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Controle Biológico 178 (2023) 105145

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Controle biológico

Página inicial do jornal:www.elsevier.com/locate/ybcon

Compostos voláteis produzidos por bactérias endofíticas afetam adversamente as

características de virulência deRalstonia solanacearum

Maryam Yousefvand, Behrouz Harighi*, Abdolbaset Azizi

Departamento de Proteção Vegetal, Faculdade de Agricultura, Universidade do Curdistão, Sanandaj, Irã

DESTAQUES

• Várias bactérias endofíticas foram identificadas comoBaciloespécies usando análise molecular.

• Bactérias endofíticas identificadas têm atividade antagônica contraRalstonia solanacearum.
• Essas cepas produzem VOCs com atividade antibacteriana.
• Esses VOCs inibiram as características de virulência deR. solanacearum in vitro.
• VOCs reduziram a incidência de murcha de batata causada porR. solanacearumem estufa.

ARTIGOINFO ABSTRATO

Palavras-chave: Neste estudo, investigamos os efeitos de compostos orgânicos voláteis (VOCs) produzidos por bactérias endofíticas
murcha bacteriana
pertencentes aoBacilogênero sobre as características de virulência deRalstonia solanacearumR32, o agente causal da murcha
Controle biológico
bacteriana da batata. Os resultados da análise de cromatografia gasosa-espectrometria de massa mostraram que as cepas
bactérias endofíticas
B. safensisHar267,B. pumilusFer469,B. zhangzhouensisKh690,B. aeriusKh867, eB. wiedmanniiAh945 capaz de produzir 10, 4,
Batata
18, 6 e 12 VOCs com alta qualidade, respectivamente. Todas as bactérias endofíticas produziram VOCs que reduziram
Ralstonia solanacearum
características de virulência
significativamente os sintomas de murchana planta, inibiu a população celular deR. solanacearumR32em vitro, e reduziu a
Compostos voláteis população de células tanto na parte aérea quanto nas raízes das plantas inoculadas em diferentes níveis. Os VOCs reduziram
significativamente a fixação deR. solanacearumCélulas R32 para tecidos radiculares de plantas de batata, bem como
motilidade quimiotaxica para extrato de raiz. Nossos resultados revelaram que os VOCs podem reduzir a motilidade de
enxame, natação, espasmos e formação de biofilme porR. solanacearumR32 que são importantes para a patogenicidade. A
análise de microscopia eletrônica de varredura revelou várias anormalidades morfológicas noR. solanacearumCélulas R32
expostas aos VOCs produzidos porB. safensisHar267 eB. aeriuscepas Kh867. Os resultados apresentados neste estudo
mostraram que os VOCs produzidos por bactérias endofíticas investigadas podem reduzir a doença da murcha bacteriana. A
investigação dos mecanismos das atividades de biocontrole aumenta nosso conhecimento para projetar melhores métodos
para controlar patógenos bacterianos.

1. Introdução 2014). Após a infecção das plantas,R. solanacearummultiplica e produz

Ralstonia solanacearumcomo uma bactéria transmitida pelo solo causa a doença de
murcha vascular em mais de 200 espécies de plantas em todo o mundo e foi classificada
como o segundo patógeno bacteriano mais importante (Peeters e outros, 2013). Para
localizar as raízes das plantas, as células bacterianas exigiam detecção, quimiotaxação e
motilidade flagelar em relação aos exsudatos das raízes.Tans-Kersten et al., 2001; Yao e
Allen, 2006).R. solanacearumAs células aderem à superfície da raiz através da produção
de exopolissacarídeos, entram nas raízes através de feridas ou aberturas naturais e,
finalmente, atingem os vasos do xilema.Dalsing e Allen,
exopolissacarídeos e outros fatores de virulência resultando no desenvolvimento
dos sintomas de murcha (Genin e Denny, 2012). Dentro dos vasos do xilema,
algunsR. solanacearumas células usam motilidade contraída para se mover ao
longo da parede do vaso (Liu e outros, 2001).
A murcha vascular é conhecida como um dos fatores mais limitantes no
cultivo de plantas de batata em todo o mundo.Elfinstone, 2005). A ampla
gama de hospedeiros do agente causal e a adaptabilidade para sobreviver
em várias condições ambientais por longos períodos tornam o controle
muito difícil. O manejo da doença com diferentes estratégias

* Autor correspondente.
Endereço de email:bharighi@uok.ac.ir (B. Harighi).

