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Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297

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Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas

Página inicial do jornal:www.elsevier.com/locate/pest

Ecogenotoxicidade de concentrações de atrazina ambientalmente relevantes: uma

ameaça aos bioindicadores aquáticos

Vítor Ventura de Souzaa, Tatiana da Silva Souzab, José Marcello Salabert de Camposc, Luiza
Araújo de Oliveiraa, Yves Moreira Ribeirod, Daniela Chemin de Melo Hoyose, Rogéria Maura
Panzini Xaviere, Ives Charlie-Silvaf, Samyra Maria dos Santos Nassif Lacerdaa,*
a Laboratório de Biologia Celular, Departamento de Morfologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil
bLaboratório de Ecotoxicologia, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Espírito Santo, Alegre, RS, Brasil
cDepartamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, MG, Brasil
dLaboratório de Ictiohistologia, Departamento de Morfologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil

eDepartamento de Zootecnia, Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil
fDepartamento de Farmacologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil

ARTIGOINFO ABSTRATO

Palavras-chave: A atrazina (ATZ) é um herbicida frequentemente presente em águas superficiais, podendo resultar em danos à saúde de
Citogenotoxicidade diversos organismos, inclusive humanos. No entanto, a maior parte da literatura científica relata lesões causadas por ATZ em
Desenvolvimento
altas concentrações, que não são encontradas no meio ambiente. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar os impactos
Herbicida
de concentrações realistas de ATZ encontradas em águas superficiais (1, 2, 5, 10, 15 e 20 μg/L) usando os bioindicadoresAllium
Reprodução
cepa,dáfnia magnae peixe-zebra (Danio rerio). ATZ provocou um efeito genotóxico em
Água da superfície
A. cepa,manifesta-se pela indução de aberrações cromossômicas e efeito mutagênico com aumento da incidência de
formação de micronúcleos, promoção da morte celular e redução do tamanho nuclear revelado pela análise de
citometria de fluxo.D. magnaexpostos a 10, 15 e 20 μg/L de ATZ apresentaram redução significativa no tamanho do
corpo após 21 dias, atraso na liberação da primeira ninhada, diminuição da produção de ovos e da prole total, bem
como alterações no comportamento de natação. A exposição à ATZ promoveu alterações fisiológicas e de
desenvolvimento em embriões de peixe-zebra, incluindo aumento da taxa de movimentação espontânea, o que
levou à eclosão prematura em todas as concentrações investigadas. Aumento no comprimento total do corpo,
diminuição da área do saco vitelino, edema pericárdico e aumento da frequência cardíaca também foram detectados
em peixe-zebra tratado com ATZ. Em resumo, concentrações ambientalmente relevantes de ATZ podem induzir
alterações substanciais nos três bioindicadores investigados. Este estudo evidencia os efeitos deletérios da ATZ em
três bioindicadores aquáticos empregando técnicas estabelecidas e atuais,

1. Introdução No entanto, o Projeto de Lei nº 6.299/2002, em tramitação, se aprovado, afrouxará

O uso de agrotóxicos proporciona o controle de pragas e doenças que afetam
as lavouras, permitindo o aumento da produção e redução das perdas econômicas
(Savary e outros, 2019). No Brasil, o agronegócio é centrado nas monoculturas,
respondendo por 27,4% do PIB nacional (CEPEA, 2021 See More). O país tem se
destacado por ser um dos maiores consumidores de agrotóxicos do mundo
devido, em parte, à alta produtividade agrícola que visa atender à alta demanda
por alimentos em escala nacional e mundial e também à legislação permissiva (
Brovini et al., 2021;Araújo et al., 2022).
as regras para aprovação e comercialização de agrotóxicos, deixando o poder
decisório apenas para o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA); poder que até então também era exercido pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) e pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renováveis (IBAMA).
Como consequência direta dessa política, o alto consumo de agrotóxicos
tem causado impactos à saúde humana e ambiental, uma vez que princípios
ativos e seus derivados metabólicos têm sido frequentemente relatados no
meio aquático, sendo assim poluentes encontrados em

* Autor correspondente.
Endereço de email:samyranassif@ufmg.br (SMS Lacerda).

