Traduzido do Inglês para o Português - www.onlinedoctranslator.

com

Patologia Vegetal Fisiológica e Molecular 119 (2022) 101834

Listas de conteúdos disponíveis emScience Direct

Patologia Vegetal Fisiológica e Molecular

Página inicial do jornal:www.elsevier.com/locate/pmpp

AepsBmutante deRalstonia solanacearumcomo novo agente de biocontrole da murcha

bacteriana do tabaco via ativação da sinalização do ácido salicílico

Shili Li, Liang Yang, Yuao Ran, Wei Ding*

Laboratório de Pesticidas de Produtos Naturais, Faculdade de Proteção de Plantas, Southwest University, Chongqing, 400715, China

ARTIGOINFO ABSTRATO

Palavras-chave: O polissacarídeo extracelular (EPS) é o fator de virulência mais importante daR. solanacearume promove a colonização
Ralstonia solanacearum sistêmica rápida e induz sintomas de murchamento da planta. Neste estudo, o mecanismo de controle biológico e o efeito dos
murcha bacteriana
genes mutantes da biossíntese de EPS (ΔepsB, ΔepsCe ΔwecC) sobre a murcha bacteriana. O nível de expressão de genes
epsBmutante
associados à virulência, comoxpsR,epsE,vsrB,vsrCephcA, diminuíram significativamente no ΔepsDeformação. Além disso, a
controle biológico
aplicação de ΔepsBfoi observada atrasar o desenvolvimento do progresso da murcha por dois dias e a população de WT no
Sinalização de ácido salicílico
solo da rizosfera foi significativamente reduzida em 46,77 vezes após ΔepsBtratamento de tensão. Se o ΔepsBfoi aplicado mais
cedo do que a população WT, as eficiências de controle de ΔepsBforam 84,67%, 72,74%, 60,68%, 56,38% e 53,29% aos 8, 10, 12,
14 e 16 dias após a inoculação, respectivamente. Além do mais, o ΔepsBmutante induziu significativamente a expressão de
genes associados à defesa da planta envolvidos na via do ácido salicílico, mas não afetou a expressão de genes associados às
vias do ácido jasmônico e do etileno. Comparado com a planta inoculada com o tratamento WT, a expressão dePR1a/c,PR2e
NPR1foi induzida 4,5 vezes, 6,9 vezes e 2,2 vezes, respectivamente, na planta colonizada por ΔepsBmutante. Enquanto isso, a
aplicação de ΔepsB cepa na rizosfera do tabaco induziu significativamente o acúmulo de ácido salicílico, com aumento de 1,58
vezes em comparação com o controle. Tomados em conjunto, os resultados sugeriram que o ΔepsBdoença murcha bacteriana
suprimida mutante ativando a sinalização do ácido salicílico e tem o potencial de ser usado como agentes de biocontrole para
controlar a murcha bacteriana causada porR. solanacearum.

1. Introdução bactérias fitopatogênicas, comoPseudomonas syringae,Erwinia amylovorae

A murcha bacteriana é uma doença vascular sistêmica letal causada porRalstonia
solanacearum, um dos patógenos bacterianos de plantas mais devastadores, que infecta
fortemente mais de 250 espécies de plantas.1,2]. Recentemente, a murcha bacteriana do
tabaco tem sido amplamente observada no sul da China e tem causado sérias perdas
econômicas.3,4]. Estreptomicina e tiodiazol-cobre são usados para controlar a murcha
bacteriana na China, mas exercem poucos efeitos positivos no campo.5,6]. O
melhoramento de cultivares resistentes à murcha bacteriana é o método mais eficaz para
o controle da doença. No entanto, em muitas culturas, as cultivares resistentes à murcha
bacteriana estão negativamente correlacionadas com a qualidade e o rendimento.7].
Consequentemente, o desenvolvimento de novas estratégias de biocontrole é
evidentemente necessário.
Mutantes avirulentos deR. solanacearumforam avaliadas como
estratégias alternativas de biocontrole para controlar a murcha bacteriana [
8,9]. Certo O Δhrpmutantes demonstraram atividade biológica contra a
murcha bacteriana [10]. Além disso, Δhrpmutantes demonstraram reduzir
significativamente e abolir os sintomas da doença causados por outros
Xanthomonas campestris[11]. Além disso, o alto efeito protetor de ΔhrpGcontra a
murcha bacteriana está associada com os genes regulados positivamente
envolvidos na biossíntese e sinalização do ácido abscísico (ABA) [8]. Enquanto isso,
o ΔphcAmutante é considerado um potencial agente de biocontrole da murcha
bacteriana do tomateiro, estimulando a expressão gênica da via do ácido salicílico.
12]. Os mutantes de conversão fenotípica (PC) deR. solanacearummostram efeitos
altamente supressores contra a murcha bacteriana em muitas cultivares de
berinjela [13]. Além disso, um mutante do sistema de secreção tipo III de
Acidovorax citrulli, AAC00-1ΔhrcC pode reduzir significativamente a transmissão
bacteriana da mancha-dos-frutos [14]. Da mesma forma, Freeman [15]
descobriram que as cepas mutantes avirulentas 4/4 de Fusarium oxysporumfoi
capaz de reduzir significativamente a mortalidade de mudas de melancia causada
por variedade selvagem. Portanto, a construção de mutantes avirulentos deR.
solanacearumsão consideradas estratégias novas e eficazes para controlar a
murcha bacteriana.
O polissacarídeo extracelular (EPS) é um importante fator de virulência da
R. solanacearumque é produzido em grandes quantidades in planta,

* Autor correspondente. Laboratório de Pesticidas de Produtos Naturais, Faculdade de Proteção de Plantas, Southwest University, 400716, BeiBei Chongqing, China. Endereço
de email:dwing818@163.com (W. Ding).

https://doi.org/10.1016/j.pmpp.2022.101834
Recebido em 9 de fevereiro de 2022; Recebido no formulário revisado em 29 de março de 2022; Aceito em 5 de abril de 2022
Disponível online em 8 de abril de 2022
0885-5765/© 2022 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.
S. Li et ai. Patologia Vegetal Fisiológica e Molecular 119 (2022) 101834

tabela 1 2.3. Efeito de mutantes Δeps na expressão gênica associada à virulência

Primers para expressão de genes associados à virulência emR. solanacearum.

