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Biomateriais 279 (2021) 121214

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biomateriais
página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/biomaterials

Microgéis injetáveis carregados de células: estado atual e perspectivas futuras para a

regeneração da cartilagem
b
a,1 Thuy PT , Fanyi Li a,1 Surakshya Shrestha a, Rocky S. Sr. , Helmut Thissen c ,
Nguyen John S. Forsythe a,d,f,**, Jessica E. Frith a,d,e,f,*
a
Departamento de Ciência e Engenharia de Materiais, Instituto Monash de Engenharia Médica, Universidade Monash, Clayton, VIC, 3800, Austrália
b
Instituto de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Universidade Chinesa de Hong Kong, Shatin, Hong Kong SAR, China
c
CSIRO Manufacturing, Bayview Avenue, Clayton, VIC, 3168, Austrália
d
Monash Institute of Medical Engineering, Monash University, Clayton, VIC, 3800, Austrália
e
Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, Clayton, VIC, 3800, Austrália
f
Centro de Treinamento ARC para Tecnologias de Engenharia de Células e Tecidos, Clayton, VIC 3800, Austrália

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: Os hidrogéis injetáveis têm sido amplamente empregados como materiais versáteis para a regeneração da cartilagem devido à sua
Microgéis excelente biocompatibilidade, estrutura ajustável e capacidade de acomodar fatores bioativos, bem como sua capacidade de ser
biomateriais
administrado localmente por meio de injeção minimamente invasiva para preencher defeitos irregulares. Mais recentemente, estudos
engenharia de tecidos
in vitro e in vivo revelaram que o processamento desses materiais para produzir microgéis carregados de células pode melhorar as
Terapia minimamente invasiva
interações célula-célula e célula-matriz e aumentar a troca de nutrientes e metabólitos. Além disso, esses estudos demonstraram
reparação de cartilagem
perfis de expressão gênica e regeneração de matriz superiores em comparação aos hidrogéis injetáveis convencionais. Como os
microgéis carregados de células e sua aplicação no reparo da cartilagem estão se aproximando da tradução clínica, esta revisão visa
apresentar uma visão geral dos desenvolvimentos recentes neste campo. Aqui nos concentramos nos biomateriais e estratégias de
crosslinking atualmente usados, nas técnicas de fabricação inovadoras usadas para a produção de microgéis, nas fontes de células
usadas, nos sinais usados para indução da diferenciação condrogênica e nas respostas biológicas resultantes, e na capacidade de
criar três -dimensionais, tecidos de cartilagem funcionais. Além disso, esta revisão também abrange as abordagens clínicas atuais
para reparar a cartilagem, bem como os desafios específicos enfrentados ao tentar a regeneração do tecido da cartilagem danificado.
Novas descobertas relacionadas à natureza macroporosa das estruturas formadas pelos blocos de construção de microgéis montados
e o novo uso de microgéis em impressão 3D para engenharia de tecidos de cartilagem também são destacadas. Finalmente,
descrevemos os desafios e oportunidades futuras para o emprego de microgéis carregados de células em aplicações clínicas.

1. Introdução
A cartilagem articular é um tecido viscoelástico resistente caracterizado por uma
estrutura lisa e avascular e ausência de nervos [1]. O tecido cobre as extremidades dos
ossos mantendo um movimento flexível das articulações, inibindo a dor articular e a
inflamação sob carga durante nossa vida diária [1,2]. No entanto, devido ao
envelhecimento, lesões e outras condições, a cartilagem articular pode degenerar,
levando a dor e incapacidade graves [3,4]. A osteoartrite (OA) é a doença crônica mais
comum das articulações, caracterizada pela degeneração
cartilagem que pode levar a dor nas articulações, rigidez e mobilidade reduzida [5].
A auto-regeneração da cartilagem danificada é confundida pela migração celular limitada
dentro do tecido e pela falta de vasculatura e sistema nervoso [6].
Tratamentos conservadores, como analgésicos, suplementos condroprotetores e
fisioterapia, são as abordagens mais comuns para pacientes com lesões da cartilagem
articular em estágio muito inicial [7]. No entanto, estes podem apenas aliviar
temporariamente a dor e não reverter ou parar a degeneração contínua do local do
defeito [7-9]. Tratamentos cirúrgicos, como lavagem artroscópica, desbridamento, shaving
[10,11],

* Autor correspondente. Departamento de Ciência e Engenharia de Materiais, Instituto Monash de Engenharia Médica, Universidade Monash, Clayton, VIC, 3800, Austrália.

** Autor correspondente. Instituto Monash de Engenharia Médica, Universidade Monash, Clayton, VIC, 3800, Austrália.
Endereços de e-mail: john.forsythe@monash.edu (JS Forsythe), jessica.frith@monash.edu (JE Frith).
1
Thuy Nguyen e Fanyi Li contribuíram igualmente para este manuscrito.

https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121214 Recebido
em 30 de junho de 2021; Recebido no formulário revisado em 19 de setembro de 2021; Aceito em 20 de outubro de
2021 Disponível online em 21 de outubro
de 2021 0142-9612/Crown Copyright © 2021 Publicado por Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.