https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2022.105297
Recebido em 9 de setembro de 2022; Recebido no formulário revisado em 26 de outubro de 2022; Aceito em 21 de novembro de 2022
Disponível online em 25 de novembro de 2022
0048-3575/© 2022 Publicado por Elsevier Inc.
VV Souza e cols.
grande escala (Dar et al., 2022a;Dar et al., 2022b;Merola e outros, 2022;
Ulrich et al., 2022;Saha et al., 2021;Sharma et al., 2021;Syafrudin et al., 2021;
Albuquerque e outros, 2016;Bernardes e outros, 2015). É o caso da Atrazina
(ATZ), um herbicida organoclorado seletivo do grupo químico das triazinas e
indicado para o controle pré-emergente e pós-emergente precoce de
plantas daninhas que afetam culturas como cana-de-açúcar, milho e sorgo.
Devido aos seus efeitos tóxicos conhecidos para organismos não-alvo, que
incluem desregulação endócrina, toxicogenicidade e toxicidade reprodutiva.
Rodríguez-Robledo e outros, 2022;Wang e outros, 2022; Blahova e outros,
2020), sua presença na água é principalmente monitorada por órgãos
ambientais e de saúde humana. No Brasil, o limite máximo permitido em
águas destinadas ao abastecimento de água e proteção da vida aquática,
bem como na água potável é de 2 μg/L, valor estabelecido pela Resolução nº
375 do Conselho Nacional do Meio Ambiente e pela Portaria nº 2.914/ 2011
do Ministério da Saúde. A título de comparação, o limite máximo permitido
na água pela União Europeia, onde a ATZ é atualmente banida, é de 0,1 μg/L
(União Europeia, 2009).
Estudos de ecogenotoxicidade demonstraram que ATZ em
concentrações ambientais é capaz de induzir alterações na osmolaridade
plasmática dos íons sódio e cloro, interrompendo a liberação do hormônio
LH, estimulando a expressão de genes relacionados à biossíntese de
hormônios esteróides e ativando a atividade de enzimas antioxidantes.
Cleary e outros, 2019;Weber, 2013;Paulino e outros, 2012;Santos e outros,
2012;Hayes e outros, 2006). Além dos efeitos deletérios, o ATZ alterou o ciclo
celular, inibindo a síntese de ciclina B e E, interrompendo as células na fase S
do ciclo celular, causando alterações na funcionalidade das mitocôndrias e
aberrações cromossômicas.Bautista et al., 2018;Felisbino e outros, 2018;
Cleary e outros, 2019;Ventura-Camargo et al., 2016;Wirbisky et al., 2016).
A fim de explorar melhor os riscos potenciais de contaminação por ATZ,
este estudo relata os efeitos deletérios de concentrações ambientalmente
relevantes do herbicida na água usando diferentes bioindicadores e
múltiplos biomarcadores de toxicidade. A atividade citogenotóxica de ATZ foi
estimada usando o teste de aberrações cromossômicas emAllium cepa, que
se correlaciona fortemente com outros sistemas de teste, como roedores e
linfócitos humanos (Nielsen e Rank, 1994;Grant, 1994). Dados adicionais
sobre a interferência da ATZ na cinética do ciclo celular e na indução da
morte celular foram obtidos usando a técnica de citometria de fluxo, que foi
escolhida como técnica padrão por nosso grupo de pesquisa (Fioresi e
outros, 2020;Andrade-Vieira et al., 2012). Ensaios de toxicidade aguda e
crônica foram realizados comdáfnia magna, por meio do qual exploramos
ainda mais a ação da ATZ no comportamento natatório desse
microcrustáceo. A partir do teste de toxicidade embrionária e larval com
zebrafish (Danio rerio), que possui alta homologia genética com humanos (
Pei e Strauss, 2013), inferimos os efeitos letais, cardiotóxicos e neurotóxicos
da ATZ, além de investigar alterações morfofisiológicas. Finalmente, a partir
da análise de bioinformática, fomos capazes de demonstrar forte interação
de ATZ com diferentes membros do citocromo P450, família 19, subfamília A
e enzima relacionada ao estresse oxidativo em peixe-zebra.
2. Materiais e métodos
2.1. Pesticida
atrazina (1-cloro-3-etilamino-5-isopropilamino-2,4,6-triazina,
CAS n◦48.085, 99,6% de pureza, 215,68 g/mol) foi adquirido da Sigma-Aldrich.
A solução estoque utilizada foi feita com: dois microlitros de solvente
acetona para diluir 20 mg/L−1de Atrazina. As seguintes concentrações foram
testadas: 1, 2, 5, 10, 15 e 20 μg/L. Esta faixa de concentração foi estabelecida
com base nas concentrações ambientalmente realistas encontradas em
águas potáveis e superficiais (1, 5 e 10 μg/L) (SISÁGUA, 2018;Vieira e outros,
2017;Moreira e outros, 2012;Wu e outros, 2009); e águas pluviais e
subterrâneas (15 e 20 μg/L) (Moreira e outros, 2012;Kolpin e outros, 1998)
no Brasil e nos EUA. Além disso, a Resolução n.◦375 do Conselho Nacional do
Meio Ambiente (CONAMA,
2
Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297
2021) estabelece que 2 μg/L é o valor máximo permitido para águas
superficiais classes I e II (para abastecimento humano após tratamento e
proteção de comunidades aquáticas). Tal concentração também é
estabelecida pela Portaria nº 2.914/2011 do Ministério da Saúde que dispõe
sobre o controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano (
BRASIL, 2011). Notavelmente, as concentrações de ATZ testadas no presente
estudo também foram relatadas em água doce em outros países (Wang e
outros, 2020;Hansen e outros, 2019;Almberg et al., 2018;Benítez-Díaz e
Miranda-Contreras, 2013;Rinsky e outros, 2012;Rohr e McCoy, 2010).
2.2. Ensaios com A. cepa
Sementes deA. cepa(2n = 16) do mesmo lote e variedade (Baia
Periforme). Para todos os ensaios, água mineral (Ingá®)e metanossulfonato
de metila (MMS 0,4 mM) foram usados como controle negativo e positivo,
respectivamente.
2.2.1. Ensaio de citogenotoxicidade
Sementes deA. cepaforam colocados em placas de Petri (150×15 mm)
forrado com papel filtro umedecido com 5 mL de água para cada
tratamento. As placas de Petri foram cobertas com filme plástico para evitar
a evaporação de seu conteúdo e incubadas a 24◦C na escuridão em uma
câmara de crescimento em 24±1◦C por 96h.
Para as análises microscópicas, metade das raízes de cada concentração
foram fixadas em álcool etílico: ácido acético (3:1,v/v) e estocados em - 20◦C.
A outra metade das raízes foi transferida para uma nova placa de Petri com
filtro de papel umedecido com água mineral por 24 h – tratamento de
recuperação. Em seguida, as raízes foram lavadas três vezes em água
destilada por 5 min, hidrolisadas em HCl 1 N por 8 min a 60◦C, e lavados
novamente em água destilada, três vezes. As pontas das raízes foram
submetidas ao reagente de Schiff por 2 h no escuro e lavadas para remoção
completa do reagente. Os meristemas foram seccionados em lâmina,
contracorados com gota de carmim acético 2%, cobertos com lamínula e
triturados. O material foi analisado em microscópio de luz com aumento de
1000×.Para cada tratamento, foram contadas 5.000 células (500 células em
10 lâminas).
O potencial citotóxico da ATZ foi analisado pelo cálculo do índice mitótico
(número de células em mitose×100/número total de células) e pelo índice de
fase (número de células na fase mitótica específica× 100/número total de
células em mitose). O potencial genotóxico foi avaliado pela contagem de
anormalidades mitóticas e cromossômicas. Micronúcleos meristemáticos
(MN) foram contados para determinar o potencial mutagênico da ATZ em
concentrações ambientalmente relevantes. Para a análise de micronúcleos
em células F1 (localizadas 1 cm acima do meristema), a metodologia
proposta porMa et al. (1995)foi realizada.
2.2.2. citometria de fluxo
Para citometria de fluxo, três placas de Petri foram preparadas para cada
tratamento e 3 meristemas por placa foram dissecados em uma placa mantida
sob gelo contendo 800 μL de tampão de lise celular LB01. Os meristemas foram
triturados com o auxílio de uma lâmina de bisturi, liberando os núcleos em
solução. A solução foi aspirada através de duas camadas de gaze e coletada em
um tubo de isopor. As suspensões foram filtradas com malha de náilon de 45 μm
para eliminar a maior parte dos resíduos obtidos. As amostras foram então
coradas com 50 μL de iodeto de propídio (1 μg/mL) para análise no citômetro de
fluxo BD FACSCanto II. Foram determinadas as frequências dos núcleos nas fases
G0/ G1, S e G2/M. Partículas sub-G1 (populações de células com menor
intensidade de fluorescência do que os núcleos G1) também foram analisadas. A
intensidade de fluorescência dos núcleos em G1 (Figura 1) foi medido. As
variações na medição do conteúdo de DNA foram expressas como o coeficiente de
variação de G1 (CVG1) = desvio padrão dividido pela média. O tamanho relativo dos
núcleos em G1 foi identificado pelo detector de fluorescência direta (forward
scatter – FSC) e a complexidade (granularidade e/ou densidade nuclear/celular)
dos núcleos em G1 pelo detector de luz de espalhamento lateral (side scatter –
SSC ).
VV Souza e cols.
Figura 1.Ciclo celular deA. cepa. A–F Ciclo celular normal (A. Interfase; B. Prófase; C. Prometáfase; D. Metáfase; E. Anáfase; F. Telófase). GP Anormalidades nucleares e alterações do ciclo
celular após exposição ao ATZ (G. Núcleos irregulares; H. Broto nuclear (cabeça de seta); I. Atraso do ciclo; J. Perda cromossômica (cabeça de seta); K. Aderência cromossômica; L. Morte
celular; M. Anáfase pontes; N. Micronúcleo em células meristemáticas (cabeça de seta); O. Micronúcleo em células F1 (ponta de seta).
2.3. Ensaios de ecotoxicidade com D. magna
As fêmeas deD. magnaforam adquiridos pelo Laboratório de
Aquacultura (LAQUA) da Escola de Veterinária da Universidade Federal de
Minas Gerais. Para testes de toxicidade aguda e crônica, fêmeas
partenogenéticasD. magnaenvelhecido<24 h de idade foram distribuídas
individualmente em copos de vidro (n=10) contendo 25 mL de diferentes
concentrações de ATZ e controles (água mineral e ATZ a 1 mg/L foram
usados como controles negativo e positivo, respectivamente).
O teste de toxicidade aguda foi realizado de acordo com o protocolo
ABNT NBR 12713:2016. Os microcrustáceos foram expostos por 48 horas em
condições estáticas. Após esse período, os organismos imobilizados foram
contados e os resultados foram expressos em porcentagem de organismos
imóveis. O teste de toxicidade crônica durou 21 dias, durante os quais os
microcrustáceos foram mantidos em câmara incubadora a 20±2◦C e 16 h de
luz: 8 h de fotoperíodo escuro.D. magnafoi alimentado diariamente com a
microalgaRaphidocelis subcapitata. O sistema adotado foi o semi-estático,
no qual a solução teste era renovada a cada dois dias (Dávila, 2020 See More
). A análise físico-química da água onde os organismos foram mantidos foi
realizada de acordo comAtique et al. (2020)e as condições dos ensaios são
apresentadas na Tabela S1. As observações foram feitas diariamente a partir
do 9º dia. A idade primípara foi avaliada registrando-se a idade dos pais na
primeira reprodução (Não, Teste da OCDE, 2012). A fertilidade foi traduzida
no número médio de recém-nascidos produzidos por mulheres. O diâmetro
do corpo deD. magnafêmeas (pais) também foi medido no final do
experimento. A fim de descobrir se os distúrbios induzidos por ATZ no
sistema nervoso central desencadeiam efeito letárgico ou alta excitabilidade,
as respostas comportamentais deD. magnanatação foram avaliados por
meio de gravações de vídeo no vigésimo primeiro dia. Para isso, foi utilizado
um sensor de 64MP 1/1,72 pol. com pixels de 0,8 μm e câmera com lente de
abertura f/1,8 de 26 mm (DXOMARK Camera-A71 Samsung). Antes de cada
gravação, havia uma espera de vinte minutos para evitar comportamentos
anormais de natação causados por transporte e/ou flutuações luminosas.
Os vídeos foram analisados nohttp://emphazis.org/software e os seguintes
parâmetros foram medidos: área percorrida, velocidade de nado e distância
total percorrida.
2.4. Teste de toxicidade aguda em embrião de peixe
Os testes de toxicidade embrionária em zebrafish (Danio rerio) eram
3
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realizada usando um método FET modificado, diretriz 236 da OCDE (Não, Teste da
OCDE, 2013). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as
Diretrizes de Cuidados com a Saúde Animal e foram aprovados pelo Comitê de
Ética em Pesquisa Animal local (CEUA-UFMG, Brasil, 353/2018). As fêmeas e
machos da linhagem zebrafish foram adquiridos pelo LAQUA na Escola de
Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, sendo mantidos no
Laboratório de Peixes Ornamentais. Os peixes-zebra adultos foram mantidos em
aquários de 20 L com 10 a 20 peixes cada, com uma distribuição sexual entre
fêmeas e machos de 1:2. O ritmo claro-escuro foi de 14h10 e a temperatura da
água foi de 27±1◦C. Para o teste, foi utilizada água de poço artesiano (controle
negativo) e 3,4-dicloroanilina (3,4-DCA) a 4,0 mg/L (controle positivo), conforme
recomendado pelaLammer (2009).
Após a desova, os ovos foram coletados usando um prato coberto com grade
e apenas os ovos fertilizados no máximo no estágio de 18 células sem
irregularidades óbvias durante a clivagem foram selecionados para o teste de
toxicidade embrionária. Os ovos foram distribuídos aleatoriamente em placas de
micropoços com 24 poços em cada placa, cada poço contendo um embrião, e
foram expostos a diferentes concentrações de ATZ. Vinte ovos foram usados para
cada grupo, o teste foi realizado em duplicata. Metade das soluções de teste em
todos os grupos foram substituídas diariamente drenando suavemente cada
câmara e adicionando novas soluções lentamente para evitar perturbar os
embriões. A temperatura da água durante o FET foi de 27±1◦C e o fotoperíodo
diário foi de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Os peixes foram avaliados
24, 48, 72 e 96 h pós-fertilização (hpf). A determinação da letalidade incluiu:
coagulação do embrião, ausência de formação de somitos, não desprendimento
da cauda e ausência de batimentos cardíacos. O parâmetro de movimentos
espontâneos por minuto foi analisado em 24hpf. A análise dos batimentos
cardíacos por minuto e taxa de eclosão foi realizada a 48hpf. Larvas de zebrafish a
96hpf foram fotografadas em microscópio óptico (Olympus IX-70) a 4×
magnificação e analisados morfologicamente com o programa ImageJ 1.51j8. A
partir das imagens realizadas, foram medidos os seguintes parâmetros:
comprimento total da larva, altura da cabeça, distância entre os miócitos, além do
pericárdio, saco vitelino e área ocular.
2.5. Análise in silico
Para investigar as interações previstas entre ATZ e as moléculas-alvo do
peixe-zebra, a construção de rede e a análise de enriquecimento de
anotação funcional foram realizadas usando o STITCH 4.0 Resource (htt p://
stitch.embl.de). A rede foi construída para avaliar os modos possíveis
VV Souza e cols. Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297