Nome dos Primers Sequência de primer (5'>3′) Referência R. solanacearume Δepsmutantes foram inoculados durante a noite em B
médio. Após centrifugação a 8000 por 5 min, as bactérias foram
xpsR_F AGATCGACATAGCGCTGCTT [25]
xpsR_R TTACTTTGCGGACCTGCTCTCT
ressuspensas em meio M63 (OD600ajustado para 0,2) [22]. Em seguida, as
epsE_F CTGGATAAAGCCACGCAAAAG [25] suspensões bacterianas foram transferidas em tubos e a 180 rpm por 4-5 h
epsE_R CAGTGGTACATCGCCATCAC a 30◦C. As amostras foram colhidas por centrifugação a 5000 por 10 min a 4◦
phcA_F TTGTAGGTCTCCGCACACCAG [25] C, e os sobrenadantes foram removidos. Em seguida, o RNA foi extraído
phcA_R GCTCGCTCGATCAGTACCTC
usando o reagente TRNzol (Tiangen Biotech Co. Ltd, Pequim, China) e
hrpB_F AATACGCAAATGCGGTTTTC [25]
hrpB_R CTTCTTCCGCTTCTTCATCG tratado com DNase I livre de RNase (Tiangen Biotech Co. Ltd, Pequim, China)
hrpG_F GTCTTCACGGTCTGCGAACT [25] para remover contaminações de DNA genômico. A degradação e a
hrpG_R ATTGACCCCAATCCATCCA contaminação do RNA foram verificadas em géis de agarose a 1% e a
flhC_F CTTCCTGAACATCTACCGTTTC [25]
concentração e a pureza do RNA foram monitoradas usando o
flhC_R GAGTGATCGACAGCACCTCTT
vsrC_F ACCCCCTCTCGCCTTATCT Este estudo
espectrofotômetro Nanovue UV-Vs. Em seguida, 1 μg de RNA purificado foi
vsrC_R ACAGCCAGACATCCAGCAG transcrito reversamente em cDNA usando o iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-
vsrB_F GCGGCACAATCCGTTATTCC Este estudo Rad, Hercules, CA, EUA). A análise quantitativa em tempo real foi de acordo
vsrB_R GCCCGAGTTTGGTCAAGAGA com Yang et al. [20]. As sequências de primers estão listadas emtabela 1.
serC_F CCCACCTACGCCATCTATGT [25]
serC_R TTGAGGAAGAACGGCACATT
2.4. Eficiência de controle de mutantes Δeps na murcha bacteriana do tabaco

promovendo a colonização sistêmica rápida e induzindo sintomas de
murchamento das plantas [1]. Em condições de alta densidade celular, o
regulador transcricional global PhcA ativa a expressão de XpsR, que ativa
diretamente a transcrição doepsoperon para produzir EPS [16]. O sistema
regulador de dois componentes VsrA/VsrD também é necessário para ativar
totalmentexpsRtranscrição e, consequentemente, síntese de EPS [17]. A
produção de EPS I, que contém principalmente EPS, requer a expressão
transcricional de 18 kbepscluster de genes que inclui epsAPBCDEF[16].
mutantes EPS deR. solanacearumraramente murcham ou matam as plantas,
mesmo quando as bactérias infectam diretamente o xilema [18]. No entanto,
não foi determinado se as cepas deletadas de EPS podem ser usadas como
agentes de biocontrole para controlar a murcha bacteriana.
Neste estudo, mutantes dos genes da biossíntese de EPS (ΔepsB, ΔepsCe Δ
wecC) foram utilizados para elucidar o mecanismo pelo qual Δepsmutantes inibem
a murcha bacteriana do tabaco. Nós avaliamos a atividade de biocontrole do Δeps
mutantes na murcha bacteriana em um experimento em casa de vegetação, e a
expressão de genes associados à virulência e genes de defesa da planta foi
medida usando RT-PCR. Finalmente, determinamos o teor de ácido salicílico livre
(SA) e ácido jasmônico (JA) em plantas de tabaco após a inoculação com ΔepsB
variedade.
2. Materiais e métodos
2.1. Cepas bacterianas e condições de crescimento
O patógeno vegetalR. solanacearumCQPS-1 (filotipo I, raça 1, biovar
3) [19] e o Δepstensões (ΔepsB, ΔepsCe ΔwecC) de
R. solanacearum[20] utilizados neste estudo foram todos fornecidos pelo
Laboratory of Natural Products Pesticides, Southwest University, Chongqing,
China (número de acesso NZ_CP016914.1).R. solanacearum e os mutantes
foram cultivados em meio rico em nutrientes (meio B) a 30◦C [21].
2.2. teste de patogenicidade
A planta utilizada neste estudo foi o tabaco (Nicotiana tabacumYunyan87) e
tomate (Solanum Lycopersicumcv. Ailsa Craig, AC++). Mudas de tabaco e tomate
com três semanas de idade foram usadas para testar a virulência do Δeps
Deformação. O crescimento das plantas e experimentos em vasos foram
conduzidos em sala climatizada a 28◦C com um ciclo claro/escuro de 14h/10h.
A patogenicidade das cepas selvagens e mutantes foi testada usando plantas
de tabaco e tomate. 10 mL de cepas selvagens e mutantes (1 ×108CFU/mL) foram
adicionados à rizosfera da planta e os sintomas de murcha foram investigados
todos os dias após a inoculação. Os tratamentos individuais continham 10 plantas
para cada experimento independente.
A eficiência de controle de Δepsmutantes na murcha bacteriana do tabaco foi
avaliada pelo ensaio naturalístico de infiltração no solo, conforme descrito em um estudo
anterior com pequenas modificações [23]. Resumidamente, plantas de tabaco com seis
semanas de idade (Yunyan 87) foram pré-inoculadas com Δepsmutantes de
R. solanacearum(densidade bacteriana, 1×108CFU/mL, 10 mL/pote) sem ferir as
raízes. Após 3 dias de pré-inoculação, plantas individuais foram inoculadas
despejando 10 mL de R. solanacearumSuspensão CQPS-1 (1×108UFC/mL) no solo.
Todas as plantas foram colocadas em uma cabine climatizada a 28◦C com um ciclo
claro/escuro de 14/10 h. Os sintomas da murcha bacteriana foram pontuados
diariamente usando uma escala de índice de doença de 0 a 4 (0, nenhum sintoma
apareceu; 1, 1–25% das folhas murchas; 2, 26–50% das folhas murchas; 3, 51–75%
das folhas murchas; 4, 76-100% das folhas murchas). Os tratamentos individuais
continham 16 plantas para cada experimento independente, e o ensaio foi
repetido três vezes. O índice de doença foi calculado como uma média ponderada.
Para medir a população bacteriana no solo da rizosfera, coletamos oito
raízes de tabaco 7 dias após a inoculação comR. solanacearum CQPS-1. O
solo foi sacudido suavemente das raízes e, para medir a população
bacteriana, o solo remanescente aderido intimamente às raízes foi
considerado solo rizosférico. Um grama de solo foi diluído em 9 mL de água
esterilizada e incubado em agitador com 170 rpm a 30◦C por 30 min e
cultivadas em temperatura ambiente por 20 min. Em seguida, a suspensão
do solo foi diluída em série em diluições seriadas e a suspensão bacteriana
foi espalhada em meio SMSA conforme descrito anteriormente [24]. O tipo
selvagem CQPS-1 e Δepsmutantes foram distinguidos pela morfologia da
colônia.
2.5. Efeito de mutantes Δeps na expressão de genes associados à defesa de
plantas
Para avaliar o efeito de Δepsmutantes na expressão do gene de defesa
da planta, plantas de tabaco de seis semanas (Yunyan 87) foram pré-
inoculadas com Δepsmutantes (ΔepsB, ΔepsCe ΔwecC) sem ferir as raízes.
Após 24 h de pré-inoculação, plantas individuais foram inoculadas
despejando 10 mL de R. solanacearumSuspensão CQPS-1 (1× 108UFC/mL) no
solo. Após incubação por 6 h, 0,2 g de folhas foram coletadas para cada
amostra em um microtubo e colocadas em nitrogênio líquido. Essas
amostras foram utilizadas para extração de RNA. Oito amostras foram
coletadas para cada tratamento.
Isolamento de RNA total e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
foram realizados conforme descrito anteriormente com pequenas
modificações [25]. O RNA total das células bacterianas coletadas e das folhas
de tabaco foi extraído usando o reagente Trizol de acordo com as instruções
do fabricante (Tiangen Biotech Co. Ltd, Beijing, China) e posteriormente
tratado com DNase I livre de RNase (Tiangen Biotech Co. Ltd, Beijing , China)
para remover DNA genômico contaminado.

