A espectrofotometria — medida de absorção ou

transmissão de luz — é uma das mais valiosas técnicas

analíticas amplamente utilizadas em laboratórios de área
básica, bem como em análises clínicas.
 A fotometria-luz deve ser considerada em
termos de energia.

A quantidade de
energia é inversamente
proporcional ao
comprimento de onda

Propagação da energia radiante

Espectro
eletromagnético (EM):
intervalo completo da REGIÃO (λ) EM nm
radiação Raios X 0,1 – 100 nm
Ultravioleta 100 – 400 nm
eletromagnética, que Visível 400 – 700 nm
contém desde as ondas Infravermelho 700 nm – 100 µm
de rádio, as Microonda 100µm – 30 cm

microondas, o
infravermelho, a luz
visível, os raios
ultravioleta, os raios X,
até aos raios gama.
A capacidade que as diversas substâncias químicas têm de
absorverem luz em determinados comprimentos de onda pode
ser utilizada para a sua determinação quantitativa e qualitativa.

Ex: região ultravioleta e visível

Ex: região infravermelho

Como exemplos de aplicação, os raios X podem ser úteis na

determinação da estrutura tridimensional das proteínas,
enquanto que o infravermelho indica os tipos de ligações
químicas de moléculas orgânicas
Quando um feixe de luz monocromática
atravessa uma solução com moléculas
absorventes, parte da luz é absorvida pela
solução e o restante é transmitido. A absorção
de luz depende basicamente da concentração
das moléculas absorventes e da espessura da
solução – caminho óptico

Io I
I < Io
energia incidente energia emergente

espessura da solução l
Transmitância (T) Absorbância (A)

T = I / Io A = -log T = -log I / Io =
log Io / I
Se I = Io, T=1
Como I < Io, T < 1 (x100)
I0 I I0 I

ϵ = coeficiente de extinção molar

(absortividade; característica de cada substância para um dado comprimento de onda)
I0 I I0 I
c = concentração da solução
l = espessura da solução
Lei de Lambert-Beer

log Io/I = ϵ l log Io/I = ϵ c

A =ϵcl
 A absorbância é muito importante para análises quantitativas,
porque é diretamente proporcional à concentração de espécies
absorventes de luz na amostra.

Transmitância Absorbância

T = I / I0 A = -log T = -log I / I0 = log I0 / I

Se I = I0, T = 1
I < I0 (x100)

A quantidade de absorção (intensidade) é dependente da concentração do composto!

A curva de calibração é usada nas dosagens de amostras
desconhecidas. A solução padrão utilizada no preparo da
curva de calibração apresenta concentração exata de uma
substância conhecida que servirá como referência na
determinação fotométrica de concentrações desconhecidas
desta mesma substância.

Obtenção do fator
de calibração a
partir do complexo
albumina-biureto
O espectro de absorção é característico para uma determinada
substância. O comprimento de onda de absorção máximo da
albumina, por exemplo, é de 540 nm.
Objetivos da aula prática:

• Construir uma curva de calibração (padrão) da albumina

• Determinar a concentração da albumina em uma solução com

concentração desconhecida.
 Sem proteína albumina proteínas do soro

biureto