de ação do herbicida, considerando a espessura das linhas na rede (linhas
mais grossas representam associações mais fortes). Além disso, linhas e,
para arestas direcionadas, setas de cores diferentes representam diferentes
tipos de arestas na visualização de ação: ligar (azul), ativar (verde), inibir
(vermelho), catálise (magenta), mesma atividade (ciano), e reação (preto) (
Kuhn e outros, 2007). A significância estatística foi determinada pela
correçãop-valor<0,05 usando o teste de Bonferroni. Consideramos apenas
os caminhos mais curtos (permitindo um máximo de cinco interações com a
pontuação de confiança mais alta>0,8 para garantir um alto nível de
confiança para a interação).
Para avaliar os efeitos de potenciais interações entre ATZ e seus possíveis
alvos em peixe-zebra, usamos um sistema baseado em quimiogenômica chamado
ChemDIS-Mixture (Tung et al., 2018), que está disponível usando o banco de dados
STITCH (Szklarczyk et al., 2016) (tabela 1). Para permitir a inferência de efeitos
induzidos por ATZ, foram extraídas possíveis proteínas de interação e realizada
análise de enriquecimento com base em um teste hipergeométrico para
identificar os termos GO (Gene Ontology) enriquecidos com um ajustep-valor<0,05
usando o teste de correção múltipla de Benjamini-Hochberg.
2.6. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas usando o software BioEstat 5.3. A
avaliação da distribuição dos dados em relação à normalidade foi realizada pelo
teste de Lilliefors, enquanto a homogeneidade da variância foi avaliada pelo teste
de Cochran. Como os dados não apresentaram distribuição normal ou
homogeneidade, eles foram analisados por meio do teste não paramétrico de
Mann-Whitney (p <0,05). Os resultados foram expressos como média±desvio
padrão. Corel Draw®X7, Biorender (https://biorender.com) e o Microsoft Power
Point foram usados para o design da figura.
tabela 1
Análise de enriquecimento funcional para investigação dos processos biológicos
envolvidos na interação entre Atrazine e Zebrafish com suas diferentes moléculas-
alvo.
Função molecular (GO)
ID do caminho Descrição do caminho Eu conto com
conjunto de genes
3 Resultados e discussão
3.1. ATZ causa efeitos genotóxicos e mutagênicos em A. cepa
mesa 2mostra o índice mitótico e o índice de fases nas células da raiz de
A. cepa. ATZ a 10, 15 e 20 μg/L induziu índices mitóticos significativamente mais
altos em comparação com o controle negativo. Notavelmente, esse efeito persistiu
após o tratamento de recuperação de 24 horas, quando um aumento na
frequência de proliferação celular foi evidenciado em todas as concentrações
investigadas. Índice mitótico aumentado e diminuído indicam proliferação celular
desordenada (Leme e Marin-Morales, 2009) devido à interação química com
proteínas específicas envolvidas na progressão do ciclo celular, incluindo DNA e
RNA polimerases, DNA girase e quinases (Türkoğlu, 2012).
Além disso, ATZ induziu mudanças na frequência de fases específicas da
divisão celular. Em relação ao tratamento contínuo, ATZ a 1 e 2 μg/L
aumentou significativamente a porcentagem de células na telófase.
Frequências mais altas de células em metáfase e anáfase foram relatadas
após exposição a ATZ a 10 μg/L. A 15 e 20 μg/L, ATZ induziu uma maior
frequência de células em prófase, metáfase e anáfase em comparação com
o controle negativo (mesa 2). Mesmo após 24 h de tratamento de
recuperação, foi detectado aumento na porcentagem de células em prófase
para todos os grupos expostos à ATZ. Por outro lado, maiores frequências
de células em anáfase foram observadas em raízes expostas a 10 a 20 μg/L
de ATZ, enquanto que a 15 μg/L a porcentagem de células em telófase
aumentou significativamente. Nossos achados estão de acordo comEl-
Ghamery et al. (2000)que relataram que ATZ pode aumentar a frequência de
fases particulares da divisão celular, principalmente prófase e metáfase. A
parada da prófase está associada a erros no reparo do DNA ou inibição da
polimerização da tubulina para a montagem do fuso mitótico.Grondona et
al., 2018;Adeyemo e Ayomide, 2013;Türkoğlu, 2012). Além da inibição do
arranjo do fuso mitótico, a parada da metáfase também pode ser atribuída à
inibição do complexo promotor da anáfase, que promove a transição
metáfase-anáfase (APC/C) (Lub, 2016). Da mesma forma, a parada anáfase-
telófase pode indicar a interferência de ATZ em proteínas envolvidas na
progressão da fase M.
El-Ghamery et al. (2000)mostraram que ATZ é um inibidor da proliferação
celular em meristemas radiculares deA. cepaeVicia fabaquando usado em
altas concentrações (3,75 g/L). Ventura e Marin-Morales relataram os
mesmos efeitos nas raízes deA. cepa. Portanto, é razoável supor que o
aumento do índice mitótico observado a partir da exposição à ATZ possa ser
Falsa descoberta devido ao acúmulo de células em fases específicas, causado por uma parada
do ciclo celular.
avaliar