2
S. Li et ai. Patologia Vegetal Fisiológica e Molecular 119 (2022) 101834

mesa 2
Primers para genes associados à defesa vegetal.

Gene Nº de acesso Iniciador avançado (5′para 3′) Primário reverso (5′para 3′)

NtPR1a/c X05959 AACCTTTGACCTGGGACGAC GCACATCCAACACGAACCGA

NtPR2 M60460 TGATGCCCTTTTGGATTCTATG AGTTCCTGCCCCCGCTTT
NtPR1b X66942 AACCCATCCATACTATTCCTTG GCCGCTAACCTATTGTCCC
NtPDF1.2 NM_123809.3 GCGCCGGTATTTTTTATATTATTGTAACAACAA GCGCCACACAACACATACATCTATACATTG
NtEFE26 Z29529 CGGACGCTGGTGGCATAAT CAACAAGAGCTGGTGCTGGATA
NtACC AB012857 GACAAAGGGACATTACAAGAAGT GAGAAGGATTATGCCACCAG
NtNPR1 U76707 GGCGAGGAGTCCGTTCTTTAA TCAACCAGGAATGCCACAGC

Figura 1.A patogenicidade e toxicidade de ΔepsBmutante em mudas jovens de tabaco e tomate. (A–C) Sintomas de doença de WT e ΔepsBestirpe mutante em plantas de tabaco. (D–F)
Sintomas de doença de WT e ΔepsBestirpe mutante em plantas de tomate.

Depois de extrair o RNA total das amostras, o cDNA da primeira fita foi
sintetizado usando o kit de síntese iScript gDNA clear cDNA (Bio-Rad,
Hercules, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A RT-PCR foi
realizada no Termociclador C1000 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Os primers
para os genes testados foram projetados usando o programa primer do
NCBI e sintetizados pela BGI Technologies (Shenzhen,
Guangzhou, China) (mesa 2). Todas as análises quantitativas de PCR em tempo real (qRT-
PCR) foram realizadas em placas de 96 poços em um sistema de reação de 20 μL. Três
reações técnicas replicadas foram usadas para cada amostra.
2.6. Análise de ácido salicílico vegetal e ácido jasmônico
Para determinar o teor de ácido salicílico livre (SA) e ácido jasmônico (JA),
plantas de tabaco com seis semanas de idade (Yunyan 87) foram inoculadas com Δ
epsBestirpe (1×108CFU/mL, 10 mL/pote) em rizosfera. Em seguida, coletamos
folhas de tabaco 1, 3 e 5 d após a inoculação com ΔepsBvariedade. SA e JA foram
detectados em 50 mg de extratos brutos de folha de tabaco fresco. E a
cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa foi usada para a
quantificação de SA e JA, conforme descrito anteriormente [26].

2.7. Análise estatística

O SPSS versão 17.0 foi utilizado para as análises estatísticas. E os dados

analisados usando análise de variância de uma via (ANOVA), testes de intervalo
múltiplo de Duncan com umpvalor de 0,05 e testes t de amostra independente
compvalores de 0,05 e 0,01.

