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Tagousop et ai. BMC Medicina Complementar e Alternativa (2018) 18:252

https://doi.org/10.1186/s12906-018-2321-7

ARTIGO DE PESQUISA Acesso livre

Atividades antimicrobianas de
glicosídeos flavonoides de
Graptophyllum grandulosum e seu
mecanismo de ação antibacteriana
Cyrille Ngoufack Tagousop1 Jean-de-Dieu Tamokou2* , Steve Endeguele Ekom2, David Ngnokam1*
e Laurence Voutquenne-Nazabadioko3

Resumo
Introdução: A busca por novos antimicrobianos deve levar em consideração o fenômeno da resistência aos medicamentos. As
plantas medicinais são conhecidas como fontes de compostos antimicrobianos potentes, incluindo flavonoides. O objetivo desta
investigação foi avaliar as atividades antimicrobianas dos glicosídeos flavonoides de Graptophyllum grandulosum, bem como
determinar seu mecanismo de ação antibacteriana por meio de ensaios de lise, vazamento e estresse osmótico.
Métodos: Os extratos vegetais foram preparados por maceração em solventes orgânicos. A cromatografia em coluna do
extrato de n-butanol seguida da purificação de diferentes frações levou ao isolamento de cinco glicosídeos flavonoides. As
atividades antimicrobianas dos extratos/compostos foram avaliadas pelo método de microdiluição em caldo. A atividade
bacteriolítica foi avaliada pelo método cinético time-kill. O efeito dos extratos nas hemácias e na membrana celular bacteriana
foi determinado por métodos espectrofotométricos.
Resultados: Crisoeriol-7-O-ÿ-D-xilosídeo (1), luteolina-7-O-ÿ-D-apiofuranosil-(1 ÿ 2)-ÿ-D-xilopiranósido (2), crisoeriol 7-O-ÿ -D-
apiofuranosil-(1 ÿ 2)-ÿ-D-xilopiranósido (3), crisoeriol-7-O-ÿ-L-ramnopiranosil-(1 ÿ 6)-ÿ-D-(4"- hidrogenossulfato) glucopiranósido
(4) e isorhamnetin-3-O-ÿ-L-ramnopiranosil-(1 ÿ 6)-ÿ-D-glucopiranósido (5) foram isolados de G. grandulosum e apresentaram
diferentes graus de atividade antimicrobiana. As cepas de Vibrio cholerae resistentes a drogas foram, em alguns casos, iguais ou
superiores às da ciprofloxacina usada como antibiótico de referência.As atividades antibacterianas dos glicosídeos flavonóides e
do cloranfenicol aumentaram sob estresse osmótico (5% NaCl), enquanto a da vancomicina diminuiu sob esta condição.
Suspensão de V. cholerae tratada com glicosídeos flavonoides, apresentou um aumento significativo na densidade óptica em 260
nm, sugerindo que os ácidos nucléicos foram perdidos através de uma membrana citoplasmática danificada. A densidade óptica
da suspensão de V. cholerae NB2 tratada com os compostos isolados foi observada, indicando a lise das células bacterianas. As
amostras testadas foram atóxicas para células normais, destacando seu bom índice de seletividade.

Conclusões: Os resultados do presente estudo indicam que os flavonóides purificados de G. glandulosum possuem atividades
antimicrobianas. Seu modo de atividade antibacteriana é devido à lise celular e ruptura da membrana citoplasmática após a
permeabilidade da membrana.

Palavras-chave: Graptophyllum glandulosum, Acanthaceae, Glicosídeos flavonoides, Antibacteriano, Antifúngico, Modo de ação

* Correspondência: jtamokou@yahoo.fr; jean.tamokou@univ-dschang.org;

dngnokam@yahoo.fr; ngnokam@univ-dschang.org
2
Unidade de Pesquisa de Microbiologia e Substâncias Antimicrobianas, Departamento de
Bioquímica, Faculdade de Ciências, Universidade de Dschang, PO Box 67, Dschang,
Camarões 1
Unidade de Pesquisa de Química Ambiental e Aplicada, Departamento de Química,
Faculdade de Ciências, Universidade de Dschang, PO Box 67, Dschang, Camarões A
lista completa de informações do autor está disponível no final do artigo