IR ligação heme 2 0,0183 A genotoxicidade da ATZ em modelos de plantas foi previamente

0020037 demonstrada (Felisbino e outros, 2018;Ventura-Camargo et al., 2016;El-Ghamery
et al., 2000). Nossos achados corroboram esse efeito deletério uma vez que o ATZ
via KEGG causou um aumento significativo na frequência de células aberrantes, tanto no
ID do caminho Descrição do caminho Eu conto com Falsa Descoberta
tratamento contínuo quanto no de recuperação (Tabela 3). Embora 24 horas de
conjunto de genes avaliar

00140 Biossíntese de hormônios esteróides 2 0,0183 recuperação não tenham sido suficientes para reduzir a atividade genotóxica do
herbicida, de acordo comVentura-Camargo et al. (2016), um período de 48 horas
de recuperação parece ser mais eficiente.
domínios de proteína PFAM
ID do caminho Descrição do caminho Eu conto com Falsa descoberta As frequências de alterações específicas evidenciadas emA. cepacélulas
conjunto de genes avaliar radiculares expostas a ATZ são demonstradas emTabela 3.Figura 1mostra
PF00104 Domínio de ligação ao ligante nuclear 3 0,00443 micrografias representativas das fases do ciclo mitótico normal deA. cepa (Figura
receptor de hormônio
1A–F) e as principais anormalidades celulares identificadas após 96 h de exposição
PF00105 Dedo de zinco. C4tipo (dois domínios) 3 0,00443
à ATZ, ou seja, núcleos irregulares (Figura 1G), um indicativo de processos
celulares de morte (Leme e outros, 2008); botões nucleares (Figura 1H),
Domínios e características da proteína INTERPPO
freqüentemente derivados de quebras ou perdas cromossômicas (Lindberg e
ID do caminho Descrição do caminho Eu conto com Falsa descoberta
conjunto de genes avaliar
outros, 2007); cromossomos retardatários (Figura 1I) e perdas cromossômicas (
IPR016355 Família de receptores de hormônio nuclear 5 3 2.07e-06 Figura 1J) originou-se de distúrbios no fuso mitótico (Leme e outros, 2008); e
IPR000536 Ligante de receptor de hormônio nuclear 3 0,00483 aderência cromossômica (Figura 1k) denotando condensação anormal das fibras
domínio de ligação
cromossômicas, inativação dos fusos, quebras cromossômicas e subsequente
IPR001628 Hormônio nuclear do dedo de zinco 3 0,00483
formação de pontes anáfase-telófase (El-Ghamery et al., 2000;Pathak et al., 1975;
tipo receptor
IPR001723 Receptor de hormônio nuclear 3 0,00483 McGill e outros, 1974). A aderência cromossômica é regularmente conhecida por
IPR013088 Dedo de zinco. NHR/GATA tipo U2 3 0,00512 ser um dano irreversível, levando à morte celular.Fiskesjö, 1985). No entanto,
IPR003603 A/fosfoproteína 32 família A. 2 0,00702 células em processo de morte (Figura 1L), caracterizada morfologicamente como
C-terminal
células necróticas (de Ventura-

4
VV Souza e cols. Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297

mesa 2
Índice de fase do ciclo celular (%) e índice mitótico (%) emA. cepaexpostos à atrazina, antes e após 24 h – recuperação.

Tempo de exposição Tratamentos Interfase Prófase Metáfase Anáfase Telófase índice mitótico

NC 88,66 4.14 3.42 3.46 0,32 64.13±10.13

PC 85,71 3,96 5,78 3,98 0,57 61,75±9.87
1 μg/L 87,96 3,85 4.02 3,09 1.08 * 62,5±5.31
2 μg/L 88.09 3.21 3,77 4.04 0,89 * 67,5±4,40
96 h - tratamento contínuo 5 μg/L 87,54 3,98 3,85 4,59 0,51 63,5±5,60
10 μg/L 84.02 4,78 5.26 * 5.02 * 0,92 75,5±7.03 *
15 μg/L 81,98 6.01* 6,09* 5.44 * 0,48 76,87±9,65*
20 μg/L 81.16 6.12* 6,78 * 5,58 * 0,46 83,25±6,62*
24h – recuperação NC 87.11 3,87 4.01 4.12 0,89 65.13±7.32
PC 86,71 3,75 5.02 * 4.18 0,35 * 63,44±4.11
1 μg/L 80,62 11.16* 3.11 4,45 0,66 82.12±3,87*
2 μg/L 82,47 9,48 * 3.22 4.26 0,57 81,92±1,29*
5 μg/L 81,89 10.19* 3.06 4.08 0,78 80,89±6.10*
10 μg/L 83.13 7.04 * 3,56 5.44 * 0,83 84,87±4,25*
15 μg/L 82,98 7,56 * 3.52 5,57 * 0,37 * 86,41±6.22*
15 μg/L 82,98 7,56 * 3.52 5,57 * 0,37 * 86,41±6.22*
20 μg/L 81,35 8.18* 4.07 5,89 * 0,51 87,45±5.21*

NC: controle negativo – água mineral Ingá®.PC: controle positivo - MMS 0,4−milímetros. Valores seguidos de * são estatisticamente diferentes do controle negativo (Mann-
Whitney;p <0,05).