3. Resultados

3.1. Patogenicidade dos mutantes Δeps de R. solanacearum

Figura 2.Expressão de alguns genes associados à virulência deR. solanacearum

(CQPS-1, Δepsmutantes e complementadosΔepsB(epsB-comp)).SerCfoi usado
como gene de referência para normalizar a expressão do gene usando o método
ΔΔCq. Cada barra representa a média±SE de três repetições. Letras diferentes
indicam diferenças significativas entre diferentes tratamentos de acordo com
ANOVA de uma via com teste de Duncan (P <0,05).
A morfologia da colônia do Δepsmutantes eram diferentes do tipo selvagem
no meio B (Fig. S1A), formando colônias vermelhas e pequenas com menos
mucóide em comparação com a cepa selvagem (Fig. S1B). Além disso, observamos
que o Δepsmutantes (epsB,epsCewecC) diminuiu significativamente a
patogenicidade deR. solanacearumno tabaco em comparação com

3
S. Li et ai.
WT (Fig. S1C). Além disso, avaliamos a patogenicidade e toxicidade de ΔepsB
mutante em mudas jovens de tabaco e tomate com raízes feridas e
saudáveis. Os resultados mostraram que a cepa selvagem apresentou forte
atividade patogênica em mudas. E todas as mudas de tabaco e tomate
morreram aos 9 dias no tratamento da cepa WT (Figura 1DE ANÚNCIOS). No
entanto, ΔepsBmutante mostrou virulência em mudas jovens com raízes
feridas e saudáveis (Figura 1B,C,E,F).
3.2. Expressão de genes associados à virulência em mutantes Δeps e tipo selvagem
Experiências anteriores mostraram que Δepsmutantes (epsB,epsCe wecC
) diminuiu significativamente a patogenicidade deR. solanacearumsobre
tabaco. Além disso, investigamos a expressão de vários genes associados à
virulência emR. solanacearumCQPS-1 e ΔepsDeformação. Como mostrado
emFigura 2, a expressão de genes associados à virulência foi
diferencialmente regulada para baixo em Δepscepas, enquanto a expressão
de hrpB,hrpGefilCnão houve diferença significativa entre
R. solanacearumCQPS-1,epsB-comp e ΔepsDeformação. Além disso, a expressão
dexpsR,epsE,phcA,vsrC, evsrBforam significativamente diminuídos em Δepscepas
mostrando um 2,3-15,6 vezes em comparação com
4
Patologia Vegetal Fisiológica e Molecular 119 (2022) 101834
Figura 3.Efeito de controle de Δepsmutantes (Δ
epsB, ΔepsC, ΔwecC) contra a murcha bacteriana
do tabaco. (A) O índice de doença da murcha do
tabaco pré-tratado com ΔepsB, ΔepsC, ou ΔwecC
suspensão bacteriana mutante. WT significa
apenas infectado com CQPS-1 e ΔepsB, ΔepsCe Δ
wecCindica pré-inoculação com ΔepsB, ΔepsCe Δ
wecCcepas, respectivamente. As barras de erro
indicam os erros padrão. (B) Eficiência de controle
do Δepspré-tratamento de mutantes na murcha
bacteriana do tabaco. Cada valor indica a média±
SE. Letras diferentes dentro de cada coluna
indicam diferenças significativas entre
tratamentos de acordo com ANOVA de uma via
com teste de Duncan. O dpi significa dias após a
inoculação com
R. solanacearum(CQPS-1). (C) Sintomas de
doenças de mudas de tabaco representativas
inoculadas comR. solanacearumsob diferentes
tratamentos.
R. solanacearumCQPS-1 eepsB-tensão comp (Figura 2).
3.3. Biocontrole de mutantes Δeps contra a murcha bacteriana do tabaco
Para investigar a eficiência de biocontrole de Δepsmutantes (ΔepsB,
ΔepsCe ΔwecC) contra a murcha bacteriana do tabaco, realizamos um
experimento em vaso em casa de vegetação. Descobrimos que ΔepsB
estirpe reduziu significativamente o índice de doença da murcha
bacteriana do tabaco (Fig. 3A). Após a inoculação por 18 d, o índice de
doença do ΔepsBtratamento de pré-inoculação da cepa foi de 1,87, o
que foi significativamente menor do que o índice de doença de plantas
infectadas com CQPS-1 com 3,98. Além disso, o ΔepsBo tratamento de
cepa exibiu eficiências de controle significativamente maiores que Δ
epsC e ΔwecCcepas, atingindo valores de 84,67%, 72,74%, 60,68%,
56,38% e 53,29% aos 8, 10, 12, 14 e 16 dias após a inoculação,
respectivamente. A eficiência de controle do ΔepsCpré-tratamento foi
de 65,45%, 60,18%, 51,73%, 48,32% e 42,06%, respectivamente, nos
mesmos dias após a inoculação (Fig. 3B).
Para avaliar a população bacteriana de WT e Δepsmutantes na rizosfera
do solo do tabaco, analisamos o número de diferentes colônias de
monoesferas para distinguir WT e Δepsmutantes. Como mostrado em
S. Li et ai.
Figura 4.Tamanhos populacionais deR. solanacearumno solo rizosférico do tabaco. Plantas de
tabaco com seis semanas de idade foram pré-inoculadas com Δepsmutantes de
R. solanacearum(densidade bacteriana, 1×108CFU/mL, 10 mL/pote) sem ferir as raízes. O
solo foi suavemente sacudido das raízes 7 dias após a inoculação. Um grama de solo foi
diluído em 9 mL de água esterilizada e a suspensão do solo foi diluída em série em
diluições seriadas e a suspensão bacteriana foi espalhada em meio SMSA. As contagens
de colônias foram normalizadas para CFU/g de solo. Cada barra representa a média±SE
de três repetições. ** indicam diferenças significativas entre diferentes tratamentos de
acordo com o teste t de Student (P <0,01).
Figura 5.Efeito de Δepsmutantes (ΔepsB, ΔepsC, ΔwecC) pré-tratamento na
expressão de genes de defesa do tabaco. Usamos simulação de inoculação com
água estéril (CK) como tratamento controle. Os genes de defesa representam a via
do ácido salicílico (PR1a/c,PR2), via do ácido jasmônico (PR1b,PDF1.2), via do