© O(s) autor(es). 2018 Open Access Este artigo é distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution 4.0
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Antecedentes
O desenvolvimento de resistência por microrganismos a agentes
antimicrobianos existentes é conhecido há muito tempo. Em
vários achados, o surgimento de cepas multirresistentes de Vibrio
cholerae O1 e Shigella flexneri foi relatado devido a diferentes
fatores genéticos, incluindo transferência de plasmídeos, integrons
e variação alélica em genes específicos [1]. Nos países em
desenvolvimento, as fluoroquinolonas, amplamente utilizadas
para o tratamento de muitas doenças bacterianas, incluindo
cólera e shigelose, podem contribuir para o surgimento de
multirresistência entre potenciais patógenos entéricos. Embora
tenham sido feitos progressos significativos na pesquisa
microbiológica e no controle de muitas doenças causadas por
microrganismos infecciosos, epidemias recorrentes devido a
microrganismos resistentes a drogas, bem como o aparecimento
de novas cepas microbianas patogênicas, exigem a descoberta
de novos antibióticos. A necessidade de compostos
ecologicamente seguros como agentes terapêuticos contra
microrganismos resistentes a drogas tem impulsionado muitos
estudos em plantas medicinais. A literatura mostra milhares de
espécies de plantas que foram testadas in vitro contra muitas
cepas de fungos e bactérias, e um bom número de extratos de
plantas medicinais e compostos puros provaram ser ativos contra
fungos, bactérias Gram-positivas e Gram-negativas [ 2–5]. As
plantas medicinais contêm quantidades terapêuticas de
metabólitos secundários, incluindo flavonoides. Estes são
compostos polifenólicos e C6-C3-C6 em que os dois grupos C6
são anéis benzeno substituídos, e o C3 é uma cadeia alifática
que contém um anel pirano [6]. Eles ocorrem como O- ou C-
glicosídeos ou no estado livre como agliconas com grupos
hidroxila ou metoxila [7]. A porção de açúcar é um fator importante
que determina sua biodisponibilidade. Os flavonoides podem ser
divididos em sete tipos: flavonas, flavonoides, flavononas,
flavanes, isoflavonas, biflavonas e chalconas [8]. Os flavonóides
são bem documentados por seus efeitos farmacológicos, incluindo
atividades antimicrobianas, anticancerígenas, antivirais,
antimutagênicas e antiinflamatórias . As propriedades biológicas
dos flavonóides estão ligadas à sua capacidade de atuar como
fortes antioxidantes e sequestradores de radicais livres, para
quelar metais e interagir com enzimas, receptores de adenosina
e biomembranas [7].
Graptophyllum glandulosum Turrill (Acanthaceae) é um arbusto
com ramos quase glabros de 4 ângulos, folhas verdes normais e
flores vermelho-púrpura de 2,5 cm ou mais de comprimento. É
um dos vários arbustos e árvores de Graptophyllum que crescem
principalmente na África Ocidental e Central, mas também nas
regiões do Pacífico [12]. Esta planta contém alguns metabólitos
secundários importantes, como polifenóis, flavonoides e
glicosídeos [13]. Folhas, raízes e outras partes de G. glandulosum
são usadas na medicina popular em Camarões para tratar feridas,
abscessos, doenças de pele, infecções do trato respiratório e
diarréia. A importância médica desta planta nos atraiu para
explorar suas propriedades antimicrobianas.
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Embora vários relatos etnobotânicos enfatizem a importância
farmacológica dessa espécie para condições que parecem estar
associadas a infecções microbianas, há uma literatura muito
limitada preocupada com a identificação dos compostos
antimicrobianos dessa planta. No entanto, alguns relatórios sobre
a atividade antimicrobiana in vitro de plantas foram publicados
[14, 15]. O objetivo desta investigação foi avaliar as atividades
antimicrobianas dos glicosídeos flavonoides de G. grandulosum,
bem como determinar seu mecanismo de ação por meio de
ensaios de lise, vazamento e estresse osmótico.
Métodos
Procedimentos experimentais
gerais Ponto de fusão Um aparelho
Schorpp Gerätetechnik (Alemanha) foi usado para obter os
pontos de fusão de diferentes compostos.
Análise de
RMN Os espectros 1D (1 H e 13C-NMR) e 2D (COSY, NOESY,
HSQC e HMBC) foram realizados em solventes deuterados
(CD3OD) no espectrômetro Bruker Avance III 600 a 600 MHz/150
MHz. Todos os deslocamentos químicos (ÿ) são dados em
unidades ppm com referência ao tetrametilsilano (TMS) como
padrão interno e as constantes de acoplamento (J) estão em Hz.
Análise espectrométrica
Os espectros de massa (HR-TOFESIMS) foram realizados no
microinstrumento Micromass Q-TOF (Manchester, Reino Unido).
As amostras foram introduzidas por infusão direta em uma
solução de MeOH a uma taxa de 5 ÿL/min.
Métodos cromatográficos
Sílica gel 60 Merck, 70-230 mesh e sephadex LH-20 foram
usados para realizar cromatografia em coluna, enquanto placas
pré revestidas de sílica gel 60 F254 (Merck) foram usadas para
realizar cromatografia em camada fina. As manchas foram
visualizadas por uma lâmpada UV multibanda UV-254/365 nm
(ModelUVGL-58 Upland CA 91786, EUA) seguida de pulverização
com 50% de H2SO4 e aquecimento a 100 °C por 5 min.
Material vegetal
As partes aéreas de G. grandulosum foram colhidas em uma
pequena aldeia chamada Foto situada na Divisão de Menoua,
região oeste dos Camarões) em novembro de 2015. A planta foi
identificada e autenticada por um botânico camaronês (Sr. Fulbert
Tadjouteu) no Herbário Nacional onde foi arquivado um espécime
comprovativo (No 65631/HNC).
Extração e isolamento A
extração e isolamento dos compostos foram feitos conforme
descrito anteriormente [13]. Resumidamente, a parte aérea de G.
grandulosum foi seca ao ar e pulverizada. O pó foi macerado à
temperatura ambiente com MeOH para
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fornecer o extrato de MeOH. Parte deste extrato (235 g)
foi suspenso em água (300 mL) e particionado