Camargo et al., 2011), bem como pontes anafásicas (Figura 1M) foram confirmados
somente após o tratamento de recuperação de 12 horas em todos os grupos ATZ (Tabela
3).
Além das células aberrantes, também foram observados micronúcleos em
células meristemáticas (Figura 1N) e células F1 (Figura 1O) após a exposição ao
ATZ. ATZ em todas as concentrações ambientalmente relevantes testadas induziu
maior frequência de micronúcleos em comparação com o controle negativo (
Tabela 3). Além disso, verificamos que esse dano causado pelo herbicida pode ser
herdado pelas gerações celulares subsequentes. A formação de micronúcleos
pode ocorrer por quebras cromossômicas durante o processo de divisão celular
(ação clastogênica), ou perda cromossômica devido a problemas na formação do
fuso mitótico (ação aneugênica) (Hintzsche et al., 2017). Como a maioria das
aberrações observadas nas células meristemáticas deA. cepaestão relacionados a
falhas da maquinaria mitótica, os micronúcleos induzidos pela ATZ poderiam
provavelmente resultar de sua ação aneugênica e clastogênica.
3.2. ATZ interrompe a cinética do ciclo celular e induz a morte celular em Allium cepa
A análise de citometria de fluxo endossou que ATZ alterou a progressão do ciclo
celular emA. cepacélulas da raiz. Os efeitos deletérios observados foram induzidos após o
tratamento contínuo e persistiram após o tratamento de recuperação. Os resultados são
mostrados emTabela 4e histogramas representativos das análises de citometria de fluxo
são representados emFigura 2.
As três maiores concentrações (10, 15 e 20 μg/L) de ATZ induziram um
aumento na porcentagem de núcleo na fase S do ciclo celular, embora isso
não tenha refletido em um aumento na porcentagem de núcleos em G2/ M.
Freeman e Lane Rayburn (2006)relataram que ATZ poderia aumentar a
porcentagem de núcleos na fase S e diminuir os núcleos na fase G2 na linha
celular CHO. A exposição in vitro à ATZ também promoveu o acúmulo da
fase S nas células HepG2, e esse efeito foi correlacionado com a regulação
negativa das ciclinas E (expressa no final da fase G1) e B (regula as fases G2/
M), que induziram a desaceleração no final da um ciclo celular com
subseqüente acúmulo de fase S no segundo ciclo (Powell e outros, 2011). No
estudo atual, observações de atraso na síntese de DNA, bem como uma
parada no ciclo devido à interrupção da divisão celular em estágios
específicos, podem apoiar que o ATZ retarda o ciclo celular.
A exposição a todas as concentrações de ATZ aumentou significativamente a
frequência de partículas sub-G1 que representam fragmentos celulares e
nucleares, cromossomos liberados em solução ou quaisquer detritos celulares
que, em contato com o iodeto de propídio, emitem fluorescência. No entanto, eles
são observados abaixo da intensidade de fluorescência em G1, pois geralmente
representam partículas menores que um núcleo intacto em G1 (Souza e outros,
2020;Andrade-Vieira et al., 2012), denotando a ocorrência de morte celular (
Andrade-Vieira et al., 2012). Os mesmos efeitos foram observados em análises de
A. cepacélulas expostas a imidacloprida, iprodiona e misturas de
os dois pesticidas (Fioresi e outros, 2020), bem como para outros
xenobióticos (Ghosh e outros, 2016;Andrade-Vieira et al., 2012). Semelhante
ao estudo atual,Fioresi et ai. (2020)relataram o aumento de partículas sub-
G1 concomitante à redução da frequência de núcleos em G2/M, apontando
que a ativação significativa de mecanismos de morte celular pode alterar a
proporção de células em proliferação.
A análise de FSC (diâmetro nuclear), SSC (complexidade) e intensidade de
fluorescência dos núcleos em G1 (Figura 1) também podem representar
indicadores do processo de morte celular (Andrade-Vieira et al., 2012). A
diminuição do FSC foi evidenciada nos tratamentos com as três maiores
concentrações de ATZ (10, 15 e 20 μg/L). A análise FSC detecta um valor médio de
diâmetros nucleares menores do que no controle negativo, ou seja, núcleos
fortemente condensados, um dos primeiros estágios do processo de morte celular
(Andrade-Vieira et al., 2012). ATZ em 10, 15 e 20 μg/L também levou a uma
diminuição na intensidade média de fluorescência dos núcleos em G1. Esse efeito
também pode estar associado à condensação nuclear que impede a entrada do
corante usado para medir o conteúdo de DNA (iodeto de propídio). SSC, ou seja, a
densidade nuclear foi reduzida apenas pela maior concentração de ATZ (20 μg/L).
Como subpartículas G1, FSC,Figura 1e SSC são parâmetros de morte celular, os
resultados obtidos por citometria de fluxo suportam a análise citogenética onde o
aumento da freqüência de células aberrantes, principalmente aderência
cromossômica (tratamento contínuo) e células necróticas (tratamento de
recuperação) mostraram o efeito tóxico de ATZ sobre
A. cepameristemas.
O coeficiente de variação dos núcleos em G1 representa o quanto o
citômetro de fluxo está identificando núcleos nesta fase do ciclo celular com
variação na quantidade de DNA. Um aumento neste coeficiente indica a
presença de núcleos, geralmente com alterações, como quebras de DNA e
geração de fragmentos perdidos, perda de cromossomos, cromossomos
aderentes que dificultam a entrada do iodeto de propídio, entre outras
alterações (Fioresi e outros, 2020;Andrade-Vieira et al., 2012;Rayburn e
Wetzel, 2002). Todas as concentrações de ATZ investigadas no presente
estudo induziram um aumento no CV. A observação de alterações
cromossômicas e micronúcleos na análise citogenética corrobora os
incrementos de CV aqui relatados, também para todas as concentrações.
3.3. ATZ inibe o crescimento somático e a reprodução de Daphnia magna
Nenhuma concentração de ATZ investigada induziuD. magnaimobilidade após
48 horas de exposição. No entanto, ATZ em 10, 15 e 20 μg/L aumentou
progressivamente o número de dias necessários para a liberação da primeira
ninhada, mostrando um atraso médio de 1,6, 2,7 e 3,3 dias, respectivamente (
Tabela 5). Além disso, ATZ a 5, 10, 15 e 20 μg/L reduziu significativamente o
número total de neonatos gerados durante 21 dias de exposição ao herbicida e
inibiu o crescimento deD. magna, levando a uma redução de>15% do

5
 Tabela 3
Índice de aberrações cromossômicas e micronúcleos emAllium cepacélulas radiculares após exposição ao ATZ por 96 h e após 24 h de recuperação.
VV Souza e cols.

Tratamentos Aberrante Aberrante MN MN R MN F1 MN F1 R Irregular cromossômico Nuclear cromossômico Atrasado cromossômico Célula anafásica
células células R Núcleos ponte broto perda telófase adesão morte R pontes R

NC 0,375± 0,21±0,39 012± 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0,32±0,52 0±0 0±0 0±0 0±0
0,51 0,35
PC 31.25± 28.11± 7,75± 3.12± 3.25± 5.21± 0±0 18h37±0,52 4,87± 11.26±0,57 0,76±0,67 6.43±1,82* 0±0 0±0
4.26* 5,63* 1,83* 1.12* 1.16* 1.19* 0,99
1 μg/L 24.37± 8.87± 7.25± 0±0 1.25± 2.03± 1,85±0,46 5.87±1,55* 1.3± 8.84±0,96* 5.14±1.16* 1.18±0,75 5.12± 3,75±0,29*
3.33* 2,64* 1.16* 0,46* 1,67* 0,11 0,81*
2 μg/L 23.37± 7,75± 7.5± 0,09± 2.37± 3.06± 2.5±1.07 6±1,55* 1.03± 7.45±1,04* 5.37±0,95* 1.31±0,51 4,86± 2.89±1.21*
2,72* 1,98* 1,41* 0,03 1,06* 1,41* 0,32 0,61*
5 μg/L 18h25± 10.25± 9.02± 0,13± 2.62± 3,78± 7.62± 2.12±1,64 6.37± 2.36±1,58 3,87±1,64 1.37±1,59 6.63± 3.62±1,08*
5.09* 1,98* 2.39* 0,58 0,74* 2.18* 1,06* 0,78* 0,95*
10 μg/L 14.62± 16h25± 10.37± 0,89± 4.12± 3.22± 12.12± 2±1.19 7.37± 0,81±0,37 0,5±0,61 1.625±0,74* 8.86± 7,89±2.14*
3,99* 2,71* 2.38* 0,25* 1,35* 1,56* 3,90* 2.38* 1,77*
15 μg/L 32.37± 34,5± 13.87± 1.01± 3.5± 4.22± 15.62± 1,62±0,74 13.3± 0,62±0,51 0,37±0,55 13.62±2,55* 24.86± 9.64±3,81*
9,65* 7,59* 2,47* 0,13* 1,30* 1,93* 6.09* 4.02* 5,59*
20 μg/L 51.37± 27.87± 14.87± 1.18± 3,87± 4.12± 16.87± 1,5±0,77 21.7± 1,5±0,53 0,5±0,59 9.12±2.23* 16.41± 11.46±1,87*
5.28* 8,79* 2,35* 0,21* 3.04* 1,87* 1,55* 1,90* 3.26*

NC: controle negativo – água mineral Ingá®.PC: controle positivo - MMS 0,4−milímetros. MN: micronúcleos. MN F1: micronúcleos em células não meristemáticas. R: 24h de recuperação. Médias seguidas de * são estatisticamente diferentes do
controle negativo (Mann-Whitney;p <0,05).