https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2022.105145
Recebido em 22 de novembro de 2022; Recebido no formulário revisado em 20 de dezembro de 2022; Aceito em 29 de dezembro de 2022
Disponível online em 7 de janeiro de 2023
1049-9644/© 2022 Elsevier Inc. Todos os direitos reservados.
M. Yousefvand et al.
incluindo métodos físicos, químicos, culturais e biológicos tem sido
extensivamente investigado.Yuliar et al., 2015). Nenhum método de controle
parece ser completamente adequado contra a murcha bacteriana. Nesse sentido,
o controle biológico utilizando bactérias com atividade antagônica parece ser um
método seguro e de baixo custo para o manejo da murcha bacteriana.Álvarez et
al., 2019). Vários estudos indicaram o potencial de bactérias como agentes de
controle biológico, incluindo cepas não patogênicas de
R. solanacearum, rizobactérias promotoras do crescimento de plantas e bactérias
endofíticas no controle da murcha bacteriana (Yuliar et al., 2015).
Bactérias endofíticas colonizam plantas internamente como patógenos
de plantas e podem ter o potencial de competir e suprimir a virulência de
organismos patogênicos.Rosenblueth e Martinez-Romero, 2006). O
crescente interesse em bactérias endofíticas para o controle de doenças de
plantas é baseado em sua capacidade de ser biologicamente ativo contra o
patógeno por meio da competição pela absorção de nutrientes, antibiose,
produção de sideróforos, produção de enzimas e/ou indução de resistência
sistêmica.Compant et al., 2005).
Foi relatado que as bactérias produzem e liberam vários compostos
orgânicos voláteis (VOCs) com atividades biológicas significativas, incluindo a
inibição do crescimento de fitopatógenos.Garbeva e Weisskopf, 2020). VOCs
são definidos como pequenas moléculas menores que 300 Dalton com baixo
ponto de ebulição e alta pressão de vapor. Essas moléculas podem se
espalhar facilmente no ambiente mesmo a distâncias (Chowdhury e outros,
2019). A atividade antibacteriana direta de VOCs bacterianos foi relatada.
Muitos agentes de biocontrole comoPseudomonaseBaciloEspécies têm sido
relatadas como emissoras de VOCs com ações antibacterianas contra
patógenos bacterianos de plantas.Rajer et al., 2017; Xie e outros, 2018). Foi
demonstrado que os VOCs emitidos porBacillus amyloliquefaciensSQR-9 e
Pseudomonas fluorescens WR-1 pode reduzir as características de virulência
deRalstonia solanacearum(Raza et al., 2016a; Raza et al., 2016b). Além disso,
VOCs liberados porBacilo spp. foram encontrados para ter efeitos inibitórios
e causar anormalidades morfológicas emR. solanacearumcélulas (Tahir et
al., 2017). Além disso, foram relatados os efeitos de VOCs bacterianos na
indução de resistência sistêmica em plantas. VOCs produzidos porBaciloe
Pseudomonas cepas demonstraram melhorar a resistência em plantas
contra Erwinia carotovorasubesp.carotovoraeR. solanacearm(Ryu et al.,
2004; Tahir et al., 2017; Kashyap et al., 2022).
Os principais objetivos do presente estudo foram identificar bactérias
endofíticas como potenciais agentes antagonistas contraR. solanacearumR32,
avaliar os efeitos dos VOCs produzidos por essas bactérias endofíticas na taxa de
crescimento, alteração estrutural e características de virulência, como motilidade,
quimiotaxia, fixação e formação de biofilme. Além disso, os principais VOCs
produzidos por bactérias endofíticas contraR. solanacearumR32 foram
identificados usando cromatografia gasosa-espectrofotometria de massa (GC-MS).
2. Materiais e métodos
2.1. Cepas bacterianas e condições de crescimento
As bactérias endofíticas previamente isoladas das diferentes plantas,
bem comoRalstonia solanacearumR32 (GenBank Acc. Nº OP713766), que
exibiu doença de murchamento em plantas de batata obtidas do
departamento de proteção de plantas, Universidade do Curdistão foram
usados neste estudo. Consequentemente, as bactérias endofíticas e o
patógeno bacteriano foram cultivados em ágar nutriente (NA) ou cloreto de
trifeniltetrazólio (TTC), respectivamente, e depois armazenados a 4–6◦C como
estoque de trabalho ou cultivado em meio de caldo nutritivo (NB) por 24 h a
26–28◦C com agitação. Por fim, glicerol estéril foi adicionado à concentração
final de 20% e armazenado a - 20◦C para armazenamento a longo prazo.
2.2. Identificação molecular das bactérias endofíticas
Cepas bacterianas endofíticas foram identificadas por sequenciamento
parcial de nucleotídeos do16S rRNAgene usando PCR com dois primers
universais, fD2 (5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′, posição 8–27) e rP1 [5′-
2
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ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3′, posição 1512–1492 (Escherichia coli)] (
Weisburg e outros, 1991), egyrBgene usando primersgyrBF (5′- TTA TCT ACG
ACC TTA GAC G − 3′) egyrBR (5′- TAA ATT GAA GTC TTC TCC G − 3′) com base
no método descrito anteriormente (Liu e outros, 2013). Os produtos de PCR
foram sequenciados usando um sequenciador de DNA ABI3730XL (Applied
Biosystems). O16S rRNAegyrBas sequências de genes obtidas foram