sucessivamente com EtOAc e n-BuOH para produzir 37 e
13 g de extratos, respectivamente. A cromatografia em
coluna do extrato n-BuOH seguida da purificação de
diferentes frações levou ao isolamento de cinco compostos.
Identificação estrutural dos compostos isolados
As estruturas dos compostos isolados foram determinadas
após a interpretação de seus dados físicos, espectrométricos H-1''), 3,68 (1H, dd, J = 9,0 e 7,1, H-2''), 3,63 (1H, m, H-3''),
e espectroscópicos resumidos nesta subseção.
Chrysoeriol-7-O-ÿ-D-xilosídeo (1): pó amorfo amarelo;
fórmula molecular C21H20O10; 13C NMR (CD3OD, 150
MHz) ÿC: 165,3 (C-2), 104,3 (C-3), 184,1 (C-4), 161,7
(C-5), 99,6 (C-6), 163,1 (C-7 ), 95,8 (C-8), 158,5 (C-9),
107,0 (C-10), 123,1 (C-1'), 110,5 (C-2'), 148,2 (C-3'), 151,0
(C -4'), 116,7 (C-5'), 121,9 (C-6'), 55,2 (C-7') para aglicona;
100,9 (C-1''), 74,4 (C-2''), 77,3 1 (C-3''), 70,7 (C-4''), 66,9
(C-5'') para a porção de açúcar.
Dados H NMR (CD3OD, 600 MHz) ÿH: 6,62 (1H, s, H-3),
6,38 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-6), 6,71 (1H, d, J = 2,1 Hz, H
-8), 7,44 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-2'), 6,84 (1H, d, J = 8,4 Hz,
H-5'), 7,47 (1H, dd, J = 8,4 e 2,1 Hz , H-6'), 3,87 (3H, s,
H-7') para aglicona; 4,95 (1H, d, J = 7,1 Hz, H-1''), 3,37
(1H, m, H-2''), 3,36 (1H, m, H-3''), 3,49 (1H, m, H-4''), 3,38
(1H, m, H-5''a), 3,87 (1H, m, H-5'' b) para a fração de
açúcar.
Luteolina-7-O-ÿ-D-apiofuranosil-(1 ÿ 2)-ÿ-D-xilopira
noside (2): pó amarelo; fórmula molecular C25H26O14. pf
= 203°C. Dados de 13C NMR (CD3OD, 150 MHz) ÿC:
165,3 (C-2), 103,5 (C-3), 182,5 (C-4), 162,9 (C-5), 99,7
(C-6), 163,1 (C- 7), 94,9 (C-8), 157,4 (C-9), 105,5 (C-10),
121,7 (C-1'), 114,2 (C-2'), 146,4 (C-3'), 150,5 ( C-4'), 116,6
(C-5'), 119,7 (C-6') para cone agly; 99,0 (C-1''), 76,0 (C-2''), (1H, m, H-6'' a), 3,68 (1H, m, H-6ÿÿ b), 4,75 (1H, d, J = 1,3
77,0 (C-3''), 70,0 (C-4''), 66,1 (C-5''), 109,3 (C-1 ''), 76,5
(C-2'''), 79,7 (C-3'''' ' ), 64,5 (C-4'''), 74,4 (C-5''') para a dd, J = 9,5 e 3,4 Hz, H-3'''), 3,32 (1H, t, J = 9,5 Hz, H-4''),
fração açúcar.
Dados H NMR (CD3OD, 600 MHz) ÿH: 6,75 (1H, s, H-3),
6,40 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-6), 6,75 (1H, d, J = 2,1 Hz, H
-8), 7,44 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-2'), 6,90 (1H, d, J = 8,4 Hz,
H-5'), 7,47 (1H, dd, J = 8,4 e 2,1 Hz , H-6') para aglicona;
5,18 (1H, d, J = 7,1 Hz, H-1''), 3,52 (1H, dd, J = 9,0 e 7,1
Hz, H-2''), 3,43 (1H, m, H-3'') , 3,41 (1H, m, H-4ÿÿ), 3,78
(1H, dd, J = 9,7 e 3,4 Hz, H-5ÿÿa), 3,42 (1H, dd, J = 9,7 e
3,4 Hz, H- 5''b), 5,34 (1H, d, J = 1,3 Hz, H-1'''), 3,75 (1H,
m, H-2'''), 3,30 (2H, d, J = 3,4 Hz, H-4'''), 3,88 (1H, d, J =
9,3 Hz, H-5'''a), 3,65 (1H, d, J = 9,3 Hz, H-5'''b) para a
fração de açúcar .
Crisoeriol-7-O-ÿ-D-apiofuranosil-(1 ÿ 2)-ÿ-D-
xilopiranósido (3): pó amarelo; fórmula molecular
C26H28O4; ponto de fusão = 181,8 °C. 13C NMR (CD3OD,
150 MHz) ÿC: 166,6 (C-2), 104,5 (C-3), 184,0 (C-4), 162,9
(C-5), 100,9 (C-6), 164,4 (C-7 ), 95,9 (C-8), 158,9 (C-9),
107,0 (C-10), 123,4 (C-1'), 110,4 (C-2'), 149,5
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(C-3'), 152,3 (C-4'), 116,7 (C-5'), 121,9 (C-6'), 56,6 (C-7')
para aglicona; 100,6 (C-1''), 78,6 (C-2''), 77,9 (C-3''), 70,9
(C-4''), 66,9 (C-5''), 110,0 (C-1 ''), 78,1 (C-2'''), 80,7 (C-3'''),
65,8 (C-4'''), 75,4 (C-5''') para dados H NMR (CD3OD , 600
1
MHz) ÿH: porção de açúcar.
6,70 (1H, s, H-3), 6,45 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-6), 6,77 (1H,
d, J = 2,1 Hz, H-8), 7,52 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-2'), 6,95 (1H,
d, J = 8,4 Hz, H-5'), 7,56 (1H, dd, J = 8,4 e 2,1 Hz, H-6'),
3,98 (3H, s, H-7') para aglicona; 5,16 (1H, d, J = 7,1 Hz,
3,62 (1H, m, H-4''), 3,98 (1H, m, H-5'' a), 3,48 (1H, t, J =
9,6, H-5''b), 5,46 (1H, d , J = 1,7 Hz, H-1ÿÿÿ), 3,98 (1H, m,
H-2ÿÿÿ), 3,56 (2H, brs, H-4ÿÿÿ), 4,05 (1H, d, J = 9,4,
H-5'''a), 3,84 (1H, d, J = 9,4, H-5''' b) para a fração de
açúcar.
Crisoeriol-7-O-ÿ-L-ramnopiranosil-(1 ÿ 6)-ÿ-D-(4ÿ ÿ-
hidrogenossulfato) glicopiranósido (4): pó amorfo amarelo;
fórmula molecular C28H31NaO18S. Dados de 13C NMR
(CD3OD, 150 MHz) ÿC: 166,8 (C-2), 104,5 (C-3), 184,1
(C-4), 163,1 (C-5), 101,1 (C-6), 164,0 (C- 7), 96,2 (C-8),
159,0 (C-9), 107,2 (C-10), 123,6 (C-1'), 110,8 (C-2'), 149,6
(C-3'), 152,3 ( C-4'), 116,9 (C-5'), 122,0 (C-6'), 56,7 (C-7')
para aglicona; 100,9 (C-1''), 74,5 (C-2''), 76,8 (C-3''), 77,5
(C-4''), 75,3 (C-5''), 67,1 (C-6 »), 102.4 (C-1''), 71.9 (C-2''),
72.3 (C-3''), 74.2 (C-4''), 1 69.8 (C-5 See More “”), 17.9
(C-6””)
para a fração açúcar. Dados
H NMR (CD3OD, 600 MHz) ÿH: 6,73 (1H, s, H-3), 6,56
(1H, d, J = 2,1 Hz, H-6), 6,84 (1H, d, J = 2,1 Hz, H -8), 7,55
(1H, d, J = 2,1 Hz, H-2'), 6,98 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5'),
7,59 (1H, dd, J = 8,4 e 2,1 Hz , H-6'), 3,99 (3H, s, H-7')
para aglicona; 5,15 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-1''), 3,61 (1H, dd,
J = 9,1 e 7,8 Hz, H-2''), 3,84 (1H, t, J = 9,1 Hz, H -3''), 4,32
(1H, dd, J = 9,9 e 9,1 Hz, H-4''), 3,89 (1H, m, H-5''), 4,10
Hz, H-1ÿÿÿ), 3,95 (1H, dd, J = 3,4 e 1,3, H- 2'''), 3,72 (1H,
3,62 (1H, m, H-5'''), 1,21 (3H, d, J = 6,2 Hz, H-6''') para a
fração de açúcar.
Isorhamnetin-3-O-ÿ-L-ramnopiranosil-(1 ÿ 6)-ÿ-
D-glucopiranósido (5): pó amorfo amarelo; fórmula
molecular C28H32O15. Dados de 13C NMR (CD3OD, 150
MHz) ÿC: 159,8 (C-2), 135,7 (C-3), 179,8 (C-4), 162,4
(C-5), 104,3 (C-6), 160,1 (C- 7), 100,2 (C-8), 157,5 (C-9),
108,6 (C-10), 123,0 (C-1'), 114,5 (C-2'), 148,4 (C-3'), 151,1
( C-4'), 116,2 (C-5'), 124,4 (C-6'), 56,7 (C-7') para aglicona;
104,0 (C-1''), 75,9 (C-2''), 78,1 (C-3''), 71,8 (C-4''), 77,4
(C-5''), 68,7 (C-6 “), 102.6 (C-1””), 72.1 (C-2”), 72.3 (C-3”),
73.8 (C-4”), 69.8 (C-5”) “), 18,0 (C-6””) para a fração açúcar.
1dados H NMR
(CD3OD, 600 MHz) ÿH: 6,71 (1H, d, J = 2,2 Hz, H-6), 7,09