6
Tabela 4
Análise por citometria de fluxo em células meristemáticas deA. cepaexpostos a ATZ.
RFIG 1 RcvG1
Tratamentos s.-G1 Rs.-G1 G1 RG1 S RS G2/M RG2/M FSC RFSC SSC RSSC FIG1 cvG1

NC 1.81 2.34 64,56 66,89 18.29 17.34 15.34 13.43 100 100 100 100 100 100 2,79 2,90
PC 45,11* 52,67* 40,21* 33,89* 12h34* 8,99* 2.34* 4,45* 87,32* 82,67* 91,21* 90,34* 89,34* 82,34* 8,89* 10.31*
1 μg/L 3,45* 4.22* 65,32 64,32 18.01 17.92 13.22 13.65 98,90 99,75 101.23 100,67 100 101.02 2.34* 2.45
2 μg/L 4.11* 5,79* 64,78 63,32 17.89 17h32 13.22 13.57 99,92 99,78 99,43 99,32 99,89 99,80 3.11* 3,45*
5 μg/L 6.21* 7.11* 62,85 61.21 17.21 16.56 13.73 15.12 100,21 99,89 99,65 101.02 99,56 100,04 4.12* 4,89*
10 μg/L 10.21* 12h32* 58,79* 55,64* 20.31* 19h40* 10,69* 8,64* 96,73* 95,32* 100,21 100,78 95,43* 94,32* 4,89* 5.61*
15 μg/L 13h45* 16,78* 56,80* 55,82* 22.34* 22.11* 7.41* 5.29* 95,73* 94,78* 99,78 99,32 94,34* 93,21* 5.31* 6,78*
20 μg/L 15.61* 22.34* 54,35* 48,35* 23.46* 23.43* 6,58* 5,88* 94,32* 90,31* 95,43* 96,78* 93,41* 90,42* 6,78* 8,79*

s-G1: subpartículas G1 (núcleos ou fragmentos com menor intensidade de fluorescência que os núcleos G1). FSC: diâmetro/complexidade dos núcleos. CVG1: coeficiente de variação dos núcleos. NC: controle negativo – água mineral Ingá®.PC:
controle positivo - MMS 0,4−milímetros.R24 h – tratamento de recuperação. Médias seguidas de * são estatisticamente diferentes do controle negativo (Mann-Whitney;p <0,05).
Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297
VV Souza e cols.
Figura 2.Histogramas representativos da análise de citometria de fluxo emA. cepacélulas meristemáticas. A. Histograma mostrando cada fase celular do grupo controle. B. Histograma mostrandoA.
cepanúcleos em 96 h após a exposição ATZ (20 μg/L) após 24 h de recuperação. Observe em B o aumento das subpartículas-G1percentagem; aumento de núcleos em S; diminuição de núcleos em G2/M
e aumento em CVG1. Além disso, em B é percebido um deslocamento do pico G1 para a esquerda, representando uma intensidade de fluorescência menor em relação ao controle.
Tabela 5
resultados de testes crônicos comdáfnia magnaexpostos a ATZ.
Variáveis do ciclo de vida NC PC 1 μg/L
Tamanho médio das primíparas 6.84±0,62 4,95±0,54* 6.51±0,62
Dias da primeira desova Número de 9,2±1.33 0 9.3±0,41
ovos após 21 dias 504±63 0 359±44,87
comprimento da carapaça em comparação com o grupo controle (Tabela 5).
Mudanças nos parâmetros reprodutivos, como redução na eclosão de ovos em
P. promelase gerar uma prole menor emD. melanogasterforam
evidenciados após exposição a ATZ em concentrações não ambientais, 0,25
mg/L e 2 mg/L, respectivamente (Dionne e outros, 2021;Vogel e outros, 2015
). A ATZ é capaz de induzir o bloqueio do metabolismo lipídico, reduzindo a
produção de energia, e modula positivamente enzimas relacionadas à
desintoxicação, como glutationa S-transferase, citocromo P450 e
glicosiltransferases como uma resposta adaptativa deD. magnaa estressores
químicos (Liu e outros, 2022;Sengupta et al., 2017;Schmidt e outros, 2017;
Sengupta et al., 2016). Nestas condições, é razoável considerar queD. magna
utiliza sua reserva de energia priorizando a sobrevivência/manutenção e,
como consequência, carece de energia para investir integralmente em
crescimento e reprodução. Aqui, a fecundidade foi mais sensível à exposição
crônica à ATZ do que o crescimento deD. magnaera. Notavelmente, a alta
concentração de ATZ do grupo de controle positivo, ou seja, 1 mg/L, inibiu
completamente a reprodução partenogenética (Tabela 5).
A ATZ foi identificada como um potente desregulador endócrino de diferentes
organismos (Wirbisky-Hershberger et al., 2017a,Wirbisky-Hershberger et al.,
2017b;Palma e outros, 2009) e interfere na síntese de hormônios essenciais para a
maturação sexual e desenvolvimento corporal (Wang e outros, 2022;Zhu et al.,
2021;Blahova e outros, 2020;McWhinnie e outros, 1972). Além disso, é relatado
que ATZ pode modificar o perfil metabólico da produção de glicose, desviando a
energia que de outra forma seria usada no crescimento corporal para lidar com o
estresse causado pelo herbicida.Wagner e outros, 2017). Assim, a exposição à ATZ
alterou os mecanismos de osmorregulação emProchilodus lineatus, deslocando a
mobilização de nutrientes e energia para manter a homeostase (Paulino e outros,
2012). Juntos, esses mecanismos também poderiam ser responsáveis pelo
crescimento reduzido evidenciado emD. magnaexpostos a ATZ, mesmo em baixas
7
Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297
2 μg/L 5 μg/L 10 μg/L 15 μg/L 20 μg/L
6.51±0,74 5.67±0,88* 5.62±0,31* 5,79±0,89* 5,55±0,54*
9.7±2.74 10.2±1.31 10.8±2,52* 11.9±5,64* 12.5±0,41*
332±41,5 291±36,37* 294±36,75* 260±32,5* 279±34,87*
concentrações, ao final do teste de reprodução.
3.4. ATZ causa comportamento anormal de natação em Daphnia magna
Os resultados dos efeitos da ATZ no comportamento natatório de
D. magnasão mostrados emFig. 3. ATZ nas concentrações de 15 e 20 μg/L
reduziu a área total coberta porD. magna(Fig. 3A e B). Ao analisar a distância
percorrida, houve redução significativa nos grupos expostos a 15 e 20 μg/L
de ATZ (Fig. 3C). Em relação à velocidade média de natação (Fig. 3D), ficou
evidente que ATZ na concentração de 15 μg/L causa um efeito letárgico em
D. magnalevando a uma diminuição da velocidade, sugerindo um possível
efeito neurotóxico. Por outro lado, na maior concentração testada (20 μg/L)
a velocidade de nado permaneceu inalterada, demonstrando que neste
grupo,D. magnatendem a nadar verticalmente na coluna d'água, porém
permanecem restritas a uma pequena área em um plano bidimensional.
Embora alguns efeitos de ATZ mostrem uma resposta de dose linear
monotônica, outros efeitos freqüentemente não o fazem (Cleary e outros,
2019;Bautista et al., 2018;Felisbino e outros, 2018; McMahon e outros, 2017;
Brodeur et al., 2013;Fan e outros, 2007;Hayes e outros, 2002, 2003, 2006;
Larson e outros, 1998), como parece ser o caso deD. magna comportamento
de natação. Mecanismos celulares/moleculares específicos podem explicar
as curvas dose-resposta não monotônicas. No entanto, toda a gama de vias
bioquímicas interconectadas que operam para produzir a resposta
comportamental à exposição à ATZ ainda não é compreendida.
Mudanças no comportamento natatório associadas à área e distância
percorrida, velocidade e trajetória natatória ocorrem principalmente quando os
organismos aquáticos são expostos a poluentes ambientais que alteram as
funções neurais e consequentemente sua coordenação motora.Tkaczyk et al.,
2021;Yalsuyi et al., 2021).D. magnanadar constantemente na coluna de água para
encontrar comida (Fischer e outros, 2006), portanto, mudanças
VV Souza e cols. Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297