alinhadas e ajustadas manualmente quando necessário usando o software
BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.9.0 (Salão, 2011). As comparações de
sequências foram realizadas com outras sequências depositadas no banco
de dados NCBI usando o programa BlastN. A análise filogenética de Máxima
Verossimilhança foi realizada usando o software MEGA versão 6.0 (Tamura e
outros, 2013) e uma árvore filogenética foi construída (foi realizada análise
de bootstrap com 1000 réplicas).
2.3. Efeito dos VOCs no desenvolvimento da murcha
Os tubérculos de batata (cultivar Sprite) foram semeados em vasos de
plástico contendo solo esterilizado a vapor (composto por 50% de areia, 20%
de argila, 30% de turfa, pH 7,2). A suspensão deR. solanacearumCélulas R32
com ou sem exposição aos VOCs de cepas de bactérias endofíticas por três
dias a 28–30◦C foi preparado em água estéril (densidade de cerca de 1×108
UFC. ml−1). As hastes das mudas de batata foram pontuadas com palito
estéril e 50µL foi inoculado (entre o terceiro e o quarto internódio) usando
uma seringa estéril. As plântulas foram incubadas em casa de vegetação
(85% de umidade, 28–30◦C, fotoperíodo 12h/12h dia/noite). O relativo da
incidência da doença e eficácia do biocontrole foi calculado usando a
seguinte fórmula (Kheirandish e Harighi, 2015).
Incidência da doença = (número de folhas murchas por vaso/ número total de
folhas por vaso)×100.
Eficácia do biocontrole = [(incidência da doença nos vasos de controle - incidência da
doença nos vasos tratados com antagonista)/incidência da doença no controle]×
100. Vasos tratados com antagonista e controle incluem plântulas
inoculadas com patógeno bacteriano não exposto ou pré-exposto com
VOCs, respectivamente.
As plantas inoculadas foram então cortadas acima do solo, o peso fresco dos
brotos foi medido e depois secos em estufa a 80◦C por 72 h e o peso seco foi
medido. Os experimentos em casa de vegetação foram conduzidos em arranjo
fatorial em delineamento inteiramente casualizado com três repetições e três
experimentos individuais. Plantas inoculadas com não expostasR. solanacearum
R32 e água estéril foram usados como controle positivo e negativo,
respectivamente. A análise dos dados foi realizada usando o programa de
software SAS e a comparação das médias foi feita com o teste da diferença
mínima significativa (Duncan) a um nível de probabilidade de 5%.
2.4. Avaliação da atividade antibacteriana de VOCs produzidos por
bactérias endofíticas
A atividade antibacteriana dos VOCs contraR. solanacearumR32 foi
avaliado em meio de casaminoácido-peptona-glicose (CPG) usando
placas divididas. O crescimento noturno das bactérias endofíticas
(ajustado para a concentração de cerca de 1×108UFC.mL−1) foi semeada
em um compartimento da placa, enquanto o outro compartimento foi
inoculado pontualmente com 50µL do patógeno (1×107UFC.mL−1). No
controle, o patógeno foi cultivado sozinho. As placas foram seladas
com parafilme e então incubadas a 28–30◦C por 3 dias. A partir daí, a
população celular doR. solanacearumR32 foi medido por placa (Tahir et
al., 2017). Três repetições foram realizadas para cada tratamento.
2.5. Efeito de VOCs na colonização de R. solanacearum R32
As bactérias endofíticas (1×108UFC.mL−1) foi espalhado em um
compartimento da placa dividida contendo meio Nutrient Agar (NA),
enquanto o outro compartimento (meio CPG) foi inoculado com 50µL doR.
solanacearumR32 (1×107UFC.mL−1). As placas foram então incubadas a
28-30◦C por 48 horas, oR. solanacearumAs células R32 foram suspensas em
água destilada estéril, a concentração ajustada para
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108UFC.mL−1com um espectrofotômetro, e 1 mL foi adicionado a cada pote
contendo tubérculos de batata previamente preparados conforme descrito na
seção 4.2. Potes sem suspensão bacteriana servem como controles. Os vasos
foram mantidos em casa de vegetação com ciclo claro/escuro de 12:12 h a 28–30◦C
e irrigados com água estéril em intervalos de dois dias. Após 28 dias, raízes e
brotos foram selecionados, esterilizados superficialmente com hipoclorito de
sódio a 1% por 3 a 5 minutos e lavados várias vezes com água estéril. Os tecidos
vegetais foram então homogeneizados assepticamente com um pilão e almofariz
em 1 mL de água destilada esterilizada. Alíquotas de 50µL foram espalhados em
meio CPG, incubados a 26–28◦C por 48 h, e as colônias foram contadas como
UFC.g−1de tecidos vegetais frescos. Todos os experimentos foram repetidos três
vezes com três repetições independentes.
2.6. Ensaio de fixação da raiz de batata
R. solanacearumSuspensões de células R32 com ou sem exposição a
VOCs de bactérias endofíticas por 72 h a 26–28◦C foram preparados (ajustados
para cerca de 1×107UFC.mL−1). Posteriormente, raízes de batata não feridas foram
submersas em suspensões de patógenos por 1 h. Em seguida, os segmentos
radiculares inoculados foram colocados individualmente em 15 mL de água
destilada estéril. Após agitação por 10 s, o excesso de água foi removido
suavemente. Um grama foi separado das pontas das raízes e triturado, diluído