(1H, d, J = 2,2 Hz, H-8), 7,91 (1H, d, J = 2,2 Hz , H-2'),
6,95 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5'), 7,72 (1H, dd, J = 8,5 e 2,2
Hz, H-6'), 3,98 (3H, s, H -7') para aglicona; 5,30 (1H, d, J
= 7,6 Hz, H-1''), 3,49 (1H, dd, J = 9,1 e
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7,6 Hz, H-2''), 3,45 (1H, t, J = 9,1 Hz, H-3''), 3,23 (1H, t, J = 9,1
Hz, H-4''), 4,40 (1H, m, H-5''), 3,84 (1H, dd, J = 12,1 e 1,9 Hz,
H-6''a), 3,42 (1H, m, H-6''b), 4,53 (1H, d, J = 1,3 Hz, H-1'''), 3,58
(1H, dd, J = 3,4 e 1,3, H-2'''), 3,47 (1H, dd, J = 9,5 e 3,4 Hz, H-3'
“), 3,25 (1H, t, J = 9,5 Hz, H-4””), 3,41 (1H, m, H-5”), 1,10 (3H, d,
J = 6,2 Hz, H- 6''') para a porção de açúcar.
Ensaio antimicrobiano
Microrganismos Os
microrganismos utilizados neste estudo consistiam em cinco
cepas bacterianas, ou seja, Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Vibrio cholerae NB2, PC2, SG24 (1) e CO6 [16].
Também foram incluídos dois fungos Candida albicans ATCC
9002 e Cryptococcus neoformans IP95026. Essas bactérias e
leveduras foram obtidas de nossos estoques locais.
Determinação da concentração inibitória mínima e da
concentração microbicida mínima Os valores da concentração
inibitória mínima (CIM) foram determinados usando o método de
microdiluição em caldo conforme descrito anteriormente [17]. Os
valores de MIC foram definidos como a concentração de amostra
mais baixa que impediu a mudança de cor, indicando uma inibição
completa do crescimento microbiano. As concentrações mais
baixas que não produziram crescimento após a subcultura foram
tomadas como valores de concentração microbicida mínima
(MMC) [18].
Ciprofloxacina (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) e anfotericina
B (Merck, Darmstadt, Alemanha) foram usadas como controles
positivos para bactérias e leveduras, respectivamente.
Estudo do modo de ação
Alterações de MIC e MBC sob condição de estresse
osmótico O estresse osmótico foi induzido pela adição de 5% de
NaCl (p/v) ao MHB. O MHB suplementado com 5% de NaCl foi
então esterilizado e utilizado para a determinação de novos significativas quando p < 0,05. Todas as análises foram realizadas
valores de MIC e MBC das amostras conforme descrito no software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS,
anteriormente [17]. O tempo de incubação foi aumentado de 24 para 48 horas12.0).
versão
Efeito de compostos isolados na membrana celular
A alteração da membrana celular de V. cholerae NB2 foi avaliada
medindo as densidades ópticas a 260 nm das suspensões
bacterianas na presença e ausência dos compostos 1–5 usando
o método descrito por Carson et al. [19]. Para tanto, os compostos
foram testados em suas MIC utilizando 1 mL da suspensão
bacteriana (aproximadamente 108 UFC/mL). A mistura foi então
incubada a 37 ° C em diferentes intervalos de tempo (0:
imediatamente após a adição do composto; 15; 30; 60 min), 50 ÿL
da mistura foram retirados e misturados com 1,95 mL de solução
salina tamponada com fosfato ( Tampão PBS). A absorbância foi
medida no espectrofotômetro a 260 nm contra o branco (PBS).
Para o controle negativo, 1 mL de suspensão bacteriana foi
incubado a 37 °C e 50 ÿL do
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a suspensão foi removida no final dos vários tempos de
incubação e misturada com 1,95 mL de Tampão. As densidades
ópticas foram lidas da mesma maneira.
Ensaio bacteriolítico
As atividades bacteriolíticas dos compostos isolados foram
determinadas usando o método cinético time-kill conforme descrito
anteriormente [20] com pequenas modificações. O crescimento
total de V. cholerae NB2 em MHB foi diluído 100 vezes e incubado
a 37 °C para produzir um OD600 de 0,8 como inóculo inicial.
Soluções de amostra foram adicionadas à suspensão bacteriana
inicial para dar uma concentração final de 2 × MIC e incubadas a
37 °C com agitação, então 100 ÿL foram removidos de cada tubo
em 0, 15, 30, 60 e 120 min e o óptico densidade medida a 600
nm. Vancomicina e tetraciclina foram usadas como controles
positivos e os tubos sem compostos isolados serviram como
controles negativos.
Ensaio hemolítico
Sangue total (10 mL) de ratos albinos foi coletado por punção
cardíaca em tubos de EDTA. O estudo foi conduzido de acordo
com as diretrizes éticas do Comitê de Controle e Supervisão de
Experimentos em Animais (Registro nº 173/CPCSEA, datado de
28 de janeiro de 2000), Governo da Índia, sobre o uso de animais
para pesquisa científica . Os eritrócitos foram colhidos por
centrifugação à temperatura ambiente durante 10 min a 1000 xg
e foram lavados três vezes em tampão PBS [21]. A citotoxicidade
foi avaliada conforme descrito anteriormente [21].
Análise estatística
Os dados foram analisados por análise de variância de uma via
seguida pelo teste post hoc de Waller-Duncan. Os resultados
experimentais foram expressos como média ± desvio padrão
(DP). As diferenças entre os grupos foram consideradas
a 37°C.
Resultados Análise
química As estruturas de cinco glicosídeos flavonóides conhecidos
isolados da fração n-BuOH das folhas de G. grandulosum (Fig. 1)
foram determinadas usando análise espectroscópica e espectros
de RMN em conjunto com experimentos 2D (COSY, NOESY,
HSQC e HMBC) . A comparação direta com informações
publicadas levou à identificação de crisoeriol-7-O-ÿ-D-xilosídeo 1
[22], luteolina-7-O-ÿ-Da piofuranosil-(1 ÿ 2)-ÿ-D-xilopiranósido 2
[ 23], crisoe riol-7-O-ÿ-D-apiofuranosil-(1 ÿ 2)-ÿ-D-xilopiranósido 3
[13], crisoeriol-7-O-ÿ-L-ramnopiranosil-(1 ÿ 6)- ÿ-D-(4''-
hidrogenosulfato) glucopiranósido 4 [13] e isorhamnetin-3-O-ÿ-L-
ramnopiranosil-(1 ÿ 6)-ÿ-D-glu copiranósido 5 [24].
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7'
7'
OCH3 OU
3' OH 3' OH
2' 2'
4'' 4' 4'
5'' O 5'' O
HO 8 HO 4'' 8
O O O O
HO 9 5' HO 9 5'
2'' 1' 2'' 1'
3'' OH 1''
7 2 6' 3'' 1'' 7 2 6'
O
O
6 10 3 6 3
10
5 4 5''' 1''' 5 4
4''' OH
OH O OH O
3''' 2'''
1 OH OH 2R=H
3 R = CH3
6''' OH