etileno (EFF26,ACC) e gene de resistência adquirida sistêmica (NRP1). Cada barra
representa a média±SE de três repetições. Letras diferentes indicam diferenças
significativas entre diferentes tratamentos de acordo com ANOVA de uma via com
teste de Duncan (P <0,05).
Fig. 4, a população de patógenos em solo rizosférico tratado com ΔepsB o
tratamento de pré-inoculação da cepa foi o mais baixo, sendo significativamente
reduzido em 46,77 vezes em comparação com bactérias WT. Além disso, as
populações de ΔepsBtensão foi de 0,44×107UFC/g, chegando a ser quase 7,08
vezes maior que a população de patógenos em solos rizosféricos (P < 0,01) (Fig. 4).
No entanto, as densidades bacterianas do ΔepsCe ΔwecC tratamentos de pré-
inoculação foram todos menores do que a população de patógenos.
3.4.Efeito deΔmutante epsB na expressão do gene associado à defesa no
tabaco
Para investigar o efeito do ΔepsBmutante no gene de defesa
5
Patologia Vegetal Fisiológica e Molecular 119 (2022) 101834
expressão em tabaco, coletamos folhas de tabaco 4 dias após a inoculação
comR. solanacearumCQPS-1. Descobrimos que a pré-inoculação ΔepsB
estirpe induziu a expressão de genes envolvidos na via do ácido salicílico,
incluindoPR1a/c,PR2eNPR1(Fig. 5). Em comparação com as bactérias WT, a
expressão dePR1a/c,PR2eNRP1no ΔepsBo tratamento com cepas aumentou
4,5 vezes, 6,9 vezes e 2,2 vezes, respectivamente.
3.5. Acúmulo de níveis de SA em tabaco induzido por mutante ΔepsB
Experiências anteriores mostraram que ΔepsBmutante ativou
significativamente a expressão do gene de defesa no tabaco, determinamos se os
níveis endógenos foram afetados após ΔepsBinoculação de estirpe. Como
mostrado emFig. 6, os níveis de SA aumentaram dramaticamente 1 d e 3 d após Δ
epsBinoculação da cepa, mostrando aumentos de 0,06 e 0,09 μg/g FW em
comparação com o controle (P <0,05) (Fig. 6). Especialmente, os níveis de SA
aumentaram acentuadamente para um nível alto em 5 d em ΔepsBtratamento
cepa, com aumento de 1,58 vezes em comparação com o controle (P <0,01) (Fig. 6
A). Considerando que, o monte de JA não teve alteração significativa após ΔepsB
inoculação de estirpe (Fig. 6B). Essas descobertas sugerem que ΔepsB estirpe
promovem o acúmulo de ácido salicílico no tabaco.
4. Discussão
A descoberta de novos agentes de biocontrole é considerada um método
novo e eficiente para controlar a murcha bacteriana.27]. O uso de mutantes
avirulentos de patógenos empregados como agentes alternativos de
biocontrole tem sido estudado há décadas.28]. O efeito dos mutantes
avirulentos na competição ecológica e na indução da resistência sistêmica
da planta também foram investigados [12]. No estudo anterior, construímos
três Δeps mutantes (yang et al., 2021), o que confirmou que essas cepas
mutantes eram avirulentas para a planta (Figura 1). Portanto, pesquisamos o
efeito e o mecanismo dos mutantes na murcha bacteriana do tabaco.
Certos mutantes avirulentos deR. solanacearumforam demonstrados para
controlar a murcha bacteriana competindo com o patógeno e ativando a
resistência da planta hospedeira [11]. No estudo anterior, construímos três Δeps
mutantes (ΔepsB, ΔepsCe ΔwecC) que mostrou não patogenicidade no tabaco,
exibiu formação de biofilme significativamente reduzida e atividade de natação
induzida [20]. Neste estudo, descobrimos ainda que a pré-aplicação de Δepsos
mutantes inibiram significativamente a densidade bacteriana no solo da rizosfera
e reduziram o índice de doença da murcha bacteriana do tabaco. De fato, um dos
principais mecanismos de biocontrole é que cepas mutantes podem efetivamente
competir com bactérias patogênicas e reduzir a colonização e proliferação de
bactérias patogênicas em plantas. Trigalet et ai. [29] demonstrou queP.
solanacearumcepa avirulenta GMI1299 pode colonizar plantas de tomate e
prevenir a proliferação de bactérias patogênicas. Além disso,Δhrpmutantes deP.
solanacearumpoderia controlar a murcha bacteriana, excluindo o patógeno de
colonizar partes da planta [30]. Até certo ponto, o número de bactérias
patogênicas e a ocupação precoce do nicho ecológico nas rizosferas são a chave
para a infecção do patógeno. Chen et ai. [12] descobriram que a pré-inoculação do
ΔphcAmutanteR. solanacearumtrês dias antes do patógeno pode inibir as
populações do patógeno de forma mais eficaz do que a inoculação com o
patógeno ao mesmo tempo. Da mesma forma, Yang et al. [31] achar algoΔhrp
mutante não pode inibirR. solanacearumcrescimento diretamente, mas pode ser
colonizado na planta e impediu a reprodução da estirpe viruente após a pré-
inoculação. Da mesma forma, neste estudo, descobrimos que a população de
patógenos em solo rizosférico tratado com ΔepsBo tratamento de pré-inoculação
mutante foi significativamente reduzido em comparação com bactérias WT. Além
disso, as populações de ΔepsBmutantes foram quase 7,08 vezes maiores do que a
população de patógenos nas rizosferas. Juntos, cepas mutantes avirulentas deR.
solanacearumreduziu o número de bactérias patogênicas e infecção por locus e
competição espacial.
O acúmulo de EPS no sistema vascular requer uma colonização eficiente
e o conseqüente colapso do fluxo de água, o que pode causar sintomas de
murcha e, eventualmente, a morte da planta.32]. E aepsoperon contendo
epsBestá envolvida na produção e secreção extracelular
S. Li et ai.