Figura 3.Dados sobre o desempenho natatório deD. magna21 dias após a exposição ao ATZ. A. Porcentagem de área coberta na natação porD. magna. B. Diagramas representativos
mostrando a área específica total explorada porD. magna. C. Distância total percorrida porD. magna. D. Velocidade de natação.

estilo de natação são indicadores sensíveis e precoces de toxicidade para
avaliação da qualidade da água e podem afetar significativamente a chance
de sobrevivência e reprodução (Pawlik-Skowrońska et al., 2019).Dodson e
Stanley (1997)relataram que movimentos acelerados e contínuos de
D. magnaatraem a atenção dos peixes e podem gerar maior predação.
Marshall (2009)descreveu que sob condições de estresseD. magna muda seu
estilo de nado realizando braçadas curtas na tentativa de atingir o topo da
coluna d'água. O movimento de nado vertical aqui relatado para a
concentração de 20 μg/L, fazendo com que os organismos permaneçam no
mesmo local, poderia, portanto, estar associado a maior gasto energético e
diminuição da idade de primeira reprodução de
D. magna.
3.5. ATZ induz alterações fisiológicas e de desenvolvimento em Danio
rerio
Dados sobre mortalidade em embriões e larvas de peixe-zebra foram registrados em
24, 48, 72 e 96 cv (Tabela 6). Nenhum grupo tratado com ATZ apresentou
diferenças na taxa de mortalidade durante este período em comparação com o
controle negativo. No presente estudo, testamos concentrações ambientais de
ATZ muito abaixo do necessário para causar letalidade em peixe-zebra; de fato, de
acordo comWiegand et ai. (2000), o LC50 de ATZ a 48 hpf é de 36,8 mg/L.
Os resultados da taxa de eclosão também são mostrados emTabela 6. Uma taxa de
eclosão acima de 90% foi observada em todos os grupos tratados e controle, sem
diferenças entre eles. No entanto, a maioria dos embriões expostos à ATZ em
diferentes concentrações eclodiu antes de 48hpf, o que não foi evidenciado no
grupo controle. Notavelmente, 91,2 e 89,8% dos embriões tratados com 15 e 20
μg/L de ATZ eclodiram entre 24 e 48 hpf (Tabela 6). Consequentemente, a 72hpf a
taxa de eclosão reduziu significativamente para todas as concentrações de ATZ em
comparação com o controle, com a maior taxa relatada neste período sendo de
8,10% para a concentração de 10 μg/L.
Alterações na taxa e no tempo de eclosão do embrião estão associadas a
mudanças no metabolismo e foram observadas em embriões de peixe-zebra
em resposta a poluentes ambientais.Blahova e outros, 2021;Cahova et al.,
2021;Liang et al., 2017a,Liang et al., 2017b;Samaee e outros, 2015).). É
importante ressaltar que a eclosão prematura pode implicar em um
aumento significativo na suscetibilidade das larvas recém-eclodidas a vários
estressores presentes no ambiente.Liang et al., 2017a,Liang et al., 2017b), o
que também pode explicar as perturbações fisiológicas e anormalidades
morfológicas causadas pela ATZ durante o desenvolvimento dos peixes (
Barton, 2002).
Os parâmetros morfológicos investigados em larvas de zebrafish são ilustrados em
Fig. 4A. Todas as concentrações de ATZ aumentaram significativamente as taxas de
movimento espontâneo dos embriões 24hpf (Fig. 4B). Enquanto o controle negativo teve
uma média de 1,2 movimentos por minuto, as concentrações de 1 e 10 μg/L induziram
2,8 (resposta mais baixa) e 6,3 (resposta mais alta) movimentos por minuto,
respectivamente. A avaliação do movimento espontâneo em embriões de peixe-zebra foi
recentemente proposta como uma

Tabela 6
Resultados de mortalidade (%) e taxa de eclosão (%) de embriões de zebrafish expostos a ATZ (hpf – horas após a fertilização).

Tempo NC PC 1 μg/L 2 μg/L 5 μg/L 10 μg/L 15 μg/L 20 μg/L

Mortalidade 24 hpf 2.01±0,62 10.11±3.21* 1.11±0,09 1.44±0,74 1.37±0,52 2.11±0,31 2.25±0,77 2.11±0,88
48 hpf 1,57±0,59 15h25±1.18* 2.10±0,18 1,45±0,66 2.21±0,21 2.21±0,48 2.19±0,51 2.09±0,62
72 hpf 1.39±0,52 13h39±4.32* 2.02±0,38 2.28±0,29 2.35±0,14 1,87±0,57 2.01±0,41 2,78±0,44
96 hpf 1.22±0,3 7.22±3.22* 2.09±0,45 1.39±0,19 1.13±0,30 1.09±0,18 1.81±0,39 2.14±0,91
Taxa de eclosão 24 hpf 0 0 0 0 0 0 0 0
48 hpf 0 0 83,10±5,55* 85.12±2,85* 88.10±3.18* 84,75±7,99* 89,82±4,55* 91,23±5.32*
72 hpf 84,20±6.22 71,55±9.01 4.11±1.01* 5.02±1.09* 5.32±0,98* 8.10±2,85* 1.09±0,32* 0,98±0,10*
96 hpf 8.31±1.41 9,88±2.10 3,59±0,91* 3.01±0,78* 1,55±0,37* 0,69±0,11* 1.01±0,21* 0,59±0,09*
*
São estatisticamente diferentes do controle negativo (Mann-Whitney;p <0,05).

8
VV Souza e cols.
marcador de neurotoxicidade em estudos sobre alterações comportamentais e do
desenvolvimento motor devido à exposição química (Soares e outros, 2017).
Pesquisas têm mostrado que ATZ é um fator ambiental que pode causar efeitos
neurológicos (Galbiati et al., 2021;Stradtman e Freeman, 2021;Wang e outros,
2015;Bretaud et al., 2004). De acordo,Wang e outros, 2015relataram que a
atividade da acetilcolinesterase (AChE) em embriões de peixe-zebra tratados com
ATZ é regulada negativamente e pode prejudicar a eficiência da inervação dos
músculos. A inibição da enzima AChE mantém os receptores nicotínicos de
acetilcolina abertos para que os íons de sódio fluam para as células do sistema
nervoso, levando a um potencial de ação e, portanto, a uma hiperatividade
potencial.Ogungbemi et al., 2020). Nossos achados podem indicar que a exposição
desenvolvimental à ATZ pode afetar a neuroatividade e desencadear alterações
9
Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297
Figura 4.Dados morfológicos e fisiológicos de embriões e
larvas de zebrafish expostos a ATZ. A. Ilustração de análises
morfométricas realizadas em larvas de zebrafish a 96hpf. B.
Movimento espontâneo a 24 hpf. C. Comprimento total das
larvas a 96hpf (A1). D. Área do saco vitelino a 96 hpf (A2). E
Área pericárdica a 96 hpf (A3). F. Frequência cardíaca das
larvas a 96 hpf (batidas por minuto, bpm). G. Área dos olhos
(Op). H. Alterações morfológicas em larvas de zebrafish 96
hpf expostas a 20 μg/L de ATZ: edema do saco vitelino
(seta). NC: Controle negativo; PC: Controle positivo;
*Significativamente diferente em relação ao NC pelo teste
não paramétrico de Mann-Whitney, (p <0,05).
resposta motora induzindo a hiperatividade do embrião, caracterizada por taxas
mais altas de movimentos espontâneos, que contribuem, em última análise, para
a eclosão prematura (Cheng e outros, 2007a,Cheng e outros, 2007b;Winnicki e
outros, 1970).
Fig. 4C mostra que todas as concentrações de ATZ promoveram um aumento
no tamanho (comprimento total do corpo) das larvas de peixe-zebra a 96 hpf em
comparação com o controle negativo. Em contraste, houve uma redução
significativa no tamanho do saco vitelino em larvas expostas às concentrações de
5, 10, 15 e 20 μg/L de ATZ (Fig. 4D). Esses achados podem indicar um aumento da
metabolização ou utilização acelerada da única fonte de energia das larvas,
contribuindo para seu rápido crescimento, como sugerido em estudos anteriores (
Parra et al., 1999). Em ratos machos, ATZ em baixas concentrações (30 ou 300
VV Souza e cols. Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297