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TPT Nguyen et al.
microfratura [12], mosaicoplastia [13] e implantação autóloga de condrócitos [14]
fornecem meios alternativos para reparar lesões de cartilagem, mas a disponibilidade
do local doador, variabilidade, morbidade, operação invasiva e a qualidade inferior do
tecido regenerado limitam seu sucesso curativo a longo prazo efeito [12,15-19].
Pacientes em estágio terminal de degeneração da cartilagem geralmente recebem
tratamentos altamente invasivos, por exemplo, substituição total da articulação que
melhora significativamente a qualidade de vida dos pacientes [20]. No entanto, isso
ainda não fornece uma substituição de tecido totalmente funcional, e a vida útil
limitada da prótese não é uma escolha ideal para pacientes mais jovens [21].
A engenharia de tecidos reúne biomateriais, células e fatores bioquímicos/físicos
para criar tecidos artificiais e é considerada uma estratégia promissora para
desenvolver terapias alternativas para a regeneração da cartilagem articular [22-26].
Entre uma variedade de materiais utilizados, as matrizes de hidrogel são amplamente
utilizadas na engenharia de tecidos de cartilagem devido à sua alta hidratação e
biocompatibilidade [25,27–29]. Juntamente com o desenvolvimento de novos
biomateriais, a descoberta de novas fontes de células condrogênicas e a exploração
de diferentes vias físicas/biológicas condroindutoras têm atribuído significativamente
grande atenção aos hidrogéis carregados de células [30-32]. Além disso, com
avanços recentes em materiais e estratégias de reticulação, vários hidrogéis injetáveis
foram desenvolvidos para permitir a entrega via injeção a um local alvo in vivo com
invasão mínima para engenharia de tecidos [24,29,33]. No entanto, ficou claro que
hidrogéis a granel geralmente não podem fornecer interações célula-célula adequadas
e troca eficiente de nutrientes, oxigênio e resíduos, o que dificulta sua utilização em
estudos clínicos [34].
Novas estratégias que escalam hidrogéis a granel convencionais até a microescala
atraíram interesse recente [35,36]. As geometrias únicas em microescala fornecem
uma alta proporção de área de superfície para volume que permite a transferência
eficiente de nutrientes e resíduos [37,38]. O transporte ativo de nutrientes leva a
atividades celulares mais dinâmicas com interações célula-célula e célula-material
aprimoradas [39,40]. Para fabricar os microgéis, vários métodos tradicionais, como
extrusão, eletrospray e polimerização em emulsão, foram usados anteriormente,
embora normalmente produzam microesferas com alta polidispersão, baixo
rendimento, baixa reprodutibilidade e biocompatibilidade inferior [37, 41-43 ] . Mais
recentemente, os avanços em fotolitografia, micromoldagem e particularmente
técnicas microfluídicas geraram microgéis uniformes, permitindo o encapsulamento
de células com alto rendimento [44]. Além disso, esses microgéis carregados de
células injetáveis mantêm as vantagens dos hidrogéis a granel, mas também aliviam
muitas de suas limitações.
Até o momento, a microencapsulação celular tem sido cada vez mais estudada
in vitro e in vivo com potencial promissor para tradução e aplicações clínicas
[35,37,45]. No entanto, o sucesso futuro em desenvolvê-los e traduzi-los para a
prática clínica exigirá que o campo tenha uma visão clara dos fatores que sustentam
o sucesso até agora, bem como as limitações e potenciais desafios futuros na
aplicação desta tecnologia promissora na regeneração da cartilagem. Aqui,
fornecemos uma visão abrangente e sistemática das técnicas de fabricação,
biomateriais e fontes celulares para a geração de sistemas de microgéis, tanto em
estudos in vitro quanto in vivo , com foco particular no reparo da cartilagem.
Além disso, discutimos as vantagens e o potencial dos microgéis carregados de
células injetáveis em relação aos hidrogéis a granel tradicionais adaptados para
aplicações clínicas. Também enfatizamos os desafios que devem ser considerados
para o aumento de escala e fabricação de microgéis carregados de células injetáveis
para que eles alcancem todo o seu potencial no reparo da cartilagem.
1.1. Biologia da cartilagem articular humana
A cartilagem articular humana é o tecido conjuntivo do tipo hialino das articulações
com diartrose que cobre e cobre as extremidades dos ossos articulados [1].
Suas propriedades lisas e viscoelásticas permitem que a cartilagem articular atue
como um lubrificante para apoiar o movimento articular flexível, absorver o choque e
resistir às cargas mecânicas cíclicas aplicadas durante as atividades diárias [1,2].
Os condrócitos são as únicas células residentes dentro da cartilagem articular
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e constituem aproximadamente 2% do volume total do tecido. Eles são esparsamente
distribuídos em cavidades, conhecidas como lacunas, dentro da matriz extracelular
da cartilagem (MEC) [2,46]. A cartilagem articular humana é estratificada em quatro
zonas, conhecidas como zona superficial, zona média, zona profunda e zona
calcificada, de acordo com diferenças na morfologia articular dos condrócitos,
distribuição e orientação das fibras de colágeno/proteoglicanos ( Fig. 1A) [46,47].