da EPS I [1]. Em estudo anterior, descobrimos que oepsB-mutante de
deleção ΔepsBproduziu menos EPS [20] e a expressão dexpsReepsEgenes
foram down-regulation significativos em ΔepsBDeformação. Esses
resultados são consistentes com os achados relatados anteriormente por
Hayashi et al. [33]. Além disso, o nível de expressão defliCnão houve
diferença significativa entre as cepas (Figura 2). E Hayashi et al. [33]
observou um nível de expressão significativamente maior defliCem ΔepsBdo
que na estirpe OE1-1. No entanto, descobrimos que ΔepsBlinhagem exibiu
motilidade de natação significativamente maior do que a linhagem WT, o
que é consistente com o relatório de Hayashi et al. [33]. Assim, especulamos
que ΔepsBmutante deR. solanacearum CQPS-1 afeta genes relacionados à
motilidade flagelar. Além disso, o vsrBOs sistemas regulatórios de dois
componentes /vsrC regulam positivamente a expressão doepsoperão [34]. E
esses sistemas de dois componentes regulamxpsR e afetam a produção de
EPS I [1]. Nesta pesquisa, os resultados de RT-PCR mostraram que aepsB
levou a níveis de expressão significativamente reduzidos devsrBevsrC.
Portanto, a deficiência deepsBpode induzir um efeito de feedback negativo
dovsrBevsrCexpressão. No entanto, Hayashi et al. [33] determinou que a
expressão devsrBevsrCnão foram afetados pelo ΔepsBcom base na cepa na
análise do transcriptoma. Essa diferença de resultados pode estar
relacionada ao método de medição. Assim, seepsBpode positivamentevsrB/
vsrCcontinua a ser mais estudado. Além disso, a expressão diminuída dos
genes associados à virulência no Δepsos mutantes sugerem que o EPS I ou
seu produto intermediário da via de biossíntese do EPS atua como uma
molécula de sinalização em um loop de feedback da expressão gênica. Da
mesma forma, Hayashi et al. [33] demonstrou que o EPS I está associado ao
loop de feedback na detecção de quorum deR. solanacearumvariedade.
Por outro lado, o EPS pode ativar a resposta de defesa contra
R. solanacearumem tomate resistente à murcha [35]) e plantas de berinjela [36].
Da mesma forma, observamos que o ΔepsBmutante induziu a expressão de genes
de resistência de defesa e acúmulo de ácido salicílico (figos. 5 e 6). Um estudo
anterior descobriu que o ΔphcAmutante deR. solanacearum produziu menos EPS,
mas ainda induziu significativamente a expressão de genes da via de defesa [12].
Além disso, um estudo recente mostrou que bactérias virulentas mortas pelo calor
R. solanacearumGMI1000 induziu um maior nível de proteção do queEscherichia
coliao inocularArabidopsisraízes com
R. solanacearum[8]. Esses resultados indicaram que os componentes da superfície
do patógeno podem ser reconhecidos pelas plantas e podem induzir a resistência
do sistema vegetal. O LPS é identificado como um componente da superfície
celular que provoca respostas de defesa da planta.37,38]; Wang et al., 2020). Os
receptores de reconhecimento de padrão de superfície celular, como a primeira
camada do sistema de vigilância imune da planta, reconhecem características
moleculares conservadas de micróbios, como a flagelina bacteriana, para ativar
PTI [24,39]. Além disso, o domínio intracelular de ligação a nucleotídeos de plantas
e os receptores contendo repetições ricas em leucina (NLR) podem reconhecer
T3Es individuais e causar ETI [40]. Estudos anteriores mostraram que aumentar ou
diminuir a produção de EPS pode ativar a resistência do sistema vegetal. E
especulamos que as plantas podem reconhecer o LPS ou a flagelina de bactérias
mutantes sem a proteção da formação de biofilme circundante fornecida pelo EPS.
No entanto, se Δepsmutantes mudam a estrutura de EPS ou LPS
6
Patologia Vegetal Fisiológica e Molecular 119 (2022) 101834
Figura 6.Efeito de ΔepsBmutante em níveis
endógenos de SA e JA livres em plantas de
tabaco.
Plantas de tabaco com seis semanas de idade
foram inoculadas com ΔepsBmutante (1×108UFC/
mL, 10 mL/pote). SA e JA foram detectados em
extratos brutos de folhas de tabaco fresco 1, 3 e 5
dias após a inoculação. Cada barra representa a
média ±SE de três repetições. * e ** indicam
diferenças significativas entre os diferentes
tratamentos de acordo com o teste t de Student (P
< 0,05 eP <0,01).
e se esses compostos podem ser reconhecidos pelas plantas, justificam mais
pesquisas.
A indução de resistência da planta hospedeira por mutantes avirulentos é
considerada o principal mecanismo para controlar a murcha bacteriana. Etileno
(ET), ácido salicílico (SA) e ácido jasmônico (JA) são componentes críticos das
respostas sistêmicas das plantas à invasão de patógenos [41]. Estudo recente
demonstrou que oΔhrpGgenes mutantes regulados positivamente envolvidos na
biossíntese e sinalização do ácido abscísico (ABA) emArabidopsis, ativou o sistema
de defesa da planta e exibiu um forte efeito de proteção contra a murcha
bacteriana [8]. Enquanto isso, o ΔPhcAmutante de
R. solanacearuminduziu a expressão gênica do ácido salicílico [12]. Esses
resultados indicaram que o principal mecanismo pelo qual os mutantes
avirulentos controlam a murcha bacteriana está associado à indução de
resistência de defesa da planta. Neste estudo, ΔepsBestirpe induziu
significativamente a expressão de PR-1a/c,PR2eNPR1, que está associado à
via do ácido salicílico, sem afetar a expressão de genes envolvidos nas vias