seriadamente em água destilada estéril e semeado para quantificar UFC.g−1da raiz
(Dalsing e Allen, 2014). Três repetições foram consideradas para cada tratamento.
2.7. Efeito de VOCs na produção de EPS por R. solanacearm
Extração e quantificação de EPS foram realizadas usando o método
descrito anteriormente (Dubois e outros, 1956). Resumidamente, o
R. solanacearumCélulas R32 com e sem exposição aos VOCs de bactérias
endofíticas por 72 h foram suspensas em água destilada esterilizada e
agitadas a 40◦C por meia hora para solubilizar o EPS presente na solução e
depois centrifugar a 12.000gpor 10 min. Em seguida, dois volumes de etanol
gelado foram adicionados ao sobrenadante coletado e incubados a 4◦C por
24h. O EPS precipitado foi obtido por centrifugação a 12.000gpor 10 min a 4◦
C, dissolvido em água destilada esterilizada e após dois dias, o teor de EPS
foi quantificado pelo método fenol-ácido sulfúrico. Esses experimentos
tiveram três réplicas.
2.8. Ensaio de formação de biofilme
A capacidade de formação de biofilme deR. solanacearumCélulas R32 com ou
sem exposição aos VOCs de bactérias endofíticas foram testadas em tubos de
polipropileno. Crescimento noturno de cepas bacterianas endofíticas (1×108
UFC.mL−1) foram preparados e 10 μL foram cultivados em um compartimento das
placas divididas contendo meio NA. No outro compartimento, um microtubo
contendo 190 μL de meio caldo CPG que foi inoculado com 10 μL deR.
solanacearumR32 (1×107UFC.mL−1) foi colocado verticalmente. As placas foram
então seladas com parafilme e mantidas a 28–30◦C por 48h. Em seguida, 25 μL de
solução de cristal violeta a 1% foram adicionados a cada tubo e mantidos em
temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, os tubos foram lavados duas
vezes com tampão fosfato. Posteriormente, 2 ×200 μL de etanol 95% foram
adicionados a cada tubo, o volume resultante foi levado a 1 mL com água
destilada estéril e a absorbância foi medida a 540 nm usando um
espectrofotômetro (SPECORD 210, Analytik Jena, Alemanha). O experimento foi
conduzido em delineamento inteiramente casualizado com três repetições (
O'Toole e Kolter, 1998).
2.9. Comportamentos de motilidade de enxame, natação e espasmos
Para o ensaio de motilidade de enxame, crescimento durante a noite de
R. solanacearumR32 (concentração aproximada de 107UFC.mL−1) foi
preparado e 2µL foi colocado em um compartimento das placas divididas
contendo meio CPG mais 0,7% de ágar. No outro compartimento, 30µL das
bactérias endofíticas (concentração aproximada de
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108UFC.mL−1) foi semeada em meio NA. Para os ensaios de motilidade de natação
e espasmos, 2µL de preparado na horaR. solanacearumR32 foi manchado em
placas contendo meio CPG mais 0,2 e 1,6% de ágar, respectivamente. Nas demais
placas, 30µL das bactérias endofíticas foram semeadas em meio NA e ambas as
placas foram colocadas em lados opostos. Em seguida, todas as placas foram
seladas com parafilme e incubadas a 26–28◦C. Os diâmetros dos halos de
enxameação, natação e motilidade espasmódica foram medidos a cada intervalo
de 12 h. Para a motilidade espasmódica, a morfologia das bordas da colônia foi
observada usando um microscópio de luz. O experimento foi feito em três
repetições (Tahir et al., 2017).
2.10. ensaio de quimiotaxia
Bactérias endofíticas foram semeadas em um compartimento das placas
divididas contendo meio NA conforme descrito anteriormente. No outro
compartimento, meio tampão de quimiotaxia (0,1 mM EDTA, 10 mM K2HPO4,
ágar 0,35%, pH 7,2) foi preparado, o orifício de 5 mm do meio foi removido
e, em seguida, preenchido novamente com 50µL de extrato de raiz de batata
(cultivar Sprite). Então, preparado na horaR. solanacearumAs células R32
foram inoculadas no local a uma distância de 15 mm do orifício. As placas
foram seladas com parafilme e então incubadas a 28–30◦C. O movimento do
R. solanacearumAs células R32 em direção ao extrato da raiz foram medidas
por contagem de CFU.mL−1da célula em meio CPG. Este experimento foi
realizado em três repetições (Tahir et al., 2017).
2.11. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi conduzida para observar
mudanças morfológicas externas noR. solanacearumCélulas R32. Células
bacterianas com ou sem exposição aos VOCs de bactérias endofíticas por
dois dias a 26–28◦C foram coletados em tubos Eppendorf, lavados com água
destilada esterilizada e centrifugados (10 min, 3600g, 4◦C). Em seguida, as
células peletizadas foram espalhadas na lâmina limpa. Após fixação em
solução de glutaraldeído 2,0% por 2 h em temperatura ambiente, a amostra
foi lavada duas vezes com água destilada esterilizada. A desidratação
seriada foi feita em soluções de etanol de 20%, 40%, 60%, 80% e 100% por
10 minutos cada vez, seguida de etanol 100% por 1 hora. As amostras foram
então colocadas a -20◦C durante a noite seguido pelo processo de liofilização
a - 40◦C por 3h. Finalmente, as amostras foram revestidas com ouro e
micrografias eletrônicas foram feitas usando um sistema TSCAN SEM (TSCAN
SEM, TSCAN, Tchecoslováquia).
