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Pesquisa Microbiológica 181 (2015) 61–67

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Pesquisa Microbiológica
Página inicial do jornal :www. Els ev ier . com/ l oc ate / mi cres

Atividades deAureobasidium pullulansfiltrados celulares contraMonilinia

laxade pêssegos
Alessandra Di Francesco, Roberta Roberti, Camilla Martini, Elena Baraldi, Marta Mari∗
DipSA, Universidade de Bolonha, Bolonha, Itália

artigoinfo abstrato

Historia do artigo: OAureobasidium pullulansAs cepas L1 e L8 são conhecidas como eficientes agentes de biocontrole contra vários patógenos
Recebido em 17 de julho de 2015 fúngicos pós-colheita. Para entender melhor o mecanismo de ação por trás da atividade antifúngica das cepas L1 e L8, foram
Recebido em forma revisada em 31 de agosto de
avaliados filtrados de células de levedura cultivadas em diferentes tempos.na Vivo contraMonilinia laxaem pêssego. Os
2015 Aceito em 7 de setembro de 2015
diâmetros das lesões nos frutos de pêssego foram reduzidos pelos filtrados das culturas L1 e L8 em 42,5% e 67%,
Disponível online em 10 de setembro de 2015
respectivamente. A capacidade desses filtrados de inibirM. laxagerminação de conídios e alongamento do tubo germinativo
foi estudado porem vitroensaios. Os resultados mostraram uma redução de 70% na germinação de conídios para ambas as
Palavras-chave:
cepas, enquanto para o alongamento do tubo germinativo, foi de 52% e 41% para os filtrados de cultura L1 e L8,
Agentes de Controle Biológico
respectivamente. Finalmente, a atividade de enzimas hidrolíticas da parede celular como quitinase e glucanase em filtrados
Levedura
Enzimas hidrolíticas celulares foi analisada e a expressão de genes que codificam essas atividades foi quantificada durante o crescimento da
Patógeno fúngico levedura. A partir de 24 h, ambos os filtrados de cultura continham -,1-3,glucanase e. atividades de quitinase, a mais
Mecanismo de ação pronunciada das quais foiN---acetilglucosaminidase. O nível de expressão gênica que codifica essas enzimas em L1 e L8 variou
de acordo com a cepa. Estes resultados indicam que os filtrados de cultura das cepas L1 e L8 retêm a atividade antagonista da
levedura e sugerem que a produção de enzimas hidrolíticas desempenha um papel importante nesta atividade.

© 2015 Elsevier GmbH. Todos os direitos reservados.

1. Introdução de doenças pós-colheita, comoKloeckera apiculada (Long e outros, 2007

Monilinia laxa (Aderhold e Ruhland) Querida,Monilinia fructigena (
Aderhold e Ruhland) eMonilinia fructicola (Inverno e Mel) são três
importantes patógenos fúngicos de frutas de caroço (Byrde e Willetts, 1977).
Esses fungos infectam as partes aéreas das plantas hospedeiras com uma
variedade de sintomas, incluindo queima das flores, cancros nos tecidos
lenhosos e podridão dos frutos, embora as perdas predominantes dos frutos
ocorram na fase pós-colheita.Martini e Mari, 2014). A doença é controlada
por tratamentos químicos de campo, como triazóis, dicarboximidas e, mais
recentemente, fungicidas do tipo estrobilurina, a hidroanilida fenhexamida e
inibidores da succinato desidrogenase.Miessner e Stammler, 2010), embora
seu uso indiscriminado tenha causado problemas ambientais e o
surgimento de cepas resistentes a patógenos. Nesse contexto, os agentes
de controle biológico (BCAs) podem ser considerados uma alternativa segura
e ambientalmente correta para o manejo da podridão parda.Zhang e outros,
2010). Atualmente, as leveduras e microrganismos semelhantes a leveduras
merecem atenção especial como BCAs, pois podem exercer um controle
eficaz
∗Autor correspondente em: DipSA, University of Bologna, Via Gandolfi 19, 40057
Cadriano, Bologna, Itália. Fax: +39 51 765049.
Endereço de email:marta.mari@unibo.it (M. Mari).
),Meyerozyma caribbica (Bautista-Rosales et al., 2013),Pichia
membranifaciens, PichiaanomalaeDebaryomyces hansenii (Santos e
outros, 2004),Aureobasidium pullulans (Di Francesco e outros, 2015).
A. pullulans (De Bary) Arnaud, um fungo leveduriforme, é um dos
BCAs mais promissores; reside em diferentes ambientes, como a superfície
da fruta desde os primeiros estágios de desenvolvimento até a maturidade (
Janisiewicz e outros, 2010), ou em tecidos lenhosos e folhas (González e
Tello, 2011). Também pode sobreviver em diferentes condições: ambientes
secos e úmidos, atmosfera controlada e uma ampla gama de temperaturas (
Kohl e Fokkema, 1994). Trabalhos anteriores revelaram que a competição
por nutrientes (Bencheqroun et al., 2007), indução da defesa do hospedeiro (
Ippolito et al., 2000), antibiose, parasitismo e produção de enzimas líticas
(exoquitinase, endoquitinase e
- - 1,3-glucanase) (Zhang e outros, 2010) são os principais mecanismos
responsáveis pela eficácia da levedura. Resultados promissores também
foram obtidos comA. pullulansLinhagens L1 e L8, isoladas da superfície de
pêssegos 'Redhaven', ativas contra a podridão parda de frutos de caroço (
Mari et al., 2012a); no entanto, além da produção recentemente relatada de
compostos orgânicos voláteis (Di Francesco e outros, 2015), pouco se sabe
sobre os mecanismos de ação envolvidos no potencial de biocontrole desses
doisA. pullulansDeformação.
Com base nas considerações acima, o objetivo principal deste
estudo foi avaliar a atividade antifúngica deA. pullulansL1 e L8