do ácido jasmônico e do etileno. Diferentes mutantes podem ativar
diferentes vias de defesa da planta, e o mecanismo do ΔepsBmutante que
regula a via de defesa da planta no tabaco é digno de estudo futuro.
Neste estudo, encontramos um novo agente de biocontrole, o ΔepsB
mutante, que efetivamente reduziuR. solanacearumcolonização na rizosfera
do tabaco e suprimiu a doença da murcha bacteriana ativando a expressão
robusta de genes de resistência no tabaco. ΔepsBmutante exibiu ativação da
resistência sistêmica da planta hospedeira por sinalização de ácido salicílico.
Declaração do autor
Li Shili e Yang Liang: curadoria de dados, Ding Wei e Li Shili:
aquisição de financiamento, Yang Liang e Ran Yuao: investigação, Li
Shili e Yang Liang: metodologia, Ding Wei: supervisão, Shili Li e Liang
Yang: redação – rascunho original, Li Shili e Ding Wei: Redação – revisão
e edição.
Declaração de interesse concorrente
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes
conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam parecer influenciar o
trabalho relatado neste artigo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos projetos de ciência e tecnologia da
Sichuan Company of China Tobacco Corporation (SCYC201908) e pela
China Postdoctoral Science Foundation (2019M653320), Natural Science
Foundation of Chongqing (cstc2019jcyj-bshX0114).
S. Li et ai.
Apêndice A. Dados suplementares
Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em
https://doi. org/10.1016/j.pmpp.2022.101834.
Referências
[1]S. Genin, TP Denny, Patogenômica doRalstonia solanacearumcomplexo de
espécies, Annu. Rev. Phytopathol. 50 (1) (2012) 67–89.
[2]J. Mansfield, S. Genin, S. Magori, V. Citovsky, M. Sriariyanum, P. Ronald, M. Dow,
V. Verdier, SV Beer, MA Machado, I. Toth, G. Salmond, GD Foster, Top 10 bactérias
patogênicas de plantas em patologia molecular de plantas, Mol. Plant Pathol. 13 (6) (2012)
614–629.
[3]GF Jiang, Z. Wei, J. Xu, HL Chen, Y. Zhang, XM She, AP Macho, W. Ding, B.
S. Liao, murcha bacteriana na China: história, situação atual e perspectivas futuras,
Front. Plant Sci. 8 (2017) 1549.
[4]Y. Liu, DS Wu, QP Liu, ST Zhang, YM Tang, GF Jiang, SL Li, W. Ding, A distribuição
sequencial deRalstonia solanacearumnas zonas de cultivo de tabaco da China é
estruturado por elevação, Eur. J. Plant Pathol. 147 (3) (2017) 541–551.
[5]P. Li, L. Shi, MN Gao, X. Yang, W. Xue, LH Jin, DY Hu, BA Song, Atividades antibacterianas
contra ferrugem bacteriana das folhas do arroz e murcha bacteriana do tomateiro de 2-
mercapto-5-substituído-1, Derivados de 3,4-oxadiazol/tiadiazol, Bioorg. Med. Chem. Carta
25 (3) (2015) 481–484.
[6]WM Xu, FF Han, M. He, DY Hu, J. He, S. Yang, BA Song, Inibição da murcha bacteriana do
tabaco com derivados de sulfona contendo uma fração de 1,3,4-oxadiazol,
J. Agric. Química Alimentar. 60 (4) (2012) 1036–1041.
[7]Yuliar, YA Nion, K. Toyota, Tendências recentes em métodos de controle para doenças causadas por
murcha bacterianaRalstonia solanacearum, Microb. Ambiente. 30 (1) (2015) 1–11.
[8]DX Feng, C. Tasset, M. Hanemian, X. Barlet, J. Hu, D. Trémousaygue,
L. Deslandes, Y. Marco, Controle biológico da murcha bacteriana emArabidopsis thaliana
envolve sinalização de ácido abscísico, New Phytol. 194 (4) (2012) 1035–1045.
[9]Z. Wei, T. Yang, V.-P. Friman, Y. Xu, Q. Shen, A. Jousset, Arquitetura de rede trófica de
comunidades bacterianas associadas a raízes determina invasão de patógenos e
saúde das plantas, Nat. Comum. 6 (2015) 8413.
[10]C. Etchebar, D. Trigalet-Demery, F. van Gijsegem, J. Vasse, A. Trigalet, colonização do Xylem
por um mutante HrcV deRalstonia solanacearumé um fator chave para o controle
biológico eficiente da murcha bacteriana do tomateiro, Mol. Plant Microbe Interact. 11 (9)
(1998) 869–877.
[11]M. Hanemian, B. Zhou, L. Deslandes, Y. Marco, D. Tremousaygue, bactérias mutantes Hrp
como agentes de biocontrole: em direção a uma abordagem sustentável na luta contra
bactérias fitopatogênicas, Plant Signal. Behav. 8 (10) (2013).
[12]D. Chen, C. Li, K. Wu, G. Xun, S. Yuan, Q. Shen, B. Shen, AphcAmutante livre de marcadores deRalstonia
solanacearumcomo potencial agente de biocontrole da murcha bacteriana do tomateiro, Biol.
Controle 80 (2015) 96–102.
[13]H. Nakahara, T. Mori, N. Sadakari, H. Matsusaki, N. Matsusoe, Seleção de agentes não
patogênicos eficazesRalstonia solanacearumcomo agentes de biocontrole contra a
murcha bacteriana em berinjela, J. Plant Dis. Prot. 123 (3) (2016) 119–124.
[14]KL Johnson, GV Minsavage, JB Jones, Eficácia de um não patogênicoacidovorax citrulliestirpe como um
tratamento de sementes de biocontrole para mancha bacteriana da fruta de cucurbitáceas, Plant
Dis. 95 (6) (2011) 697–704.
[15]S. Freeman, A. Zveibil, H. Vintal, M. Maymon, Isolation of nonpathogenic mutants of fusarium
oxysporum f. sp. melonis para o controle biológico da murcha de fusarium em
cucurbitáceas, Phytopathology 92 (2) (2002) 164–168.
[16]J. Huang, BF Carney, TP Denny, AK Weissinger, MA Schell, Uma rede complexa
regula a expressão deepse outros genes de virulência dePseudomonas
solanacearum, J. Bacteriol. 177 (5) (1995) 1259–1267.
[17]J. Huang, W. Yindeeyoungyeon, RP Garg, TP Denny, MA Schell, controle transcricional
conjunto dexpsR, o incomum integrador de sinal doRalstonia solanacearumrede