2.12. Identificação de VOCs produzidos por bactérias endofíticas usando
GC–análise MS
Para coletar os VOCs produzidos por cada bactéria endofítica, foi
utilizada uma placa de três compartimentos. Um compartimento contendo
meio NA foi semeado com 100µL (1×108UFC.mL−1) crescimento recente de
cada bactéria endofítica, e o segundo compartimento contendo meio CPG
foi inoculado com 5µL (1×107UFC.mL−1) de
R. solanacearumR32, e no terceiro compartimento foi colocado 0,3 g de
carvão ativado estéril para adsorver os VOCs. Além disso, o mesmo desenho
experimental sem bactérias endofíticas foi usado como controle.
Posteriormente, as placas foram seladas com parafilme e incubadas a 28–30
◦C por 72h. Em seguida, as armadilhas de carvão ativado foram transferidas
para frascos de vidro e acetato de etila (1: 1,25 W/V) foi adicionado. Os VOCs
adsorvidos foram extraídos por agitação por 20 min, seguido de
centrifugação (2500g, 5 min) e os sobrenadantes foram analisados usando
um dispositivo de cromatografia gasosa conectado a um espectrômetro de
massa (Agilent 7890B GC System / 5977A MSD).
Um microlitro da amostra coletada foi injetado na coluna HP-5 ms
(30 m×0,25 mm, 0,25µm), a temperatura inicial da coluna foi fixada em
60◦C, que foi então aumentado para 260◦C a uma taxa de 7◦C.min−1, e
mantida por 5 min. O espectrômetro de massa foi operado no modo de
ionização de elétrons a 70 eV, com varredura contínua de 50 a 550m/z.
Gás de arraste hélio com pureza de 99,999%, pressão de 34 psi e
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taxa de fluxo de 1 mL.min−1foi utilizado nesta fase. Os compostos foram
identificados comparando seus espectros de massa com os bancos de dados do
dispositivo, incluindo os bancos de dados do National Institutes of Standards and
Technology (NIST) e Wiley, juntamente com a comparação dos índices de inibição
e o padrão de falha relatado para eles (Dewanjee e outros, 2015).
2.13. Análise estatística
Os dados de cada experimento foram avaliados estatisticamente por meio de
análise de variância (ANOVA), seguida de diferença menos significativa (LSD) e
teste de Duncan (P=0.05), empregando SAS ver. software 9.1. Todos os
experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado.
Gráficos e figuras foram plotados usando o programa Excel.
3. Resultados
3.1. Identificação das bactérias endofíticas
As sequências de nucleotídeos obtidas foram submetidas ao banco de dados
de sequências de nucleotídeos do NCBI sob os números de acesso OP217053-
OP217057 e OP267569-OP267573 para o16S rRNAegyrBgenes, respectivamente.
Resultados do sequenciamento parcial de nucleotídeos do16S rRNAe gyrBgenes
revelaram que cepas bacterianas endofíticas agrupadas no Bacilogênero. Os
resultados da pesquisa Blast revelaram que as cepas Har267, Fer469, Kh690,
Kh867 e Ah945 tinham 99-100% de similaridade comB. safensis, B. pumilus, B.
zhangzhouensis, B. aerius,eB. wiedmannii,respectivamente. O
Figura 1.Árvore filogenética de parciais16S rRNAegyrBsequências de genes que mostram a posição de cepas de bactérias endofíticas (mostradas em negrito), além de cepas de
referência selecionadas taxonomicamente semelhantes. A análise foi realizada pelo método de Máxima Verossimilhança com modelo de cálculo Tamura-Nei no MEGA versão 6.0. A
barra de escala representa o número de substituições por site. Os números nos pontos de ramificação indicam o valor de bootstrap derivado de 1.000 réplicas.
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foi construída uma árvore filogenética que mostra a posição da cepa
entre as cepas-tipo dos gênerosBaciloespécies (Figura 1).
3.2. Efeito de VOCs no desenvolvimento da doença da murcha bacteriana
A análise estatística revelou diferenças significativas entre os
tratamentos quanto à inibição do desenvolvimento da murcha (F = 848,34; P
<0,0001) porR. solanacearumR32 exposto a VOCs produzidos por bactérias
endofíticas em comparação com o controle (tabela 1). Os resultados obtidos
revelam que os VOCs produzidos pelas cepasB. wiedmanniiAh945 eB.
zhangzhouensisKh690 com cerca de 100% teve os maiores efeitos
decrescentes no desenvolvimento da murcha porR. solanacearumR32 (
Figura 2DE ANÚNCIOS). A análise estatística revelou diferenças significativas
entre os tratamentos quanto ao aumento da massa fresca (F = 21,55; P<
0,0001) e peso seco (F = 6,18; P = 0,0025) de brotos em planta inoculada por
R. solanacearumR32 exposto a VOCs produzidos por bactérias endofíticas
em comparação com o controle não tratado (tabela 1). DeformaçãoB.
zhangzhouensisKh690 eB. wiedmanniiAh945 com cerca de 81% e 79%, teve
os maiores efeitos de aumento no peso fresco da parte aérea (Figura 2B). Da
mesma forma, cepasB. zhangzhouensisKh690 eBacillus wiedmanniiAh945
com cerca de 49% e 43%, teve os maiores efeitos de aumento no peso seco
da parte aérea (Figura 2C).
3.3. Atividade antibacteriana de VOCs contra R. solanacearum R32
De acordo com a análise estatística, diferenças significativas foram
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tabela 1 e a colonização radicular foi avaliada quantitativamente (CFU.g−1de tecidos