http://dx.doi.org/10.1016/j.micres.2015.09.003 0944-5013/©
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62
Figura 1.Dinâmica populacional deAureobasidium pullulans (cepas L1 e L8) cultivadas em caldo de meio mínimo a 25◦C por 144h. Cada ponto representa a média do número de
unidades formadoras de colônias (CFUs) de três réplicas (frasco) + barras de erro, cada placa em triplicado em cada tempo de amostragem.
cultura filtrada contraM. laxa.Em particular, (i) a redução da severidade
da podridão parda em pêssegos infectados artificialmente; (ii) a inibição
deM. laxagerminação de conídios e alongamento do tubo germinativo,
(iii) a exibição de quitinolítico (N-acetil---glucosaminidase e
endoquitinase) e glucanolítica (--1,3-glucanase) e (iv) a expressão dos
genes que codificam essas enzimas foram investigadas.
2. Materiais e métodos
2.1. Antagonistas
Linhagens L1 e L8 utilizadas nos experimentos, isoladas de pêssegos e
identificadas conforme relatado porMari et ai. (2012a,b), foram cultivadas
em ágar nutriente de dextrose de levedura (NYDA, 8 gl−1de caldo nutritivo, 5
g−1de extrato de levedura, 10 g−1de dextrose, 25 gl−1ágar técnico, Oxoid,
Reino Unido) a 25◦C e armazenados em solução de glicerol (10%) a -80◦C até
o uso. A fim de obter um filtrado livre de células, ambos os antagonistas
foram cultivados em NYDB (NYDA sem ágar) a 25◦C em agitador rotativo (250
rpm) por 0 (1 h), 24, 48, 72 e 96 h. As culturas de cada tempo de incubação
foram centrifugadas a 5000×gpor 20 min a 4◦C e, os sobrenadantes foram
esterilizados com filtros de seringa Millex-GV 0,22 m (Millipore, Reino Unido),
concentrados e dessalinizados com Ultrafree®-4Unidade de filtro centrífugo
(Millipore Corporation, EUA). Os ultrafiltrados (filtrados celulares) foram
usados parana Vivoe ensaios enzimáticos e as células de levedura para
teste de expressão gênica.
2.2. patógeno
M. laxacepa foi isolada de pêssegos mostrando sintomas evidentes
tomos de podridão parda e identificados por sequenciamento de regiões ITS
de DNA ribossomal (Mari et al., 2012a). O patógeno foi cultivado e mantido
em ágar batata dextrose (PDA, 39 gl−1, Oxoid, Reino Unido) aos 25◦C para os
experimentos. Suspensão de esporos deM. laxafoi preparado a partir de
uma colônia de 7 dias por raspagem e suspensão de conídios em água
destilada estéril à qual foi adicionado Tween 80 a 0,05% (v/v) e ajustado para
uma concentração final de 105conídios ml−1com um hemocitômetro
2.3. Fruta
Pêssegos 'Redhaven' [Prunus persica (L.) Batsch] na maturidade
comercial foram fornecidas pelo pomar experimental da Faculdade de
Agricultura localizada em Cadriano (Bolonha, Itália); o pomar estava sob
manejo convencional, mas sem tratamentos fungicidas contraMoniliniaspp.
foram realizados. Os frutos da colheita foram armazenados a 0◦C e usado
para experimentos dentro de 5 dias da colheita. Para
inóculo, os frutos foram feridos por uma unha estéril (3×3×3 mm) no
equador (uma ferida por fruto) antes da inoculação do patógeno.
2.4. Teste de crescimento de levedura
A. pullulanscepas, de uma cultura de 2 dias de idade, foram cultivadas
em 50 ml de caldo de meio mínimo (MM) (30 g de sacarose, 2 g de NaNO3, 1
g KH2PO4, 0,5 g MgSO4x7H2O, 0,5 g KCl, 0,2 ml de solução mineral em 1000
ml de H destilado2o) aos 25◦C em agitador rotativo (250 rpm) por 6 dias. A
cada 24 horas, uma alíquota de suspensão de células (50 -l) foi diluída em
série. Cem l de cada diluição foram espalhados com uma espátula estéril na
superfície do NYDA em placas de Petri. As placas foram incubadas a 25◦C por
2 dias e as unidades formadoras de colônias (CFUs) foram registradas com
um hemocitômetro. A unidade amostral foi representada por três frascos
para cada cepa e o experimento foi repetido uma vez.
2.5.Em vitroatividade antifúngica
Os filtrados de células L1 e L8 foram obtidos como descrito acima. Os testes de
atividade antifúngica foram realizados da seguinte forma: em lâmina de
microscópio, alíquotas de 25 -l deM. laxa105CFUml−1foram adicionados às mesmas
alíquotas de filtrados de cultura estéril de levedura de 0, 24, 48, 72 e 96 h de
incubação. Os filtrados continham 2 -g -l−1de proteínas totais determinadas de
acordo com o método de Bradford (1976). As lâminas foram introduzidas em uma
placa de Petri estéril e a placa foi imediatamente selada com uma camada de
Parafilm para manter alta umidade. Após 6 h de incubação a 25◦C, a lâmina foi
observada através de um microscópio (Nikon Eclipse TE2000-E) e a germinação
dos conídios e o alongamento do tubo germinativo (30 conídios por campo
microscópico) de cada amostra foram determinados. A taxa de crescimento do
tubo germinativo foi avaliada a partir da inclinação da reta. O tempo de
germinação foi o tempo em que o comprimento do tubo germinativo se igualou
ao diâmetro dos conídios. O filtrado celular obtido a partir de 0 h de incubação foi
considerado como controle. Para cada tratamento, três lâminas de microscópio
(réplicas) foram observadas. O experimento foi repetido uma vez.
2.6.Na Vivoatividade antifúngica
Filtrados de células livres L1 e L8 deem vitroensaios também foram
utilizados parana Vivoensaios. Vinte litros de cada filtrado de células de
levedura derivados de 0, 24, 48, 72 e 96 h de incubação foram introduzidos
nas feridas dos frutos. Após secagem ao ar em temperatura ambiente, as
feridas foram inoculadas com 20 -l de suspensão de conídios do patógeno
(105conídios ml−1). Os frutos foram incubados a 20◦C por 7 dias. Feridas
tratadas com filtrado celular fresco obtido de 0 h de incu-
 A. Di Francesco et al. / Pesquisa microbiológica 181 (2015) 61–67 63