5 ''' 4'''
7'
OH OCH3
O
3'''
3' OH
2'
1''' 4'
2''' OH 7'
OCH3 8
O
O 9 5'
3' 1'
6'' OH 7 2 6'
O
2' 1'' HO 3''
4'' 4' 3
2''
5'' O 6
O 8 10 OH
S HO
O
9 O 5' 5 4 O
OH
1' O 5''
N / DO 2'' 7
3'' OH 1'' 2 6' OH O 4''
O 6''
6 10 3 O
5 4 HO 2'''
1'''
OH O 5
3''' O
4 HO
4''' 5'''

OH

Fig. 1 Estruturas químicas dos flavonoides (1–5) isolados do extrato n-BuOH das partes aéreas de G. grandulosum Turill. 1:crisoeriol-7-O-ÿ-D-xilósido; 2:luteolina-7-O-
ÿ-D-apiofuranosil-(1 ÿ 2)-ÿ-D-xilopiranósido; 3: crisoeriol-7-O-ÿ-D-apiofuranosil-(1 ÿ 2)-ÿ-D-xilopiranósido; 4: crisoeriol-7-O-ÿ L-ramnopiranosil-(1 ÿ 6)-ÿ-D-(4"-
hidrogenossulfato) glucopiranósido; 5: isorhamnetin-3-O-ÿ-L-ramnopiranosil-(1 ÿ 6) -ÿ-D-glucopiranósido

Atividade antimicrobiana o menor valor de MIC de 4 ÿg/mL foi registrado em C. neofor