Do ponto de vista microestrutural, a cartilagem articular é composta principalmente
por colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) e proteoglicanos (PGs), com uma pequena
parte composta por proteínas não colágenas e glicoproteínas [48] . Estes são
construídos em um ECM altamente denso que suporta toda a estrutura da cartilagem
(Fig. 1B). O colágeno é a biomacromolécula predominante presente na cartilagem
articular e representa aproximadamente 60-90% do peso seco do tecido cartilaginoso
[48]. Deste colágeno, o colágeno tipo II é a principal isoforma, representando cerca
de 90% do colágeno no tecido [49]. Existem também outros tipos de colágeno (tipos
I, IV, V, VI, IX e XI) presentes como componentes menores para auxiliar na formação
da rede de fibrilas do colágeno tipo II. As fibras de colágeno tipo II também são
emaranhadas com proteoglicanos para formar grandes feixes de fibrilas estáveis que
fornecem as propriedades de cisalhamento e tração do tecido cartilaginoso [2]. Os
proteoglicanos foram identificados como a segunda biomacromolécula mais abundante
na cartilagem articular . Aggrecan, o proteoglicano de cartilagem mais abundante, é
um agregado macromolecular, consistindo de uma proteína central decorada com
GAGs altamente sulfatados (sulfato de condroitina, sulfato de queratano e sulfato de
dermatano), que se liga ao ácido hialurônico (HA) via proteínas de ligação para
formar o altamente negativo cartilagem carregada agregando proteoglicano [51].
Decorina, biglicana e fibromodulina são proteoglicanos não agregantes, que também
possuem as cadeias laterais de condroitina, queratana e sulfato de dermatana
entrelaçadas com as fibras de colágeno. Geralmente, esses proteoglicanos atraem
um grande número de moléculas de água com densidade de carga fixa e alta pressão
osmótica preenchendo os espaços entre a rede de fibrilas, permitindo assim que a
cartilagem articular suporte altas cargas compressivas [2,46] . Além dos componentes
sólidos da MEC, a água representa cerca de 80% do peso úmido total do tecido
cartilaginoso. Aproximadamente 30% desta água é apresentada como o estado de
gel penetrado dentro dos feixes de fibrilas de colágeno tipo II/proteoglicano [2,8].
Eletrólitos (Na+, Ca2+, Clÿ K+) são dissolvidos na água para manter a
eletroneutralidade da ECM. Quando forças externas são aplicadas ao tecido da
,
cartilagem, o colágeno na ECM transduz as pistas mecânicas em sinais elétricos,
fornecendo as propriedades piezoelétricas da cartilagem nativa [52]. No geral, a água
dentro do ECM é um importante contribuinte para o transporte de nutrientes,
lubrificação e suporte de carga [2].
1.2. Doença e degeneração da cartilagem articular
A falta de vasos sanguíneos, sistema linfático e nervos são amplamente aceitos
como os fatores dominantes que resultam em cartilagem articular com uma
capacidade limitada de autorregeneração [6]. O envelhecimento e o trauma são as
principais causas de lesões na cartilagem articular [3,4]. A degradação proteolítica e
mediada pela metaloproteinase da matriz, combinada com o efeito cumulativo da
carga mecânica, causa a desintegração da matriz da cartilagem e pode evoluir
progressivamente para a osteoartrite (OA) [ 5,53,54].
No estágio inicial da OA, os condrócitos tornam-se altamente ativos metabolicamente,
exibindo taxas de proliferação aumentadas, dividindo-se para formar aglomerados de
células e mostrando aumento da deposição de matriz de cartilagem. Essas atividades
celulares anormais levam a um desequilíbrio entre os processos catabólicos e
anabólicos, seguido de ruptura da matriz cartilaginosa, com dissociação ou perda de
colágeno tipo II e agrecano, adelgaçamento da matriz cartilaginosa, espessamento
dos ossos subcondrais e apresentação de osteófitos (esporões ósseos) [55-57].
Consequentemente, a matriz da cartilagem torna-se menos hidratada, enfraquecendo
assim a capacidade de lubrificação e resistência compressiva da cartilagem articular.
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1.3. Tratamentos atuais para reparação da cartilagem articular e suas limitações
1.3.1. Tratamentos não regenerativos
Analgésicos e anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) são comumente usados
para aliviar a dor de pacientes com degeneração da cartilagem articular. Além disso,
estimulação elétrica nervosa transcutânea, exercício físico, redução de peso ou
ingestão de suplementos condroprotetores (glucosamina e sulfato de condroitina)
são recomendados como abordagens conservadoras para aliviar os sintomas do
paciente [8,9]. No entanto, esses tratamentos são considerados não modificadores
da doença e podem contribuir apenas temporariamente para a redução da dor ou
para retardar a progressão do problema, sem a capacidade de regenerar o tecido.