Mesa. 1
Genes e primers usados em RT-qPCR.

Gene ID do genea Primer direto e reverso

Cadeia beta de tubulina Aurpu2p4 003900 F:GTCGAGAACTCCGACGAGAC

R:CGGCAGAGACGAGGTAGTTC
Endoquitinase 2 Aurup2p4 002661 F:TTCATGCTGCTCCAAGTACG
R:TTGGAAGAGCTGGAGGAAGA
N-acetilglucosaminidase GH18 Aurpu2p4 008454 F:CAACTCTTTGCCTGGAGAGC
R:GGTCTCTCAACCCCTCTTCC
Glucana 1,3-beta Aurpu2p4 000459 F:AGCTGCAATGGCTGAAGTTT
glicosidase R:TTGAATGGCACTCGGATACA

A temperatura relativa é 58◦C para todos os genes.

aDe acordo comwww.genoma.fungalgenomics.com.

e inoculados com suspensão de conídios do patógeno foram considerados 2.8. Análise de expressão gênica
como controle. A unidade amostral foi representada por cinco frutos para
cada tempo de incubação e cada antagonista; O experimento foi realizado O RNA total deA. pullulansAs cepas L1 e L8 foram extraídas de
duas vezes. células de levedura cultivadas em meio NYDB a 25◦C em agitador
rotativo (250 rpm) por 0, 24, 48, 72 e 96 h de incubação. O RNA foi
extraído de três réplicas biológicas usando o Spectrum Plant Total RNA
Kit (Sigma). A extração foi realizada de acordo com o protocolo descrito
pelo fabricante do kit, e o tratamento com DNAse foi feito com o
2.7. Quantificação da atividade enzimática
TURBO DNA-freeMT
Kit (Life Technologies, EUA). A qualidade e a concentração do RNA foram
Culturas líquidas de BCAs, colhidas após 0, 24, 48, 72 e 96 h de
avaliadas espectrofotometricamente (260 nm) e por eletroforese em gel de
incubação, foram centrifugadas para remover células e sais com uma
agarose a 1%. Um g de RNA foi retrotranscrito com Transcriptase Reversa
Ultrafree-4Centrifugal Filter Unit (Millipore) a 5000×gpor 20 min a 4◦C. A
ImProm-IIMT(Promega, EUA) usando oligo(dT) como primers. Os primers
concentração de proteína no sobrenadante foi determinada pelo
utilizados neste estudo foram desenhados utilizando o software gratuito
método de ligação proteína-corante conforme descrito acima (
Primer 3 (Life Technologies). Os primers foram adquiridos da PRIMM
Bradford, 1976), utilizando albumina de soro bovino (Sigma, St. Louis,
BIOTECH (Milão, Itália). Cada primer foi previamente testado na reação de
EUA) como padrão. O sobrenadante foi recuperado para ensaios
PCR e os produtos amplificados foram sequenciados (MWG) para verificar a
enzimáticos deN-acetil---glucosaminidase (Nagase), endoquitinase e
especificidade. As sequências de primers e o número de acesso do gene
--1,3-glucanase. A atividade deN-as enzimas acetil---glucosaminidase e
correspondente usado neste estudo são relatados emtabela 1.
endoquitinase foram testadas seguindo um procedimento modificado
porTronsmo e Harman (1993). Os ensaios de Nagase e endoquitinase
A RT-qPCR foi realizada em placas de 96 poços em um termociclador
foram baseados na determinação colorimétrica dep-nitrofenil clivado
MX3000 (Stratagene, EUA) usando o kit do sistema de reação SYBR Green
dos substratos análogos de quitina, p-nitrofenil-N-acetil---d-
(Life Technologies). Cada reação continha 1X de Platinum Sybr-Green Master
glucosaminida ep-nitrofenil --- d-N,N′,N“-triacetilquitotriose,
mix (Invitrogen, Milão, Itália), 5 -M de cada primer, 3,25 -l de água livre de
respectivamente (Sigma, St. Louis, EUA). Cada substrato foi dissolvido
nuclease e 2,5 -l de diluição 1:10 de cDNA, em um volume total de 12,5 -l. As
em tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 6,7) para uma concentração