As atividades in vitro dos extratos de MeOH, n-BuOH e mans com o composto 4 e em S. aureus com os compostos
EtOAc, bem como seus compostos isolados contra bactérias 1, 2 e 4, enquanto o menor valor de MMC foi obtido em S.
e fungos patogênicos são apresentados na Tabela 1. As aureus com o composto 4. No entanto, o maior MIC valor
amostras de teste demonstraram vários graus de atividades para compostos (64 ÿg/mL) foi registrado com composto 3
inibitórias contra as cepas bacterianas e fúngicas . As cepas contra V. cholerae CO6, e com compostos 2 e 5 contra C.
fúngicas foram geralmente mais suscetíveis aos efeitos dos albicans, enquanto o maior valor de MBC de 128 ÿg/mL foi
compostos, mas menos suscetíveis aos extratos. Os extratos obtido em V. cholerae CO6 com composto 3 e em C. albicans
EtOAc e n-BuOH foram ativos contra C. albicans e C. com composto 5.
neoformans que não foram susceptíveis ao extrato MeOH.
Os valores de MIC obtidos com os extratos EtOAc e n-BuOH Atividade antibacteriana de glicosídeos flavonoides
foram menores do que os obtidos com o extrato MeOH. sob condição de estresse osmótico Os valores de
Essas observações sugerem que o fracionamento do extrato MIC de glicosídeos flavonoides contra bactérias Gram-
MeOH aumentou sua atividade antimicrobiana. Os menores negativas e Gram-positivas são relatados na Tabela 2. Os
valores de CIM foram registrados em S. aureus; sugerindo resultados mostraram claramente que os valores de MIC de
que este microrganismo foi o mais suscetível a todas as glicosídeos flavonoides obtidos sob estresse osmótico (na
amostras de teste. O extrato EtOAc apresentou a maior presença de 5% NaCl) são menores que os obtidos em
atividade antimicrobiana quando comparado com os extratos condições normais (0% NaCl). Este resultado sugere um
MeOH e n-BuOH. aumento na atividade dos glicosídeos flavonoides purificados
As atividades antimicrobianas dos compostos isolados de sob estresse osmótico. Conforme demonstrado em condições
G. glandulosum foram as seguintes: composto 4 > composto normais, o composto 4 ainda foi o mais eficaz sob estresse
1 > composto 2 > composto 5 > composto 3. osmótico, seguido em ordem decrescente pelos compostos

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Tabela 1 Atividades antimicrobianas de extratos, compostos isolados e medicamentos antimicrobianos de referência

Extratos/Compostos Parâmetros V. cholerae V. cholerae V. cholerae V. cholerae S. aureus C. albicans C. neoformans

de inibição SG24 (1) CO6 NB2 PC2 ATCC 25923 ATCC 9002 IP95026

extrato MeOH microfone 512 512 256 512 256 > 2048 > 2048

MMC 512 512 512 1024 512 / /

MMC/MIC 11222/ /
extrato de n-BuOH microfone 256 256 128 128 128 2048 2048

MMC 256 256 128 256 128 > 2048 > 2048

MMC/MIC 11121 / /
extrato de EtOAc microfone 64 128 64 64 64 1024 512

MMC 128 128 64 64 64 1024 1024

MMC/MIC 21111 1 2

1 MIC 168 8 8 4 32 8

MMC 16 8 16 8 8 64 8

MMC/MIC 11212 2 1

2 microfone 16 16 8 8 4 64 16

MMC 32 16 16 8 8 64 32

MMC/MIC 21212 1 2

3 microfone 32 64 32 32 8 32 16

MMC 64 128 32 64 16 32 16

MMC/MIC 22122 1 1

4 MIC8 8 8 8 4 8 4

MMC 168 8 8 4 8 8

MMC/MIC 21111 1 2

5 microfone 32 16 16 16 8 64 32

MMC 32 16 16 16 8 128 64

MMC/MIC 11111 2 2

Refa microfone 32 4 16 16 0,5 0,5 0,25

MBC 32 4 16 16 0,5 0,5 0,25

MBC/MIC 11111 1 1
uma

/: não determinado; Concentração Inibitória Mínima MIC, Concentração Microbicida Mínima MMC; o MIC e MMC foram medidos em ÿg/mL; anfotericina :
B para leveduras e ciprofloxacina para bactérias

1 e 2. Os valores de MIC do cloranfenicol determinados sob
condição de estresse osmótico foram menores do que aqueles
determinados sob condições normais. No entanto, todos os
valores de MIC da vancomicina determinados sob estresse
osmótico foram superiores aos determinados em condições
normais. A Tabela 1 mostra ainda que sob estresse osmótico,
as atividades antibacterianas dos compostos 1, 2 e 4 contra
V. chorae SG24 (1), V. chorae CO6, V. chorae NB2 e V.
chorae PC2 foram maiores do que a vancomicina.
Efeito dos glicosídeos flavonóides na membrana
celular O efeito dos glicosídeos flavonóides de G. glandulosum
foi avaliado em termos de vazamento de material absorvedor
de UV 260 através da membrana celular bacteriana (Fig. 2).
Após o tratamento com glicosídeos flavonóides nos valores
MIC dos compostos 1, 2 e 4, os valores OD260 dos filtrados
de todas as cepas de teste aumentaram e a maior parte do vazamento
ocorreu durante o período inicial (ÿ 15 min), seguido de um
ligeiro aumento com o período de incubação prolongado.
Ao mesmo tempo, o OD260 do controle sem composto não foi
alterado. Esses resultados sugerem que glicosídeos flavonoides
de G. glandulosum danificam a membrana citoplasmática e
causam perda de componentes intracelulares. Os valores mais
altos de OD260 foram registrados com o composto 4 para
todas as cepas de V. cholerae, enquanto os menores valores
de OD260 foram observados com o composto 2, indicando
que o composto 4 liberou as maiores quantidades de ácidos
nucleicos seguidos em ordem decrescente pelo composto 1,
depois 2 .
Efeito bacteriolítico dos compostos 1, 2 e 4 O
resultado no vazamento de material absorvente de 260 nm foi
consistente com o da bacteriólise (Fig. 3). Este resultado
mostrou uma diminuição na densidade óptica de

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Tabela 2 Atividades antibacterianas em termos de MIC (ÿg/mL) dos compostos 1, 3 e 4 sob condição de estresse osmótico contra cepas bacterianas
Bactérias Composto 1 Composto 2 Composto 4 cloranfenicol Vancomicina
0% NaCl 5% NaCl 0% NaCl 5% NaCl 0% NaCl 5% NaCl 0% NaCl 5% NaCl 0% NaCl 5% NaCl