Efeito de VOCs produzidos por bactérias endofíticas no desenvolvimento da murcha por vegetais). A análise estatística revelou diferenças significativas entre os
Ralstonia solanacearumR32 em condições de casa de vegetação e análise de variância tratamentos em relação à raiz (F = 65,55; P<0,0001) e colonização de brotos
(ANOVA) dos dados. (F = 20,26; P<0,0001) porR. solanacearumR32 exposto a VOCs produzidos por
Média do Quadrado bactérias endofíticas em comparação com o controle (mesa 2). Nas raízes,
Fonte de df controle biológico Peso fresco de Peso seco de estirpesBacillus wiedmanniiAh945 e
variação atividade (%) tiro (g) tiro (g) B. zhangzhouensisKh690 com 95% apresentou os maiores efeitos de
redução seguido porB. aeriusKh867,B. safensisHar267, eB. pumilusFer469
Har267 11.67b 17.23b 3.48abc
Fer469 6.67b 11.61b 2.11c com efeitos de redução de 56% e 50%, respectivamente (Fig. 3B). Além disso,
Kh690 100a 47,97a 4,93a nossa descoberta revelou que VOCs produzidos por cepasB. wiedmannii
Kh867 3.71b 11.03b 2.38bc Ah945 eB. zhangzhouensisKh690 diminuiu as populações de
Ah945 100a 44.04a 4.46ab
R. solanacearumR32 para cerca de 80,32%, seguidoB. safensisHar267,
Ctrl+ 0b 9.51b 2.54bc
Ctrl- 100a 36,79a 4.30ab B. pumilusFer469, eB. aeriusKh867 em 49% de efeito de redução em brotos em
Tratamento 6 7688,66* 851,30* 3,86* comparação com o controle não exposto (Fig. 3C).
Erro 14 22.07 89,50 0,63
valor F 848,34 21h55 6.18
CV (%) 8,70 14.69 12.91 3.5. Efeito de VOCs de bactérias endofíticas na fixação radicular de R.
solanacearum R32
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade; df = Graus de Liberdade; CV = coeficiente de
variação; A significância entre as médias de tratamento é apresentada como as diferentes letras
A habilidade deRalstonia solanacearumCélulas R32 pré-expostas a VOCs
minúsculas. Os dados são apresentados como a média de três réplicas.
de bactérias endofíticas para se ligarem às raízes de plantas de batata
(cultivar sprite) foram investigadas. Com base nos resultados da ANOVA,
encontrado entre os tratamentos em termos de redução da população de células
existiram diferenças significativas entre todos os tratamentos (F = 29,37; P<
(F = 77,73; P<0,0001) doR. solanacearumR32 exposto a VOCs produzidos por
0,0001) (mesa 2). A maior inibição pertenceu aB. wiedmanniiAh945 e
bactérias endofíticas em comparação com o controle (mesa 2).
B. zhangzhouensisKh690 com 95,99% e 91,03%, respectivamente,
Todas as bactérias endofíticas reduziram significativamente a população
seguido porB. pumilusFer469 (56,36%), B. aeriusKh867 (53,96%) e
celular doR. solanacearumR32 em vários níveis em comparação com o
B. safensisHar267 (45,31%) em comparação com o controle (Fig. 4A).
controle. DeformaçãoB. zhangzhouensisKh690,B. wiedmanniiAh945, eB.
safensis Har267 com cerca de 45,34%, 44,76% e 43,02% de redução da
população de células, respectivamente, apresentou o maior efeito, seguido 3.6. Efeito de VOCs na produção de EPS e biofilme por R. solanacearum
porB. pumilusFer469, eB. aeriusKh867 com reduções de 28,48%% e 34,30%, R32
respectivamente (Fig. 3A).
Com base nos resultados da ANOVA, existem diferenças significativas entre os
tratamentos em termos de produção de EPS porR. solanacearumR32 (F = 27536,4;
3.4. Efeito de VOCs na colonização de R. solanacearum R32 P<0,0001) (mesa 2). Os VOCs produzidos pelas cepas Ah945 e Kh690 mostraram
um efeito negativo significativo, enquanto a diminuição na produção de EPS foi de
Vinte e oito dias após o tratamento das mudas de batata com 55,51% e 44,38%, respectivamente, após a exposição aos VOCs em comparação
R. solanacearumCélulas R32 expostas a VOCs de bactérias endofíticas, parte aérea com o controle (Fig. 4B).