seguintes condições de ciclagem foram usadas: 95◦C por 10 min; 40 ciclos de
final de 0,3 -l ml−1na mistura de reação, e adicionado a 30 -l do filtrado
95◦C por 15 s, 58◦C por 30 s e 72◦C por 30 min; e uma extensão final em 95◦C
da cultura de levedura de cada amostra. Após incubação por 2 h em
por 1 min. A fluorescência foi monitorada no final de cada etapa de
banho-maria a 37◦C,a reação foi interrompida pela adição de 50 -l de
recozimento. Para avaliar a especificidade da amplificação, a análise da curva
0,2 MNa2CO3e a absorbância foi medida a 405 nm com um
de fusão foi sempre realizada ao final de cada experimento, monitorando a
espectrofotômetro (Infinite®F50 Tecan, Männedorf, CH). As atividades
fluorescência de 55◦C a 95◦C, a cada 0,1◦C. Os dados foram analisados
de Nagase e endoquitinase foram calculadas usando um coeficiente de
usando o Software MXPro QPCR versão 3.0 (Stratagene, EUA). A
absorção para op-nitrofenil de 18,5/mM/cm. Uma unidade (U) de
quantificação foi realizada usando o método da curva padrão relativa
atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que
(Applied Biosystems 1997) com base na determinação do ciclo limiar (Ct)
liberou 1 mol dep-nitrofenol por minuto por mg de proteína. Cada
para cada amplificação. Resumidamente, para cada gene alvo, uma curva
tratamento foi realizado em três réplicas e o ensaio foi repetido três
padrão foi gerada por diluição em série de uma primeira fita de cDNA
vezes.
escolhida aleatoriamente. Os valores de Ct de cada diluição foram plotados
contra o log dos valores de diluição. A quantidade alvo de cDNA em cada
- - A atividade da 1,3-Glucanase foi avaliada medindo a taxa
amostra experimental foi determinada pela interpolação de seu valor Ct na
de produção de açúcares redutores, empregando laminarina (Sigma)
curva padrão para encontrar o logaritmo de seu valor de quantidade
como substrato e seguindo uma versão modificada do procedimento
relativa. Este valor de quantidade foi então normalizado contra aquele do
de Kauffmann et ai. (1987). A mistura de reação consistia em 0,4 ml de
gene de manutenção da --tubulina calculado com o mesmo método. Para
tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 5,2) contendo 1 mg ml−1
cada amostra, três réplicas biológicas independentes foram feitas e cada
laminarina e 100 -l do filtrado da cultura de levedura. Após incubação
réplica foi executada três vezes.
por 2 horas a 37◦C, 0,3 ml de reagente de cobre alcalino foi adicionado
e a mistura foi aquecida a 100◦C por 20 min. Após o resfriamento, 0,2
ml de reagente cromogênico de Nelson foi adicionado e a absorbância
foi medida a 660 nm com um espectrofotômetro (Ashwell, 1957). 2.9. Análise estatística
Glicose, padrões enzimáticos e substratos em branco foram incluídos.
Uma unidade de atividade da --1,3-glucanase foi definida como a Todos os dados foram analisados por ANOVA one-way e o teste de
quantidade de enzima que libera 1 mg de glicose por minuto por mg de diferenças mínimas significativas (LSD) foi usado para separar as diferenças
proteína. Cada tratamento foi realizado em três réplicas e o ensaio foi entre as médias; significância estatística foi considerada como P <0,05.
repetido três vezes. Todas as análises foram realizadas com o software Statgraphics
64 A. Di Francesco et al. / Pesquisa Microbiológica 181