μg/kg/dia) induziu um aumento na síntese lipídica e no armazenamento

intramuscular, gerando assim acúmulo de gordura no tecido
metabolicamente ativo (Lim e outros, 2009). Além disso, a exposição de
embriões de peixe-zebra a ATZ causou regulação positiva doCrhbpgene (
Wirbisky et al., 2016), que é responsável por estimular a secreção de
peptídeos derivados de pré-opiomelanocort, como o hormônio estimulante
de α-melanócitos (α-MSH) e o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). A
função desses hormônios em vertebrados envolve homeostase energética,
ingestão de alimentos e regulação do peso corporal.Hsieh et al., 2021).
Para investigar melhor se a exposição ao desenvolvimento de ATZ provoca
cardiotoxicidade em larvas de peixe-zebra, a área do pericárdio foi avaliada. Como Fig. 4E
mostra, 5 μg/L ou concentrações mais altas de exposição a ATZ levaram a um aumento
na área do saco pericárdico em 96 dpf (Fig. 4H), indicando uma possível alteração na
morfologia e função do coração. Notavelmente, todas as larvas de peixe-zebra tratadas
com ATZ também exibiram frequência cardíaca marcadamente mais alta em 96 hpf,
aumentando a taxa de contração em 89% em comparação com o controle negativo,
sugerindo que o herbicida pode acelerar a frequência cardíaca e aumentar o débito
cardíaco (Fig. 4F). O aumento da frequência cardíaca e da área pericárdica estão
regularmente relacionados ao aumento da taxa metabólica, alterações da pressão
arterial e aumento da resposta a estímulos externos, agravando o risco de predação ou
dificultando a busca do indivíduo por um ambiente ou alimento favorável, impactando
diretamente no número de indivíduos que podem atingir a idade adulta (Li e outros, 2020
). Figura 5.Resultados da análise de rede usando a ferramenta de pesquisa para interações
de produtos químicos (STITCH) para explorar a interação entre atrazina e peixe-zebra
Em relação a outros parâmetros morfológicos investigados, como a distância
com suas diferentes moléculas-alvo. As isoformas de splice ou modificações pós-
entre os mioseptos e o tamanho da cabeça (Fig. 4A 4,5), nenhum efeito
traducionais são colapsadas, ou seja, cada nó representa todas as proteínas produzidas
significativo relacionado à exposição à ATZ foi evidente em larvas de peixe-zebra,
por um único locus gênico codificador de proteínas. Nós pequenos: proteína de estrutura
indicando que o herbicida, em baixa concentração, parece não provocar
3D desconhecida.
alterações ou degeneração no desenvolvimento muscular ou causar graves
defeitos no neurodesenvolvimento, pelo menos até 96 dpf . Contrariando esses
abastecimento, proteção de comunidades aquáticas e consumo humano, 2 μg/L,
achados, a 15 μg/L de exposição à ATZ, detectamos um aumento na área dos
causou danos citogenotóxicos emA. cepa, e alterações fisiológicas em embriões de
olhos (Fig. 4G). De acordo comFan et ai. (2007), A exposição ao ATZ pode
peixe-zebra e, portanto, prejudiciais aos bioindicadores de qualidade da água
interromper a sinalização do retinóide e aumentar a expressão dos genes da
pertencentes a diferentes níveis tróficos.
opsina, prejudicando assim o desenvolvimento ocular das larvas do peixe-zebra.
A presença de concentrações superiores a 2 μg/L no meio aquático,
relatadas em estudos científicos que corroboram as demais concentrações
3.6. ATZ pode interagir com citocromo P450 aromatase e catalase de peixe-
aqui testadas, evidencia o uso indiscriminado de ATZ em lavouras, problema
zebra
recorrente, principalmente no Brasil. A regulamentação ineficiente do uso
deste herbicida dificulta a implementação de medidas para evitar a
Na análise bioinformática, foram exploradas as supostas vias, integrando ATZ
contaminação aquática, podendo contribuir para o aumento de desordens
com diferentes proteínas em uma rede de interação metabólito-proteína. De
genéticas, fisiológicas e morfológicas nos organismos expostos conforme
acordo com a rede de interação STITCH, ATZ foi ligada a diferentes vias
relatado neste estudo.
metabólicas e mostrou uma forte interação com membros da família citocromo
P450, família 19, subfamília A (CYP19a1b, CYP19a1a) (Fig. 5) e enzimas de estresse
Declaração de contribuição de autoria do CRediT
oxidativo catalase (CAT). Considerando que em peixes, como em outros animais, a
maioria das isoformas das famílias CYP 1-4 atuam principalmente na
Vítor Ventura de Souza:Redação – revisão e edição, análise formal,
biotransformação xenobiótica (Loerracher e Braunbeck, 2021), as isoformas das
curadoria de dados, visualização.Tatiana da Silva Souza: Conceituação,
famílias CYP 5–51 atuam predominantemente em substratos endógenos, muitos
Investigação, Redação – revisão e edição, Visualização, Supervisão.José
dos quais têm papéis críticos no desenvolvimento normal, maturação e
Marcello Salabert de Campos:Metodologia, Validação, Curadoria de
homeostase fisiológica, como no caso das aromatases neurais e gonadais,
dados.Luiza Araújo de Oliveira:Metodologia. Yves Moreira Ribeiro:
codificadas pelocyp19a1aecyp19a1bgenes (Guengerich, 2017; Nebert et al., 2013).
Metodologia.Daniela Chemin de Melo Hoyos:Metodologia.Rogéria
Tem sido demonstrado que o sistema de defesa antioxidante desempenha um
Maura Panzini Xavier:Metodologia. Ives Charlie-Silva:Metodologia.
papel importante na manutenção da homeostase celular.Burquina e outros, 2015;
Samyra Maria dos Santos Nassif Lacerda:Conceituação, Investigação,
Westphal, 2000). Com base na forte interação da ATZ com a CAT, especulamos que
Recursos, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição,
a ATZ poderia provocar alterações no sistema desintoxicante e que a toxicidade do
Visualização, Supervisão, Administração do projeto.
desenvolvimento relacionada à ATZ observada no peixe-zebra pode estar
relacionada ao estresse oxidativo excessivo. Estudos adicionais são necessários
para elucidar os mecanismos alterados pela exposição a baixas concentrações de
ATZ durante o desenvolvimento do peixe-zebra, bem como os efeitos na idade Reconhecimentos
adulta após a exposição a longo prazo.
Os autores agradecem o apoio financeiro do INCT-ADAPTA (Brasil,
CNPq (465540/2014-7) /FAPEAM (062.1187/2017) /CAPES (código
4. Conclusão financeiro 001) e FAPEMIG pela bolsa de doutorado da VVS.

O ATZ é um dos agrotóxicos mais utilizados na agricultura e, devido aos seus Apêndice A. Dados suplementares
conhecidos efeitos tóxicos, sua presença no meio ambiente é principalmente
monitorada por órgãos ambientais e de saúde humana. No entanto, este estudo Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em
adverte que o valor limite de ATZ permitido em águas destinadas a https://doi. org/10.1016/j.pestbp.2022.105297.

10
VV Souza e cols. Bioquímica e Fisiologia de Pesticidas 189 (2023) 105297

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