Figura 2.Efeitos de VOCs produzidos porB. safensisHar267,B. pumilusFer469,B. zhangzhouensisKh690,B. aeriusKh867, eB. wiedmanniiAh945 em (a) incidência da doença,
(b) peso fresco da parte aérea, (c) peso seco da parte aérea e (d) plantas de batata inoculadas representativas porR. solanacearumR32 comparado ao controle não exposto
(Ctrl+) ou inoculado por água estéril (Ctrl-). As barras de erro indicam o SE das três réplicas. Letras diferentes indicam diferenças significativas (P =0,05).

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mesa 2
Efeito de VOCs produzidos por bactérias endofíticas na população celular, colonização de raízes e brotos, fixação e produção de exopolissacarídeos (EPS) de
R. solanacearumR32 e análise de variância (ANOVA) dos dados.
Média do Quadrado

Fonte de df Atividade antibacteriana (OD600 Colonização (CFU×107/g de Colonização (CFU×104/g de Anexo (CFU×104/g de raiz) EPS
variação nm) raiz) broto) (µg/ml/
OD)

Har267 0,98c 80b 3b 17.7b 1,98a

Fer469 1.24b 83b 2.9b 14.2b 1,68b
Kh690 0,94c 7.8c 1.2c 2.9c 1.09c
Kh867 1.13b 71b 3b 14.9b 2.01a
Ah945 0,96c 8.8c 1.2c 1.3c 0,88d
Ctrl 1,73a 160a 5.8a 32.4a 1,97a
Tratamento 5 0,269** 9.35** 846952338** 3.842** 0,740**
Erro 12 0,0034 1.427 41.797.055 1.308 0,000026
valor F 77,73 65,55 20.26 29.37 27536.4
CV (%) 5.07 17.52 22.77 19,98 0,32

* * Significativo ao nível de 1% de probabilidade; df = Graus de Liberdade; CV = coeficiente de variação; A significância entre as médias de tratamento é apresentada como as diferentes letras
minúsculas. Os dados são apresentados como a média de três réplicas.

Figura 3.Efeitos de VOCs produzidos porB. safensisHar267,B. pumilusFer469,B. zhangzhouensisKh690,B. aeriusKh867, eB. wiedmanniiAh945 na população celular de
R. solanacearumR32 (a) em ensaio de cultura dupla, (b) raízes de batata inoculadas e (c) brotos de batata inoculados em comparação com o controle não exposto (Ctrl). As barras de erro
indicam o SE das três réplicas. Letras diferentes indicam diferenças significativas (P = 0,05).