Mesa. 2
Níveis de expressão relativa deN-acetilglucosaminidase, EndoquitinaseeGlucano beta 1-3
glucosidasegenes emAureobasidium pullulans (L1 e L8). Os resultados são a média de
três réplicas±desvio padrão. Para cada antagonista, letras diferentes indicam uma
diferença significativa, de acordo com o teste LSD,P <0,05.

expressão relativa

N-acetilglucosaminidase GH18 Endoquitinase glucano 1-3 glicosidase

L1 0* 2,00 a* 1,05 a* 1,35 a*

L1 24 1.20b 0,40c 0,28 dias
L1 48 0,23 dias 0,50c 0,43c
L1 72 0,62c 0,40c 0,49 b
L1 96 0,65c 0,60b 0,52 b
L8 0* 1,50 a* 1.43 a* 1,00 a*
L8 24 0,79 b 0,62b 0,10 dias
L8 48 0,68c 0,44c 0,10 dias
L8 72 0,40 cd 0,47c 0,22c
L8 96 0,27 dias 0,46c 0,33 b
* Figura 3.Efeito deAureobasidium pullulans (L1 e L8) filtrados celulares no alongamento do tubo
Considerado não relevante.
germinativo deMonilinia laxaconídios. Os antagonistas foram cultivados em Caldo de Dextrose de
Levedura Nutritiva a 25◦C por 144h. Os dados são as médias de 30 comprimentos de tubos
(versão centurião 15.0). Os experimentos foram conduzidos em germinativos de conídios germinados observados para cada amostra. Para cada antagonista,
letras diferentes (minúsculas—L1; maiúsculas—L8) indicam diferenças significativas de acordo
delineamento de blocos inteiramente casualizados.
com o teste LSD,P <0,05.

3. Resultados
60
a
3.1. Teste de crescimento de levedura
L1 L8
b
A. pullulansAs cepas L1 e L8 mostraram tendências semelhantes de crescimento em 40 A c
AB c
Diâmetro da lesão (mm)

MMB em 25◦C (Figura 1). A população de ambas as cepas aumentou B

significativamente de 0 h até 96 h de incubação, com pico de 2×105
UFC. Depois disso, a população permaneceu constante até 120 h de C
C
incubação e então começou a diminuir para 1×1 05UFC para L1 e 9×104 20
para L8. Esses dados foram úteis para decidir os tempos de incubação
mais adequados para a avaliação da atividade enzimática das cepas L1
e L8.
0
0 24 48 72 96
3.2.Em vitroatividade antifúngica
Tempo de incubação dos filtrados (h)

Germinação de conídios deM. laxafoi reduzido significativamente pelos
filtrados de células L1 e L8 a partir de 24 h de incubação, em comparação com o
controle (Figura 2). A germinação de conídios foi marcadamente reduzida pelos
filtrados de células de 48, 72 e 96 h de ambas as cepas. Os filtrados de 48 h de
incubação causaram inibição de 70% e 67% para L1 e L8, respectivamente.
Nenhuma diferença significativa foi mostrada pelos filtrados celulares das cepas
L1 ou L8 de 48 h, 72 h e 96 h de incubação.
Figura 4.Efeito deAureobasidium pullulans (L1 e L8) filtrados de células no diâmetro da lesão
(mm) deMonilinia laxaem frutos de pêssego inoculados artificialmente. Feridas de frutas foram
primeiro tratadas com 20 -l de filtrados de células 22 derivados de cultura líquida de antagonistas
cultivados em Caldo de Dextrose com Levedura Nutritiva a 25◦C por 144 h; após secagem ao ar,
foram inoculados com 20 -l deM. laxasuspensão de conídios (105conídios ml−1). As frutas foram
mantidas a 20◦C por 7 dias. Os dados são as médias de cinco frutos para cada tempo de
incubação e cada antagonista. Para cada antagonista (minúsculo-L1; maiúsculo-L8), letras
diferentes indicam diferenças significativas de acordo com o teste LSD,P <0,05.