V. chorae SG24 (1) 16 8 16 16 8 4 4 1 16 64

V. cholerae CO6 8 4 16 4 8 2 16 2 16 32

V. cholerae NB2 8 4 8 2 8 2 64 1 32 64

V. cholerae PC2 8 4 8 2 8 2 16 1 32 64

S. aureus 4 2 4 2 4 1 32 0,5 0,5 1

suspensão tratada com os compostos 1, 2 e 4. Após 120 min, da espécie microbiana teste, o resultado pode ser considerado
os compostos 1, 2 e 4 induziram um declínio na turbidez promissor para o desenvolvimento de novos antimicrobianos.
celular de 93,20, 94,36 e 95,16%, respectivamente na As atividades antimicrobianas dos flavonoides purificados
suspensão de bactérias em relação ao tempo 0, indicando a corroboraram com as dos primeiros relatórios contra bactérias
lise das células bacterianas . e fungos [5, 11, 26-28]. A atividade antibacteriana das
amostras contra V. cholerae e S. flexneri é particularmente
Atividade hemolítica digna de nota, uma vez que essas cepas eram isolados
As atividades hemolíticas dos extratos e compostos 1–5 clínicos MDR resistentes a drogas comumente usadas, como
contra glóbulos vermelhos (RBCs) foram investigadas usando ampicilina, estreptomicina, ácido nalidíxico, furazol e
Tri ton X-100 como controle positivo. O controle positivo cotrimoxazol [16, 29, 30].
apresentou cerca de 100% de lise, enquanto o tampão fosfato Pontos de corte antimicrobianos foram definidos na
salino (PBS) não apresentou lise de hemácias. Curiosamente, literatura para permitir a compreensão da eficácia de
nenhuma das amostras testadas apresentou atividades compostos puros como segue: altamente ativo: MIC abaixo de
hemolíticas contra hemácias em concentrações de até 256 e 1 ÿg/mL (ou 2,5 ÿM), significativamente ativo: 1 ÿ MIC ÿ10 ÿg/
2.048 ÿg/mL para compostos isolados e extratos, mL ( ou 2,5 ÿ MIC < 25 ÿM), moderadamente ativo: 10 < MIC
respectivamente (resultados não mostrados). Este achado ÿ100 ÿg/mL (ou 25 < MIC ÿ250 ÿM), fracamente ativo: 100 <
destaca o fato de que a eficácia biológica observada não foi devidaMIC ÿ1000 ÿg/mL (ou 250 < MIC ÿ2500 ÿM e não ativo: CIM >
à hemólise.
1000 ÿg/mL (ou > 2500 ÿM) [25] Com base nisso, as atividades
Discussão antimicrobianas de todos os glicosídeos flavonoides testados
A atividade antimicrobiana de um extrato vegetal é considerada podem ser consideradas significativas ou moderadas contra
altamente ativa se a MIC < 100 ÿg/mL; significativamente ativo os microrganismos específicos.
quando 100 ÿ MIC ÿ512 ÿg/mL; moderadamente ativo quando As atividades antimicrobianas dos compostos isolados de
512 < MIC ÿ2048 ÿg/mL; fracamente ativo se MIC > 2048 ÿg/ G. glandulosum foram nesta ordem: composto 4 > composto
mL e não ativo quando MIC > 10.000 ÿg/mL [25]. Assim, o 1 > composto 2 > composto 5 > composto 3. Muito pouco se
extrato AcOEt de G. glandulosum foi altamente ativo (CIM < sabe sobre as relações estrutura-função de antimicrobianos
100 ÿg/mL) contra V. cholerae SG24 (1),V. cholerae NB2,V. naturais, mas parece que diferentes grupos substituintes
cholerae PC2 e S. aureus; significativamente ativo (100 ÿ MIC dentro dos compostos tiveram uma grande influência em suas
ÿ512 ÿg/mL) contra V. cholerae CO6 e C. neoformans; propriedades biofísicas e biológicas [31]. Características
moderadamente ativo (512 < MIC ÿ2048 ÿg/mL) em C. estruturais, como a presença de um anel aromático, a porção
albicans. Os extratos MeOH e n-BuOH foram significativamente de açúcar ou o número de grupos hidroxila e metoxila, podem
ativos contra as espécies bacterianas teste; fracamente e alterar significativamente a permeabilidade da membrana e a
moderadamente ativos contra as células de levedura, afinidade subsequente para os locais de ligação externos e
respectivamente. internos nas bactérias, influenciando assim as propriedades
Neste estudo, também investigamos se o modo de ação antimicrobianas do composto . 32].
dos compostos flavonoides é bactericida ou bacteriostático. As atividades antibacterianas dos glicosídeos flavonoides e
Os resultados dos valores de MMC foram quatro vezes do cloranfenicol aumentaram sob estresse osmótico (5%
menores que seus valores de MIC correspondentes. Esta NaCl), enquanto a da vancomicina diminuiu sob essa condição.
observação sugere que as ações dos extratos de G. Os resultados foram apoiados pela observação de que certas
cepas [11].
glandulosum e seus glicosídeos flavonóides isolados foram bactericidas bacterianas (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) podem
As atividades antibacterianas dos glicosídeos flavonóides sobreviver sob condições de estresse osmótico [33]. Em baixa
foram, em alguns casos, iguais ou superiores às da atividade de água, a composição lipídica da membrana celular
ciprofloxacina usada como antibiótico de referência, sugerindo bacteriana foi alterada [34]. Este incidente pode levar à
que eles podem ser antibióticos eficazes contra essas ocorrência de mais locais de ligação antibacteriana na
bactérias patogênicas. Tendo em conta a importância médica da membrana celular das bactérias e causar menos resistência a

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Fig. 2 Aparência de material absorvente de 260 nm nos filtrados de V. cholerae SG24 (1), PC2, NB2 e CO6 após tratamento com os compostos 1, 2 e 4. As barras
representam a média ± desvio padrão da OD triplicada em cada tempo de incubação. No mesmo tempo de incubação, as letras ad indicam diferenças significativas
entre amostras de acordo com ANOVA de uma via e teste de Waller Duncan; p < 0,05