Lavagem artroscópica, desbridamento e raspagem são as estratégias cirúrgicas
básicas para reduzir a dor e melhorar o movimento articular [10,11]. Detritos de
defeitos de cartilagem, enzimas e sinóvia inflamada são removidos através da
lavagem articular [58]. Especula-se que esses conteúdos sejam os fatores que
induzem a sinovite causando dor nas articulações. O desbridamento e raspagem da
cartilagem normalmente envolve a remoção de partes soltas da cartilagem danificada
e o corte da cartilagem articular ou superfície meniscal [10]. Ao contrário das técnicas
artroscópicas minimamente invasivas mencionadas anteriormente, a substituição
total da articulação vem com um procedimento cirúrgico severamente invasivo que é
comumente considerado a última opção para pacientes com degeneração significativa
dos tecidos articulares [20]. A substituição total das articulações articulares, joelho e
quadril, por próteses metálicas ou cerâmicas e encaixes com superfícies de apoio
poliméricas tem proporcionado melhorias consideráveis na qualidade de vida de
pacientes em todo o mundo. Novos desenvolvimentos em design de próteses e
biomateriais, bem como as técnicas cirúrgicas, continuaram a reduzir riscos, como
osteólise mediada por detritos de desgaste, infecção, inflamação e formação de
coágulos sanguíneos [21]. É importante ressaltar que essa estratégia raramente é
prática para pacientes jovens devido à vida útil limitada dos implantes. Assim, estão
a ser exploradas e aplicadas estratégias alternativas, preferencialmente de base
biológica, que visam intervir nas fases iniciais da degeneração dos tecidos para evitar
a deterioração contínua e estimular a regeneração dos tecidos para
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Fig. 1. Esquema da cartilagem articular e sua composição de
matriz extracelular. (A) Organização regional e zonal da
cartilagem articular - zonas superficiais, médias, profundas e
calcificadas (os condrócitos e a orientação das fibras colágenas
variam em diferentes zonas). (B)
Matriz extracelular de condrócitos e cartilagem.
Fibras de colágeno (principalmente colágeno tipo II) são
emaranhadas com proteoglicanos altamente carregados
negativamente (principalmente agrecano) formando uma
matriz extracelular densa e viscoelástica para resistir à carga compressiva.
eficácia a longo prazo.
1.3.2. Tratamentos regenerativos
As primeiras abordagens para o reparo da cartilagem geralmente envolviam um
procedimento cirúrgico em duas etapas, que provavelmente estava associado ao
risco de infecção e inflamação [12,20,59]. Primeiro, o tecido de cartilagem saudável
é removido de uma região do osso que não suporta carga e, em seguida, é expandido
in vitro. O segundo procedimento cirúrgico é implantar as células recém-crescidas na
cartilagem defeituosa. Entre várias terapias de cartilagem atuais, a microfratura é
uma das abordagens mais utilizadas [60].
Ele cria pequenas fraturas no subcondral para estimular a migração de células
estromais/tronco mesenquimais residentes da medula óssea (MSCs) para o local do
defeito da cartilagem (Fig. 2A). Embora o procedimento seja simples e rápido, o
tecido regenerado é a fibrocartilagem, que possui propriedades mecânicas inferiores
em comparação com a cartilagem hialina saudável original [59].
Mais recentemente, as abordagens de implantação autóloga de condrócitos
(ACI) ofereceram uma nova estratégia para regenerar a cartilagem articular
bioquimicamente e biomecanicamente funcional, comparável ao tecido saudável
original (Fig. 2B) [ 14 ] . As iterações anteriores observaram uma perda de células
implantadas no local do defeito, portanto, o procedimento foi alterado para cobrir o
implante com um retalho periosteal, que pode causar uma reação imune às
membranas de colágeno alogênico. O processo também requer a coleta de
condrócitos maduros de uma área sem suporte de carga da articulação do paciente
e expandida para produzir a quantidade desejada de células in vitro , o que pode
resultar em alterações na morfologia dos condrócitos e desdiferenciação [12,17,18].
Melhorias adicionais do ACI envolveram o uso de biomateriais que transportam
células e sinais biológicos para estimular a proliferação celular e manter o fenótipo
dos condrócitos [61].
Isso é conhecido como ACI de terceira geração ou implantação autóloga de
condrócitos induzida por matriz (MACI). Um processo de quarta geração para ACI
visa minimizar o procedimento cirúrgico; em vez de coletar e expandir condrócitos
antes do retransplante, células autólogas ou alogênicas não expandidas são aplicadas
na área do defeito com ou sem a adição de outros suplementos. Estes forneceram
um
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Fig. 2. Ilustração esquemática das abordagens atuais para o tratamento de defeitos da cartilagem. (A, B) Abordagens clínicas atuais, incluindo (A) microfratura e (B)
implante autólogo de condrócitos (ACI). (C) Estratégias baseadas em engenharia de tecidos para realizar um tratamento minimamente invasivo via injeção.
procedimento simplificado em uma etapa. A eficácia do ACI é altamente
dependente do estado biológico dos condrócitos e tem limitações de tamanho
de defeito focal. As indicações atuais são para pacientes jovens e ativos com
tamanho de defeito inferior a 2,5 cm2 [62].
O debate ainda envolve a seleção da fonte celular ideal para ACI na prática
clínica [19,61,63]. Portanto, os pesquisadores também focaram sua atenção em
estratégias livres de células usando biomateriais como uma abordagem
alternativa para o reparo da cartilagem. A condrogênese induzida por matriz
autóloga (AMIC) é um procedimento livre de células em uma única etapa que
utiliza um andaime de biomaterial para induzir a regeneração da cartilagem [64].