100
Em relação ao comprimento doM. laxatubo germinativo, os filtrados de
a A cultura das duas leveduras causaram reduções significativas a partir de 24
L1 L8
80 b horas (Fig. 3). A maior redução do tubo germinativo foi observada quando os
conídios foram tratados com o filtrado de 48 h de L1 e L8 (52% e 41%,
respectivamente, em relação ao controle).
60 B
% de germinação de conídios

C
C
40 c c c 3.3.Na Vivoatividade antifúngica
C

Os filtrados celulares, obtidos da cultura líquida deA. pullulans cepas L1 e

20
0 gravidade da doença, avaliada como diâmetros de lesão, foi
0 24 48
Tempo de incubação dos filtrados (h)
Figura 2.Efeito deAureobasidium pullulans (L1 e L8) filtrados celulares na germinação de conídios
deMonilinia laxa.Os antagonistas foram cultivados em Caldo de Dextrose de Levedura Nutritiva a
25◦C por 144h. Os dados são as médias de conídios germinados de 30 conídios observados para
cada amostra. Para cada antagonista, letras diferentes (minúsculas—L1; maiúsculas—L8) indicam
diferenças significativas de acordo com o teste LSD,P <0,05.
L8, foram aplicadas em frutos de pêssego inoculados artificialmente com
suspensão de conídios deM. laxa (Fig. 4). Após incubação por 7 dias a 20◦C, a
72 96 significativamente reduzida pelos filtrados de cultura das cepas L1 e L8 a
partir de 48 h. Uma redução igualmente alta foi obtida em frutas tratadas
com os filtrados de 72 h e 96 h de cada cepa; a doença foi reduzida pelo
filtrado de 96 h para níveis de 37,5% (L1) e 47,1% (L8) em comparação com o
controle. Em geral, a redução dos diâmetros das lesões obtida com o filtrado
de células da linhagem L8 foi maior do que a obtida com o filtrado de células
da linhagem L1.