Figura 4.Efeitos de VOCs produzidos porB. safensisHar267,B. pumilusFer469,B. zhangzhouensisKh690,B. aeriusKh867, eB. wiedmanniiAh945 em (a) fixação radicular, (b)
produção de exopolissacarídeo (EPS) e (c) formação de biofilme deR. solanacearumR32 em comparação com o controle não exposto (Ctrl). As barras de erro indicam o SE
das três réplicas. Letras diferentes indicam diferenças significativas (P = 0,05).

Conforme apresentado emTabela 3, o resultado da ANOVA mostrou diferença
significativa entre todos os tratamentos na produção de biofilme por
R. solanacearumR32 comparado com o controle não exposto (F = 5,23; P =
0,0089). Os VOCs produzidos por bactérias endofíticas revelaram um efeito
de inibição significativo na formação de biofilme porR. solanacearum R32.O
resultado indica diminuição de 58,80% e 53,84% na formação de biofilme
porR. solanacearumR32 exposto a VOCs deB. wiedmannii Ah945 eB.
zhangzhouensiscepas Kh690, respectivamente (Fig. 4C).
3.7. Efeito de VOCs nos comportamentos de motilidade de R. solanacearum R32
De acordo com a análise estatística, existem diferenças significativas
entre os tratamentos na enxameação (F = 7,93; P<0,0001), natação (F = 9,20;
P<0,0001) e espasmos (F = 7,22; P<0,0001) avaliações de motilidade (Tabela 3
). Nossa descoberta revelou que a motilidade de enxame deR. solanacearum
Células R32 expostas a VOCs de cepas bacterianas endofíticas foram
significativamente inibidas após 72 h. Conforme ilustrado em Fig. 5A e B, as
cepasB. safensisHar267,B. zhangzhouensisKh690, eB. aeriusKh867 com uma
média de 4,4, 4,5 e 4,8 mm, respectivamente, mostrou os maiores efeitos de
inibição deR. solanacearumCélulas R32 em comparação com o controle com
uma média de 6 mm.
Correspondentemente, os VOCs produzidos porB. zhangzhouensisKh690,
B. aeriusKh867, eB. wiedmanniiAh945 inibiu a motilidade natatória deR.
solanacearumR32 a 14,5, 15,4 e 16,7 mm, respectivamente

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Tabela 3
Efeito de VOCs produzidos por bactérias endofíticas na motilidade de natação, enxame, espasmos, formação de biofilme e quimiotaxia deR. solanacearumR32 e análise de variância
(ANOVA) dos dados.

Média do Quadrado

Fonte de variação df Zona de enxame (mm) Zona de natação (mm) Zona de contração (mm) quimiotaxia biofilme
(107UFC/ml) (OD540nm)

Har267 4.4d 17.6b 5.8b 6.4b 0,66ab

Fer469 5.3b 17.3b 5.6b 5.8b 0,67ab
Kh690 4.5d 14.5d 4.4c 4.6b 0,48b
Kh867 4.8cd 15.4cd 5.5b 5.4b 0,73ab
Ah945 5.2bc 16.7bc 5.8b 1.3c 0,48b
Ctrl 6.0a 21.3a 6.6a 9.2a 1.04a
Tratamento 5 0,044** 0,73** 0,033** 9.574** 0,12**
Erro 12 0,005 0,079 0,004 6.971 0,024
valor F 7,93 9.20 7.22 13.73 5.23
CV (%) 14.66 16.42 12.02 13,99 15

* * Significativo ao nível de 1% de probabilidade; df = Graus de Liberdade; CV = coeficiente de variação; A significância entre as médias de tratamento é apresentada como as diferentes letras
minúsculas. Os dados são apresentados como a média de três réplicas.

Figura 5.Efeitos de VOCs produzidos porB. safensisHar267,B. pumilusFer469,B. zhangzhouensisKh690,B. aeriusKh867, eB. wiedmanniiAh945 na motilidade de enxame deR.
solanacearumR32 em comparação com o controle não exposto (Ctrl). O diâmetro da zona de motilidade (a) e a placa representativa do ensaio de motilidade de enxame (b) foram
mostrados. Três réplicas foram usadas para cada tratamento. As barras de erro indicam o SE das três réplicas (P = 0,05).

Figura 6.Efeitos de VOCs produzidos porB. safensisHar267,B. pumilusFer469,B. zhangzhouensisKh690,B. aeriusKh867, eB. wiedmanniiAh945 na motilidade natatória deR. solanacearum
R32 em comparação com o controle não exposto (Ctrl). O diâmetro da zona de motilidade (a) e a placa representativa do ensaio de motilidade natatória (b) foram mostrados. Três
réplicas foram usadas para cada tratamento. As barras de erro indicam o SE das três réplicas (P = 0,05).