Vários estudos pioneiros testaram matrizes de colágeno tipo I/tipo III, que
também foram usadas em ACI de segunda geração e demonstraram resultados
promissores em ensaios clínicos para reparo de defeitos de espessura total
[65] . As estratégias AMIC atuais fornecem interações célula-material inadequadas
devido à falta de micronichos no andaime. Em resumo, as terapias baseadas
apenas em células ou scaffolds fizeram progressos significativos nas últimas
décadas, mas ainda permanecem desafios na busca por uma terapia que possa
regenerar tecido totalmente funcional comparável à cartilagem articular saudável.
A atenção agora se voltou para a engenharia de tecidos como uma abordagem
promissora para atingir esse objetivo.
Avanços recentes na engenharia de tecidos fornecem novas estratégias que
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Biomateriais 279 (2021) 121214
usam biomateriais para suportar ou encapsular células específicas em conjunto
com estímulos bioquímicos ou físicos apropriados que permitem a regeneração
tecidual [66,67]. As matrizes de hidrogel têm uma capacidade extraordinária de
absorção de água e possuem uma rede 3D fisicamente e/ou quimicamente
cruzada, semelhante ao ECM [27,68]. Além disso, os hidrogéis são injetáveis e
capazes de encapsular células e biomoléculas para a entrega [40,69,70]. Um
corpo significativo de trabalho descreve os avanços feitos no uso de hidrogéis
para cartilagem articular de engenharia de tecidos [25,29,71, 72]. Apesar dos
resultados promissores, ainda existem limitações na qualidade do tecido que
pode ser formado, em parte devido a limitações na difusão de nutrientes [28].
Isso resulta em troca limitada de nutrientes, oxigênio e metabólitos para células
embutidas profundamente dentro do hidrogel devido à falta de macroporosidade
dentro de uma rede de hidrogel altamente reticulada [73]. Além disso, é
importante integrar pistas bioquímicas e biológicas ao hidrogel para orientar a
função celular e a regeneração tecidual [24, 28,74]. Assim, a atenção recente
se deslocou para tecnologias que reduzem a escala de hidrogéis injetáveis a
granel em partículas em microescala conhecidas como microgéis (Fig. 2C). Os
microgéis possuem muitos recursos que são adequados para a engenharia de
tecidos [75,76]. Devido ao seu tamanho significativamente reduzido, os microgéis
também fornecem um microambiente favorável para o crescimento celular, onde
a maior área de superfície em relação ao volume facilita
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difusão em comparação com hidrogéis a granel [77]. Devido à sua capacidade de ajuste
única, diversos andaimes microporosos montados em microgel têm sido cada vez mais
gerados em termos de tamanhos e formas e composições na engenharia de tecidos
[23,76,78]. Outras propriedades úteis são seu potencial para encapsular células e fatores
bioativos e fornecer cargas para o corpo [79,80]. Os microgéis também podem ser
administrados por meio de procedimentos minimamente invasivos, devido à sua injetabilidade
[70,73,81,82]. Em conclusão, os microgéis possuem as características necessárias para se
tornar uma ferramenta versátil para recapitular a organização complexa e hierárquica dos
tecidos nativos.
Nesta revisão, vamos nos concentrar em microgéis para criar andaimes biomiméticos de
cartilagem e seu potencial para o objetivo final da regeneração do tecido cartilaginoso.
2. Técnicas de fabricação de microgéis
2.1. biomateriais
Microgéis usados para engenharia de tecidos de cartilagem foram fabricados a partir de
uma ampla gama de biomateriais de origem natural e sintética [38,83]. A ECM da cartilagem
articular é rica em polissacarídeos e proteínas e, portanto, os hidrogéis fabricados a partir
desses componentes têm sido amplamente estudados, tanto individualmente quanto em
combinação. Polímeros sintéticos, como o poli(etileno glicol) (PEG), podem melhorar o
controle das propriedades mecânicas e de degradação e, portanto, também foram incorporados
a muitos sistemas [39,81,84]. Outras abordagens, como o uso de ECM de cartilagem
descelularizada, também foram investigadas [85].
Dos polímeros à base de polissacarídeos, alginato [23,86], quitosana [80,87] e ácido
hialurônico [73,74] receberam atenção significativa.
O alginato é um polissacarídeo linear que consiste em ácido nurônico ÿ-D-man ligado a 1,4
e ácido ÿ-L-gulurônico, que pode promover a manutenção do fenótipo condrogênico, bem
como a diferenciação de MSCs para a linhagem condrogênica [23, 45,88]. A quitosana é
outro polissacarídeo, composto de D-glucosamina ligada em 1,4 e resíduos de N-acetil-D-
glucosamina distribuídos aleatoriamente, é enzimaticamente degradável in vivo (via lisossomo)
[80]. A estrutura da quitosana é análoga aos glicosaminoglicanos e, portanto, exibe maior
adesão e proliferação celular, pode manter o fenótipo condrogênico e aumenta a deposição
da matriz cartilaginosa [87,89]. O ácido hialurônico, também conhecido como hialuronano
(HA), é composto de ácido ÿ-D-glucurônico ligado em 1,4 e unidades dissacarídicas repetidas
de N-acetil-ÿ-D-glucosamina [73,75]. O HA é um dos componentes predominantes na
cartilagem articular e desempenha um papel crítico na montagem com o agrecan para
fornecer a estrutura resiliente e os processos de condensação [51,74]. HA também pode
interagir com uma variedade de proteínas de superfície celular, como CD44, ICAM-1 e
RHAMM, para promover a adesão de condrócitos, proliferação e aumentar o metabolismo
celular [73,74,90].