Fig. 3 Efeito bacteriolítico dos compostos 1, 2 e 4 contra V. cholerae NB2. Os resultados representam a média ± desvio padrão da OD triplicada em cada tempo de
incubação

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substância antibacteriana. Portanto, a presença do sal
desencadeou mudanças na composição lipídica da membrana.
Isso é possível para aumentar a atividade antibacteriana dos
glicosídeos flavonoides e do cloranfenicol.
No entanto, os mecanismos que tornam as bactérias mais
sensíveis a certos antibióticos em condições de estresse
osmótico ainda são desconhecidos. Os resultados da
atividade da vancomicina estão de acordo com os de
McMahon e colaboradores [35] que demonstraram uma
diminuição na atividade da amicacina, ceftriaxona e
trimetoprima contra E. coli e S. aureus sob condições de estresseRessonância
O vazamento marcado de material citoplasmático é
considerado indicativo de danos graves e irreversíveis à
membrana citoplasmática. Muitos compostos antibacterianos
que atuam na membrana citoplasmática bacteriana induzem
a perda de materiais absorventes de 260 nm (ácidos
nucleicos), incluindo clorohexidina, hexaclorofeno, álcool
fenetílico, tetraciclina, polimixina, ÿ-pineno e óleo de capim-
limão [19]. A suspensão de V. cholerae tratada com
glicosídeos flavonóides apresentou um aumento significativo
na densidade óptica em 260 nm, sugerindo que os ácidos
nucléicos foram perdidos através de uma membrana citoplasmática
Nossas observações confirmam que a atividade
antimicrobiana dos glicosídeos flavonóides resulta de sua
capacidade de romper a barreira de permeabilidade das
estruturas da membrana microbiana. Este modo de ação é
semelhante ao de outros desinfetantes e conservantes ativos
de membrana de amplo espectro, como derivados de fenol,
clorohexidina e derivados do ácido parabenzóico [36]. Além
disso, Devi e Kapila [37], relataram o mecanismo antibacteriano
como ruptura da membrana plasmática pelos fitoquímicos
nos extratos de hepáticas indianas.
O fato de que os danos induzidos pelos flavonoides na
estrutura da membrana celular acompanhados pelo declínio
na absorvância da suspensão de células bacterianas tratadas
com compostos o confirmou como a causa mais provável de
morte celular. Nosso resultado é apoiado pela observação de
que outros compostos flavonoides, como galato de
epigalocatequina e galangina, induziram redução de 3 log ou
mais em contagens viáveis de S. aureus [38, 39].
Conclusões
Os resultados do presente estudo indicam que os glicosídeos
flavonóides purificados de G. glandulosum possuem atividades
antimicrobianas. Seu modo de atividade antibacteriana é
devido à lise celular e rompimento da membrana citoplasmática
por ação sobre a permeabilidade da membrana, levando ao
vazamento de componentes celulares e, eventualmente, à
morte celular. Isso levará a melhorar as formulações
antimicrobianas e garantir a prevenção do surgimento de
resistência microbiana. No entanto, permanece a possibilidade
de que existam outros locais de ação além da membrana
citoplasmática. Mais trabalho é necessário para explicar
completamente os mecanismos envolvidos.
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Abreviaturas
1
H RMN: Próton
13C-NMR: Ressonância Magnética Nuclear do Carbono Treze;
2
Ressonância magnética nuclear; D NMR: Magnético Nuclear Bidimensional
Ressonância; ATCC: American Type Culture Collection; CC: coluna
Cromatografia; COSY: Espectroscopia de Correlação; DMSO: Dimetilsulfóxido;
EtOAc: Acetato de etilo; HMBC: Conectividades de ligações múltiplas heteronucleares;
HNC: Herbier National du Cameroun; HR-EI-MS: Elétron de alta resolução
Espectrometria de Massa de Impacto; HR-TOFESIMS: Tempo de voo de alta resolução
Espectrometria de Massa por Ionização por Electrospray; HSQC: O Único Heteronuclear
Coerência Quântica; IR: Infravermelho; MBC: Concentração bactericida mínima;
MDR: Resistente a Múltiplos Medicamentos; MeOH: Metanol; MHA: ágar Mueller Hinton;
MHB: caldo Mueller Hinton; MIC: Concentração inibitória mínima;
MMC: Concentração Microbicida Mínima; NA: Agar nutriente; n-BuOH: n-Butanol; RMN:
osmótico. Magnética Nuclear; Rf: Fator de retenção; TLC: fino
Cromatografia em Camadas; TMS: Tetrametilsilano; TOF-ESIMS: Tempo de Voo
Espectrometria de Massa por Ionização por Electrospray; UV: Ultravioleta
Disponibilidade de dados e materiais Os
conjuntos de dados usados e/ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis com o
autor correspondente mediante solicitação razoável.
Contribuição dos autores CNT
e SEE contribuíram na coleta e análise dos dados. JDT designou o estudo, fez os ensaios
biológicos e ajudou na redação e edição do manuscrito. JDT, DN e LVN supervisionaram e
revisaram o manuscrito criticamente para importante conteúdo intelectual. Todos os autores leram
e concordaram com a versão final do manuscrito.
danificada.
Aprovação ética e consentimento para participar Não
aplicável.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Interesses conflitantes Os
autores declaram não ter interesses conflitantes.
Nota do editor A Springer
Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas
publicados e afiliações institucionais.
Detalhes do autor 1
Unidade de Pesquisa de Química Ambiental e Aplicada, Departamento de Química, Faculdade
de Ciências, Universidade de Dschang, PO Box 67, Dschang, Camarões.
2
Unidade de Pesquisa de Microbiologia e Substâncias Antimicrobianas, Departamento
de Bioquímica, Faculdade de Ciências, Universidade de Dschang, PO Box 67, Dschang,
3 Camarões.
Groupe Isolement et Structure, Institut de Chimie Moléculaire de Reims
(ICMR), CNRS UMR 7312, Bat. 18 BP.1039, 51687 Reims cedex 2, França.
Recebido: 9 de maio de 2018 Aceito: 6 de setembro de 2018
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