrada na forma
de um monômero. A forma mais efetiva da
IgA, no entanto, consiste em dois
monômeros conectados que formam um
dímero, chamado de IgA secretora. Ela é
produzida nessa forma pelos plasmócitos
localizados nas membranas mucosas –
cerca de 15 gramas por dia, principalmente
pelas células epiteliais intestinais.
Cada dímero, então, penetra e atravessa a
mucosa, onde adquire um polipeptídeo,
chamado de componente secretor, que a
protege da degradação enzimática. A
principal função da IgA secretora é
provavelmente impedir a fixação de
patógenos microbianos às superfícies da
mucosa.
A presença de IgA no leite materno,
sobretudo no colostro, provavelmente
auxilia na proteção dos recém-nascidos
contra infecções gastrintestinais.
➢ IgD
Os anticorpos IgD são encontrados no
sangue, linfa, e particularmente sobre a
superfície de células B. A IgD sérica não
tem função bem definida; quando
localizada sobre as células B ela auxilia na
resposta imune.
➢ IgE
As moléculas de IgE ligam-se firmemente
por suas porções Fc (hastes) aos receptores
localizados nos mastócitos e basófilos,
células especializadas que participam de
reações alérgicas.
Quando um antígeno, como o pólen, liga-
se aos anticorpos IgE associados a um
mastócito ou basófilo (ver Figura 19.1a, p.
517), essas células liberam histamina e
outros mediadores químicos. Esses
mediadores químicos desencadeiam uma
resposta – por exemplo, uma reação
alérgica, como a rinite alérgica.
A concentração de IgE é bastante alta em
algumas reações alérgicas e infecções
parasitárias, o que geralmente é útil do
ponto de vista diagnóstico.
3. Entender a construção da
resposta imunológica.
Resposta Imune Humoral – Mediada por
anticorpo
É preciso a ativação de células B e
produção de anticorpos.
As células B que ainda não estão ativas
possuem IgM e IgD nas suas membranas
para que com a presença de antígenos,
elas sejam ativadas.
- Localização das células B no linfonodo
Se localizam no folículo linfoide (zona de
células B), em uma região mais cortical dos
linfonodos.
No folículo linfoide, há a produção de uma
quimiocina, denominada CXCL13, pelas
células dendríticas foliculares do estroma
dessa região. As células B apresentam o
receptor CXCR5 que é específico para essa
quimiocina, e por isso migram para essa
região (quimiotaxia).
- Vias de liberação do antígeno para as
células B
Antígenos menores que 70kD alcançam a
zona de células B através de circuitos.
Antígenos maiores que 70 kD são levados
pelos macrófagos ou pelas células
dendríticas.
Células B endocitam, processam e
apresentam o antígeno por meio do
MHC II.
- Como a ativação das células B pelo BCR
(imunoglobulina de membrana) pode ser
aumentada?
1. Por proteínas do sistema complemento.
Por meio da C3d é identificada pelo
receptor CR2/CD21 que aumenta a
sinalização do BCR e, assim, causa a
proliferação e diferenciação da célula B.
2. Por ativação simultânea dos receptores
semelhantes Tolls (TLRs).
O receptor semelhante a Tolls que se ligam
aos PAMPs, expressos nas membranas dos
patógenos, os quais, juntamente com a
sinalização do BCR, ativam a proliferação e
diferenciação da célula B.
- Após a ligação ao antígeno, quais as
respostas funcionais da célula B para este
antígeno?
1. Aumento da expressão de Bcl2 – que é
uma proteína antiapoptótica, e aumenta a
proliferação da célula.
2. Aumento da expressão de B7 – que é
uma proteína que vai aumentar a interação
da célula B com a célula TC4.
3. Aumento da expressão de receptores de
citocinas, responsividade às citocinas.
4. Aumento da expressão de CCR7 – que
faz com que as células B migrem para a
área das células T onde terão as citocinas
CCL19 e CCL21 que são específicas para
esse receptor (quimiotaxia).
- Interação de células B e células T
auxiliares
- A importância do encontro das células B
e T no ambiente extrafolicular
1. ‘’Produção’’ de plasmócitos de vida
curta produtores de IgM de
afinidade baixa – quando as células
B não se encontram com as células
T, elas se transformam em
plasmócitos de vida curta.
2. Geração de células T auxiliares
foliculares (TFH).
3. Início da maturação da afinidade.
4. Início da troca de isótipo.
- O que acontece no Centro Germinativo?
Maturação da afinidade: Processo que
conduz ao aumento da afinidade de
anticorpos e antígenos. A ligação entre o
CD40L da célula T auxiliar (que já foi
ativada pela célula dendrítica) e o CD40 da
célula B induz um processo de mutação
somática dos genes de imunoglogulinas, os
quais fazem com que o sítio de ligação do
anticorpo com o antígeno fique mais
‘’perfeito’’ pro encaixe.
Entretanto, essa mutação pode ser
negativa, e por isso há a seleção de alta
afinidade.
Seleção de células B de alta afinidade:
acontece por meio da interação das células
B com as células dendríticas foliculares no
centro germinativo.

REFERÊNCIAS:
Essas células dendríticas foliculares
apresentam o antígeno para os linfócitos B,
e são selecionados aqueles cujo anticorpo
liga ao antígeno apresentado com alta
afinidade.
Troca de isótipo: Troca da expressão de
IgM para IgG (ou outros).
1. Artigo Scielo 2022 - A detecção de
SARS-COV-2 em cotonetes
nasofaríngeos e salivas usando
RT-PCR foi semelhante - Brazilian
Dental Journal
2. Microbiologia – Tortora
3. Microbiologia Médica - Murray

Geração de plasmócitos de vida longa

Plasmoblastos – circulação sanguínea

Plasmócito - medula óssea

Geração de células B de memória