Figura 5.N-atividades de acetil---glucosaminidase (a), endoquitinase (b) e-1,3-glucanase
(c) deAureobasidium pullulans (L1 e L8) filtrados de células detectados por ensaios de
espectrofotômetro. Cada ponto é a média de três réplicas±desvio padrão. Para cada
antagonista (minúsculo—L1; maiúsculo—L8), letras diferentes indicam uma diferença
significativa, de acordo com o teste LSD,P <0,05.
3.4. Quantificação de atividades enzimáticas em filtrados de cultura
L1 e L8
Fig. 5(a-c) mostraN-atividades enzimáticas de acetil---
glucosaminidase, endoquitinase e -,1-3,glucanase que variaram com o
arco 181 (2015) 61–67 65
tempos de amostragem. Ambos os filtrados de cultura de levedura
mostraram atividades de quitinase aumentadas a partir de 24 horas (Fig. 5a,
b). O mais alto N---a atividade da acetilglicosaminidase foi demonstrada pelo
filtrado L8 de 48 h (1,11 mUmg−1min−1); após este tempo de amostragem, a
atividade enzimática do filtrado da cultura de levedura diminuiu. A cepa L1
mostrou um pico deN-atividade acetil---glucosaminidase em 72 h (0,738
mUmg−1min−1). A atividade da endoquitinase aumentou gradualmente com
o tempo e atingiu valores máximos no filtrado da cultura L1 em 96 h de
amostragem (2,316 mUmg−1min−1), atingiu o pico no filtrado L8 em 48 h
(1,843 mUmg−1min−1) e, em seguida, diminuiu lentamente.
A maior atividade de -,1-3,glucanase foi exibida por filtrados de
cultura de 48 h para ambas as cepas; porém na linhagem L1 esta
atividade foi muito maior que na linhagem L8 (26.903 mUmg−1min−1vs
9,367 mUmg−1min−1, respectivamente). Após esse tempo, essa
atividade diminuiu até 96 h (Fig. 5c).
3.5. Análise de expressão gênica
Relativo expressão níveis de L1 e L8, N-̌ -
acetilglucosaminidase, endoquitinasee-1,3-glucanaseos genes foram
determinados por RT-qPCR. Nas linhagens L1 e L8, a expressão desses
genes diminuiu drasticamente de 1 h de incubação em meio NYDB para
24 h.
Em momentos posteriores, a expressão variou entre as cepas: em
L1, oN-̌ -acetilglucosaminidasegene diminuiu ainda mais de 24 h para
48 h, enquanto oendoquitinasee-1,3-glucanasegenes permaneceram
razoavelmente estáveis até 72 h. Todos esses genes na linhagem L1
aumentaram novamente em 96 h. Na linhagem L8, a expressão deN-̌ -
acetilglucosaminidaseeendoquitinasegenes permaneceram inalterados
de 24 h a 96 h, enquanto o ˇ-1,3-glucanasegene aumentou ligeiramente
novamente de 72 para 96 h (mesa 2).
4. Discussão
O presente trabalho mostrou que em MMB a 25◦C o crescimento de L1 e
L8 tem uma taxa exponencial até 96 h, aumentando 1,8 vezes; a população
de ambos os BCAs então declinou, de acordo com dados anteriores obtidos
emna Vivotentativas com os mesmos BCAs (Mari et al., 2012a). Um estudo
anterior sobre a dinâmica populacional das duas linhagens mostrou
diferentes taxas de desenvolvimento de acordo com a espécie frutífera; em
feridas de maçã, o tamanho da população aumentou para 7 vezes a
concentração inicial, enquanto em feridas de pêssego foi observado apenas
um crescimento fraco, embora suficiente para controlarMonilinia podridão (
Mari et al., 2012a,b).
Filtrados celulares deA. pullulansAs cepas L1 e L8 foram capazes de inibir
M. laxacrescimento conidial e reduzir lesões de patógenos em frutas. Eles
exercem sua atividade antifúngica afetando vários aspectos do
desenvolvimento fúngico, como a redução da taxa de germinação de
esporos, (Figura 2), a desaceleração do alongamento do tubo germinativo (
Fig. 3), a interrupção do crescimento polarizado do tubo germinativo e a
ramificação excessiva perto da ponta (dados não mostrados). Esses dados
estão de acordo com os resultados obtidos por outros pesquisadores com
Aspergillus nidulans (Endo et al., 1997).
Por outro lado, a atividade antifúngica dessas cepas de leveduras porem
vitroena Vivotestes mostraram diferenças notáveis em relação ao tempo ou
à tensão mais eficiente: oem vitro atividade inibitória contra a germinação
de conídios e alongamento do tubo germinativo foi melhor realizada pela
linhagem L1 mostrando o efeito mais forte em 48 h. Pelo contrário, a maior
capacidade de reduzir o diâmetro da lesão no fruto do pêssego foi
demonstrada pela estirpe L8 e a sua capacidade aumentou juntamente com
o tempo de cultivo filtrado, sendo mais elevada às 96 h, o último ponto de
tempo examinado. Esses dados indicam que a atividade antagônica dos
filtrados L1 e L8 é fortemente influenciada pelas condições ambientais, em
particular pelos componentes da fruta, tanto os metabólitos de superfície
quanto os compostos voláteis.
66 A. Di Francesco et al. / Pesquisa microbiológica 181 (2015) 61–67
que poderia desempenhar um papel importante na interação levedura: patógeno
fúngico, influenciando fortemente a atividade antagonista da levedura.
Entre os modos de ação dos BCAs, a produção de enzimas extracelulares
glucanase e quitinase tem sido considerada como tendo um papel
importante na ação antagonista de leveduras, como o relatado paraA.
pullulans (Castoria et al., 2001),Pichia membranafacineseMeyerozyma
(Candida) guilliermondii (Fan e outros, 2002) ouP. anômala (Jijakli e Lepoivre,
1998). Essas enzimas são capazes de atuar como despolimerases na parede
celular do patógeno fúngico, causando lise e morte celular.Castoria et al,
1997; Tseng et al., 2009). Em particular, as atividades de glucanase e
quitinases têm sido indicadas como elementos-chave para a atividade
antagonista contra patógenos.Jijakli e Lepoivre, 1998; Chan e Tian, 2006).
Em nosso estudo, medimos as atividades de endo-, exo-quitinases e --1,3-
glucanase, presentes em filtrados celulares deA. pullulanscepas L1 e L8.
Nossos dados mostram que essas enzimas podem desempenhar um papel
importante na determinação daem vitroatividade inibitória fúngica, embora