reguladora de genes de virulência, por um regulador de resposta e um ativador
transcricional do tipo LysR, J. Bacteriol. 180 (10) (1998) 2736–2743.
[18]E. Saile, JA McGarvey, MA Schell, TP Denny, Papel do polissacarídeo extracelular e
endoglucanase na invasão de raízes e colonização de plantas de tomate por
Ralstonia solanacearum, Phytopathology 87 (12) (1997) 1264–1271.
[19]Y. Liu, YM Tang, XY Qin, L. Yang, GF Jiang, SL Li, W. Ding, sequenciamento do genoma
deRalstonia solanacearumCQPS-1, cepa do filotipo I coletada em área serrana com
cultivo contínuo de tabaco, Front. Microbiol. 8 (2017) 974.
Patologia Vegetal Fisiológica e Molecular 119 (2022) 101834
[20]L. Yang, ZL Wei, SL Li, R. Xiao, QQ Xu, YA Ran, W. Ding, metabólito secundário
vegetal, dafnetina reduz a produção de polissacarídeos extracelulares e fatores de
virulência deRalstonia solanacearum, Pestic. Bioquim. Physiol. 179 (2021).
[21]T. Yoshimochi, Y. Zhang, A. Kiba, Y. Hikichi, K. Ohnishi, Expressão dehrpGe a ativação do
regulador de resposta HrpG são controlados por sinais distintos da cascadesina Ralstonia
solanacearum, J. Gen. Plant Pathol. 75 (2009) 196–204.
[22]AN Tsoligkas, J. Bowen, M. Winn, RJ Goss, TW Overton, MJ Simmons, Caracterização de
engenharia revestida por rotaçãoEscherichia colibiofilmes usando microscopia de força
atômica, Colloids Surf. B Biointerfaces 89 (2012) 152–160.
[23]L. Yang, LT Wu, XY Yao, SY Zhao, J. Wang, SL Li, W. Ding, Hydroxycoumarins: novos e eficazes
compostos derivados de plantas reduzemRalstonia pseudosolanacearumpopulações e
controle da murcha bacteriana do tabaco, Microbiol. Res. 215 (2018) 15–21.
[24]Z. Wei, XM Yang, SX Yin, QR Shen, W. Ran, YC Xu, Eficácia deBacilo- adubo orgânico
fortificado no controle da murcha bacteriana do tomateiro no campo, Appl. Solo
Eco. 48 (2) (2011) 152–159.
[25]DS Wu, W. Ding, Y. Zhang, XJ Liu, L. Yang, ácido oleanólico Induz o sistema de
secreção tipo III deRalstonia solanacearum, Frente. Microbiol. 6 (2015) 1466.
[26]X. Pan, R. Welti, X. Wang, Análise quantitativa dos principais hormônios vegetais em extratos
vegetais brutos por cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa,
Nat. Protoc. 5 (6) (2010) 986–992.
[27]MJ Kwak, HG Kong, K. Choi, SK Kwon, JY Song, J. Lee, PA Lee, SY Choi,
M. Seo, HJ Lee, a estrutura do microbioma da rizosfera se altera para permitir a resistência à
murcha no tomate, Nat. Biotecnologia. 36 (11) (2018) 1100–1109.
[28]A. Trigalet, D. Demery, Invasividade em plantas de tomate de mutantes avirulentos
induzidos por Tn5 dePseudomonas-Solanacearum, Fisiol. Mol. Plant Pathol. 28 (3) (1986)
423–430.
[29]A. Trigalet, D. Trigalet-Demery, Uso de mutantes avirulentos dePseudomonas solanacearum
para o controle biológico da murcha bacteriana do tomateiro, Physiol. Mol. Plant Pathol.
36 (1) (1990) 27–38.
[30]P. Frey, P. Prior, C. Marie, A. Kotoujansky, A. Trigalet, Hrp mutantes dePseudomonas solanacearum
como potenciais agentes de biocontrole da murcha bacteriana do tomateiro, Appl. Ambiente.
Microbiol. 60 (9) (1994) 3175.
[31]YH Yang, JP Liu, CR Yang, HZ Gong, DX Feng, BY Xie, Control of Solanaceae murcha
bacteriana vegetal com avirulentohrp-mutantes, J. Plant Prot. 35 (5) (2008) 433–
437.
[32]TM Lowe-Power, D. Khokhani, C. Allen, ComoRalstonia solanacearumexplora e
prospera no ambiente de fluxo do xilema da planta, Trends Microbiol. 26 (11)
(2018) 929–942.
[33]K. Hayashi, W. Senuma, Kj Kai, K. Kiba, K. Ohnishi, Y. Hikichi, Major
exopolysaccharide, EPS I está associado ao loop de feedback na detecção de
quorum deRalstonia solanacearumestirpe OE1-1, Mol. Plant Pathol. 20 (12) (2019)
1740–1747.
[34]RP Garg, J. Huang, W. Yindeeyoungyeon, TP Denny, MA Schell, Regulação
transcricional multicomponente no promotor complexo do exopolissacarídeo I
operon biossintético deRalstonia solanacearum, J. Bacteriol. 182 (2000) 6659–
6666.
[35]A. Milling, L. Babujee, C. Allen,Ralstonia solanacearumpolissacarídeo extracelular é um
eliciador específico de respostas de defesa em tomateiros resistentes à murcha, PLoS
One 6 (1) (2011), e15853.
[36]A. Prakasha, ID Grice, KV Kumar, M. Sadashiva, H. Shankar, S. Umesha, polissacarídeo
extracelular deRalstonia solanacearum; Um forte indutor de defesa da berinjela
contra a murcha bacteriana, Biol. Controle 110 (2017) 107–116.
[37]SF Beyer, A. Beesley, PFW Rohmann, H. Schultheiss, U. Conrath, CJ
G. Langenbach, OArabidopsisa escopoletina de cumarina associada à defesa não
hospedeira protege a soja da ferrugem asiática da soja, Plant J. 99 (3) (2019) 397–413.
[38]A. Mithofer, Supressão da defesa da planta na simbiose rizóbio-leguminosa,
Trends Plant Sci. 7 (10) (2002) 440–444.
[39]JF Huang, Z. Wei, J. Hu, CL Yang, YA Gu, XL Mei, QR Shen, YC Xu, K. Riaz, Chryseobacterium
nankingensesp nov WR21 efetivamente suprimeRalstonia solanacearumcrescimento via
competição intensiva de exsudatos radiculares, BioControl 62 (4) (2017) 567–577.
[40]S. Boukaew, S. Chuenchit, V. Petcharat, Avaliação deStreptomycesspp. para controle
biológico deescleróciopodridão de raiz e caule eRalstoniamurcha de pimenta malagueta,
BioControl 56 (3) (2011) 365–374.
[41]A. Block, E. Schmelz, PJ O'Donnell, JB Jones, HJ Klee, tolerância sistêmica adquirida a
patógenos bacterianos virulentos em tomate, Plant Physiol. 138 (3) (2005) 1481–
1490.