Os hidrogéis à base de proteínas tendem a se concentrar no colágeno [91] ou na gelatina
[39,73,74,81,84] como uma biomolécula. O colágeno, especialmente o colágeno tipo II, é o
principal componente da ECM da cartilagem articular; portanto, o colágeno possui grande
potencial na regeneração da cartilagem [37,91]. Como uma forma desnaturada de colágeno,
a gelatina retém muitas das propriedades do colágeno, como a apresentação de peptídeos
RGD de ligação celular, bem como baixa imunogenicidade [39,92,93]. A gelatina também
tem biodegradabilidade favorável e pode ser degradada por meio de metaloproteinases de
matriz (MMPs), como MMP-2 e MMP-9 [94]. A gelatina é altamente biocompatível, suporta
adesão celular, migração e proliferação e é adequada para promover a diferenciação
condrogênica [39,73,81,84,93]. O poli(etileno glicol) (PEG) é o polímero sintético mais
amplamente utilizado para formar hidrogéis em aplicações de engenharia de tecidos, pois
não é tóxico, tem baixa incrustação e é altamente solúvel em solventes aquosos e orgânicos,
e é aprovado pela FDA para muitas aplicações biomédicas [76,95]. Para atingir taxas de
degradação controláveis, o PEG pode ser incorporado com poliésteres como poli(ácido lático)
(PLLA), poli(ácido lático-co-glicólico ( PLGA) e policaprolactona (PCL) para formar hidrogéis
de copolímero tribloco de PEG [83, 96, 97]. Para aumentar a adesão celular, o PEG é
frequentemente conjugado com peptídeos RGD, fibronectina, laminina ou colágeno [98-100].
5
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MSCs fotoencapsuladas em hidrogéis de PEGDA mostraram diferenciação condrogênica
com deposição de matriz cartilaginosa em estudos in vitro e in vivo [101].
2.2. Estratégias de ligação cruzada
A gelificação do microgel pode ser obtida por reticulação física ou química e depende
dos tipos de polímeros utilizados, da estratégia de encapsulamento celular e da aplicação
pretendida. A reticulação física pode ser desencadeada por meio de estímulos físicos
externos, como mudanças na concentração de íons (por exemplo, alginato) [80,86,88,102]
ou temperatura (por exemplo, colágeno, gelatina) [88], que promovem a montagem alterando
as forças intermoleculares e o polímero conformação em cadeia. Como nenhum reticulador
ou catalisador químico externo é necessário para a reticulação física, essa abordagem
minimiza quaisquer efeitos potencialmente tóxicos. Hidrogéis fisicamente reticulados têm,
portanto, atraído interesse significativo em aplicações de engenharia de tecidos. Embora os
hidrogéis fisicamente reticulados tenham sido investigados para o reparo da cartilagem
articular, suas propriedades mecânicas relativamente ruins e baixa estabilidade podem tornar
essa abordagem desafiadora para esta aplicação. Uma vantagem fundamental da reticulação
física, no entanto, é que eles podem ser estruturalmente dinâmicos, proporcionando um
maior potencial de remodelação da matriz para facilitar a disseminação, proliferação, migração
e diferenciação celular, com aprimoramento dos resultados da regeneração tecidual in vivo
[103 ] .
A reticulação química pode ser alcançada por uma variedade de estratégias que facilitam
a ligação covalente para produzir hidrogéis que são geralmente mais estáveis e têm
propriedades mecânicas melhoradas em comparação com hidrogéis fisicamente reticulados.
Uma reação de reticulação amplamente utilizada é a adição de Michael [73,74,76] que pode
ser conduzida sob condições fisiológicas com a adição nucleofílica de ligações duplas
ativadas e nucleófilos [104]. Um exemplo dessa estratégia na fabricação de microgéis é o
trabalho de Feng et al. em que microgéis híbridos de gelatina/ácido hialurônico foram
fabricados usando um chip microfluídico e usou uma reação de adição de tiol-Michael entre
gelatina tiolada (Gel-SH) e ácido etil sulfato hialurônico (HA-VS) para induzir reticulação
rápida e espontânea à temperatura ambiente [ 73,74].
A reticulação química também pode ser realizada pela reação de base de Schiff
[105,106] que ocorre entre aldeídos e grupos amino, formando ligações de imina sem
qualquer reticulador externo ou estímulos. Devido às suas condições de reação suaves e
rápida taxa de gelificação, as reações de base de Schiff têm sido amplamente aplicadas na
fabricação de hidrogel injetável para regeneração de cartilagem. A quitosana e a gelatina
possuem grupos amina abundantes em sua espinha dorsal, tornando-os os dois componentes
mais utilizados de hidrogéis formados usando a reação de base de Schiff. Foi relatado que a
gelatina reage com alginato funcionalizado com aldeído para formar um hidrogel injetável
para encapsulamento 3D de condrócitos [106].