em extensão e tempo de produção diferentes para as duas cepas, conforme
já observado em ensaios anteriores (Mari et al., 2012a,b). De fato, enquanto
para ambas as cepas a atividade da --1,3-glucanase atingiu o pico em 48 h,
de acordo com resultados anteriores (Zhang e outros, 2010), na linhagem L8,
a endoquitinase eN---as atividades da acetilglucosaminidase mostraram um
pico em 48 h, e na linhagem L1 essas duas atividades enzimáticas
aumentaram gradualmente em atividade com o tempo de filtrados de
cultura. Isso indica claramente que às 48 h os filtrados de levedura
continham uma maior potência lítica, provavelmente logo abaixo do maior
em vitroefeito inibitório mostrado por esses filtrados de BCAs contra o
M. laxagerminação de conídios e alongamento do tubo germinativo naquele
momento. No entanto, estes dados reforçam a hipótese acima mencionada
de que outros componentes importantes da fruta condicionaram fortemente
ana Vivoatividade da levedura, possivelmente pela influência de algum
composto ainda desconhecido na atividade hidrolítica da levedura. Em apoio
a isso, foi relatado recentemente que os compostos voláteis (VOCs)
produzidos pela fruta durante o amadurecimento têm um forte efeito no
crescimento de importantes patógenos fúngicos pós-colheita.Neri et al.,
2014), podendo ter atividade inibitória ou estimulante dependendo do volátil
específico. No total, essas evidências apontam para um papel fundamental
dos componentes do hospedeiro da fruta na determinação do resultado de
uma infecção por patógenos. Os efeitos dos VOCs e metabólitos do pêssego
na atividade antagonista dos BCAs são principalmente desconhecidos e
futuras investigações devem ser dedicadas a abordar esse tópico, a fim de
entender melhor as intrincadas redes de moléculas que regulam as
interações antagonista-patógeno-fruta.
Além disso, sabe-se queA. pullulansproduz antibióticos mostrando uma
atividade fungicida contra uma variedade de fungos, incluindo Aspergillus
spp. (Takesako et al., 1993), levedura (Saccharomyces cerevisiae) (Endo et al.,
1997) e alguns fungos patogênicos humanos semelhantes a leveduras (
Zhong et al., 2000). Em particular, a aureobasidina A, um antibiótico
antifúngico depsipeptídeo cíclico, produzido porA. pullulansR106, provou ser
ativo contra alguns patógenos pós-colheita como Botrytis cinerea,
Penicillium digitatumeM. fructicola,embora este último tenha se mostrado
mais resistente que os demais a este antibiótico, apresentando uma redução
da germinação de conídios inferior a 30% a 16 -g ml−1de aureobasidina A (
Liu e outros, 2007). O envolvimento desses compostos tóxicos de leveduras
no controle de patógenos fúngicos, comoM. laxaainda não está totalmente
esclarecido, mas é provável que tais moléculas antifúngicas sejam
produzidas também por L1 e L8 como compostos extracelulares (Dake e
Beniwal, 2014) e, portanto, respondem parcialmente pela atividade inibitória
medida desses filtrados de cultura de levedura em frutas de pêssego.
Neste estudo, uma análise de expressão ao longo do tempo de
genes que codificam para endoquitinase,N---acetilglucosaminidase ou
enzimas líticas --1,3-glucanase foi realizada.
Além da diminuição fisiológica na expressão detectada para todos
esses genes em ambas as linhagens no início do cultivo NYDB, devido à
mudança repentina no substrato nutricional da levedura
que poderia levar a diferenças drásticas de expressão gênica (Leão et
al., 2015) e, portanto, não considerados biologicamente significativos,
os níveis de transcrição desses genes permaneceram razoavelmente
estáveis durante a maior parte do tempo de cultivo, até 72 h. Um
ligeiro aumento foi medido apenas no final da cultura, de 72 para 96
h. Portanto, a expressão de genes de enzimas líticas não se
correlacionou com sua atividade medida nos filtrados da cultura, que
atingiu o pico em 48 h ou aumentou gradualmente com o tempo. Há
duas razões possíveis para essa falta de correlação: (i) emA. pullulans,a
endoquitinase, N---as enzimas líticas acetilglucosaminidase ou --1,3-
glucanase são codificadas por grandes famílias multigênicas; de fato,
mais de 100 genes de hidrolase foram encontrados no genoma deA.
pullulans (Gostinčar et al., 2014); o número e a identidade das
isoformas proteicas codificadas que contribuem para as culturas
filtradas da atividade lítica de L1 e L8 são atualmente desconhecidos.
Embora para o experimento qPCR tenhamos usado primers projetados
em regiões conservadas dessas isoformas, não podemos excluir que
nossa análise falhou em detectar o sinal mais representativo; (ii)
enquanto a expressão dos genes-alvo é normalizada em um gene
housekeeping, tornando os dados quantitativos calibrados e
comparáveis entre as amostras examinadas, as medidas de atividade
não foram ajustadas em relação à massa de levedura que foi crescendo
com o tempo, como também mostrado por nossa análise da taxa de
crescimento. O aumento da atividade enzimática é, portanto, pelo
menos parcialmente devido ao aumento do número de células de
levedura nas culturas. Além disso,Lopes e outros, 2012). Esta poderia
ser a razão do menor nível de atividade enzimática lítica detectado em
nossos filtrados de cultura em relação aos relatados por outros autores
em estudos anteriores mencionados acima.
Em conclusão, nossos dados mostram que os filtrados de cultura das
cepas L1 e L8 deA. pullulanstinha propriedades antifúngicas contraM. laxa
patógeno fúngico que pode ser parcialmente explicado pela atividade
hidrolítica de enzimas secretadas. A identificação dos genes específicos
envolvidos na produção das atividades das enzimas L1 e L8 são necessárias
para melhor elucidar a regulação transcricional dessas enzimas durante o
crescimento e em resposta a estímulos externos.
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