A reticulação enzimática é outro método para produzir hidrogéis injetáveis. Aqui, as
propriedades mecânicas e a cinética de gelificação do hidrogel podem ser facilmente
ajustadas alterando a enzima e/ou a concentração do catalisador associado [107-109]. Para
a regeneração da cartilagem, hidrogéis estáveis formados por reticulação enzimática foram
desenvolvidos usando materiais naturais, como pululano, sulfato de condroitina, gelatina,
celulose, dextrana e HA [107,108,110] e materiais sintéticos, como PLGA e glicopeptídeo
[111]. Um exemplo é a reticulação de um hidrogel de HA funcionalizado com transglutaminase
usando FXIII [112]. No entanto, muitas químicas enzimáticas de reticulação (por exemplo,
hidrogéis funcionalizados com grupos de tiramina) requerem peroxidase de rábano silvestre
(HRP) e peróxido de hidrogênio (H2O2) , que podem ser tóxicos para as células em altas
concentrações [113,114]. Os sistemas de hidrogel de reticulação baseados em enzimas
também podem ser bastante caros [107,113].
A fotopolimerização tem sido considerada uma abordagem atraente para a fabricação de
hidrogel com base nas condições de reação suaves, bem como no controle temporal e
espacial preciso durante o processo de síntese. O processo de fotopolimerização é
desencadeado através da iluminação em comprimentos de onda específicos de luz que são
absorvidos por certos cromóforos no material. Em particular, os fotoiniciadores podem
absorver
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luz e decompor ou acionar um co-iniciador para se decompor para gerar radicais e iniciar
o processo de polimerização. Os fotoiniciadores mais amplamente utilizados pertencem
aos fotoiniciadores tipo I, que se dissociam em dois radicais primários quando irradiados
por um comprimento de onda específico de luz. O Irgacure 2959 (I2959) está
comercialmente disponível e é usado em sistemas de hidrogel para regeneração da
cartilagem articular há muitos anos, permitindo a fotopolimerização sob luz UV de 365 nm
[115,116]. Mais recentemente, o lítio fenil-2,4, 6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP) foi favorecido
devido à sua capacidade de atingir o encapsulamento celular em comprimentos de onda
mais longos e visíveis (até 420 nm), o que é muito mais compatível com células vivas em
comparação com UV luz (normalmente a 356 nm). Vários estudos usando hidrogéis à
base de GelMA e PEG demonstraram o uso de LAP para regeneração de cartilagem
usando luz visível, que não tem efeito citotóxico [117,118].
A química do clique foi definida pela primeira vez há aproximadamente duas décadas
e abrange um grupo de reações que são rápidas, altamente específicas, de alto rendimento
e bioortogonais. Para aplicações de engenharia de tecidos, particularmente para reparo
de cartilagem, a reação de cicloadição de azida alcino [3 + 2] promovida por estirpe
(SPAAC) atraiu um grande interesse. Dextran foi funcionalizado com azadibenzo
ciclooctina (Dex-ADIBO) e azida (Dex-N3) para encapsular condrócitos ou esferóides de
condrócitos in situ [119]. O hidrogel apresentou boa estabilidade mecânica e
biocompatibilidade proporcionando um ambiente adequado para deposição de matriz
cartilaginosa. O HA também foi funcionalizado com grupos dibenzociclooctil (DBCO) e
hidrogéis formados por reação com azidas PEG de 4 braços [120]. As propriedades
mecânicas podem ser facilmente ajustadas por meio do ajuste das concentrações de
macrômero/reticulador.
Além disso, a formação de estruturas de lacunas é evidente neste sistema após 35 dias
de injeção subcutânea.
A reticulação iniciada por foto pode ser obtida usando a química de fotoclique de tiol-
eno e é cada vez mais usada para reticulação de hidrogel [39, 81,84,121]. Esta abordagem
é atraente, pois permite a gelificação rápida com controle temporal e espacial preciso
[78,122-124]. Não há necessidade de ambientes inibidos por oxigênio para reações de
clique de tiol-eno e uma concentração de radical mais baixa é necessária para iniciação.
O mecanismo de reticulação ortogonal também alcança uma rede de gel mais homogênea
com menos defeitos em comparação com o processo de polimerização baseado em
radicais livres.
Atualmente, também é a abordagem mais popular para a fabricação de microgéis
carregados de células assistida por microfluidos de gotículas [125]. Essa estratégia de
reticulação sob demanda elimina o início da gelificação espontânea antes da formação de
gotículas e pode ser adaptada em vários dispositivos microfluídicos sem a necessidade
de projetos complicados. Em nossos estudos recentes, adotamos uma estratégia de
fotorreticulação baseada em tioleno altamente biocompatível e biortogonal para fabricar
microgéis de gelatina sob demanda de tamanho uniforme usando um dispositivo
microfluídico de ponta de pipeta fácil capaz de capacidade de regeneração de cartilagem
[39,81,84] . Além disso, o uso de luz azul em vez de luz UV prejudicial neste sistema tem
sido benéfico para melhorar a viabilidade celular.
2.3. Métodos para produção de microgel
Os microgéis podem ser fabricados por técnicas convencionais, como extrusão,
eletropulverização e polimerização em emulsão [37,41,42,88, 126]. No entanto, a aplicação
desses métodos para aplicações de engenharia de tecidos é limitada por vários fatores,
como alta polidispersão, baixo rendimento, baixa reprodutibilidade, biocompatibilidade
inferior e incapacidade de fabricar micropartículas de tamanho pequeno (ÿ100 ÿm)
[38,126 ] . Para superar essas desvantagens, várias técnicas, como fotolitografia,
micromoldagem, várias técnicas microfluídicas e impressão 3D estão ganhando mais
atenção [127-129]. Dentre elas, a microfluídica de gotículas é considerada a técnica mais
eficaz, pois é capaz de produzir eficientemente microgéis altamente monodispersos com
baixo coeficiente de variação (CV, definido como a razão entre o desvio padrão e a média
do tamanho do microgel), tipicamente menos de 5% [23,44,76,130].
A formação de microgel à base de microfluidos não requer o uso de ultra-som ou agitação
mecânica para criar uma emulsão como usada em
6
Biomateriais 279 (2021) 121214
métodos convencionais [45,131,132]. É um processo de fabricação fácil que geralmente é
considerado biocompatível para a microencapsulação de biomoléculas e células sensíveis.
Além disso, devido ao seu design flexível e ajustável, este sistema pode ser compatível
com uma ampla gama de polímeros e estratégias de reticulação. Por estas razões, as
técnicas microfluídicas baseadas em gotículas são adequadas para uma ampla gama de
aplicações, desde a cultura celular geral até a regeneração complexa de tecidos, incluindo
a regeneração da cartilagem [76].
Em um sistema microfluídico típico de gotículas, as células e a solução pré-gelificada
formam uma mistura aquosa como a fase dispersa, enquanto o óleo transportador e o
surfactante formam a fase contínua [127]. Quando os dois fluidos imiscíveis se encontram
no ponto de junção no dispositivo microfluídico, a fase dispersa será quebrada em gotículas
individuais. Eventualmente, essas gotículas de pré-gel carregadas de células adotam uma
geometria esférica para manter uma estrutura estável no estado de energia livre mais
baixo. Essas gotículas de pré-gel são então submetidas a reticulação para formar microgéis
finais. A geração de microgéis uniformes depende do controle preciso dos fluidos no
sistema microfluídico de gotículas [84]. Além disso, várias geometrias dos canais
microfluídicos foram desenvolvidas para governar dois fluidos imiscíveis. Com base no
projeto das junções de canal, existem três configurações amplamente utilizadas,
conhecidas como junção coaxial, junção de foco de fluxo e junção em T (Tabela 1) [133].
Alternativamente, a impressão 3D tem o potencial de fabricar tecidos biomiméticos
com estruturas definidas, altas complexidades e tamanhos e formas uniformes de maneira
de alto rendimento [72,134] e também pode ser adequado para o aumento de escala e
fabricação de microgéis. Microgéis impressos foram gerados [66,129,135], fornecendo
prova de conceito para esta abordagem para a formação de microgéis para aplicações de
engenharia de tecidos e administração de medicamentos. A biotinta desempenha um
papel crucial no sucesso da impressão 3D, influenciando a capacidade de impressão e as
propriedades físicas da estrutura impressa, bem como suas propriedades biológicas
[128,136]. Juntamente com o desenvolvimento significativo de hidrogéis fotorreticuláveis,
a disponibilidade de biotintas fotorreticuláveis para impressão 3D também se expandiu, o
que permitiu a produção de microgéis com arquiteturas desejáveis e alta eficiência
[72,134,136]. A impressão por processamento digital de luz (DLP) é uma tecnologia de
impressão que tem sido utilizada para produzir microgéis devido ao seu potencial para a
produção eficiente de estruturas em microescala usando biotintas fotorreticuláveis [129].
Um exemplo são células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano
encapsuladas (hADSCs) em microgéis gerados pela tecnologia DLP. Os microgéis podem
ser aplicados em diversas aplicações, como modelo de cultura de células 3D, expansão
celular, criopreservação e montagem de macroestruturas (Fig. 3A)
[129]. Outro estudo desenvolveu um poliglicerol hiper-ramificado fotorreticulável (glicerol
hiper-ramificado acrílico (AHPG) adequado como biotinta para impressão DLP de
microgéis carregados de células com várias formas e tamanhos. As células encapsuladas
retiveram altos níveis de viabilidade, o que demonstrou a boa biocompatibilidade dos
materiais de hidrogel e métodos de biofabricação (Fig. 3B) [135].
3. Microgéis carregados de células: fontes de células, sinais de diferenciação e
montagem de baixo para cima
3.1. Fontes celulares
Além dos materiais e estratégias de reticulação, outro fator importante que afeta a
formação do tecido é a escolha do tipo de célula usado para encapsulamento. Uma
variedade de tipos de células, de condrócitos maduros [137] a progenitoras [81,138] e
células-tronco [139], têm sido empregadas com hidrogéis para a regeneração da cartilagem
articular (Tabela 2).
3.1.1. Condrócitos Os
condrócitos maduros da cartilagem articular são uma primeira escolha lógica e têm
sido amplamente aplicados em estudos laboratoriais, ensaios clínicos e terapias (ACI e
MACI). Geralmente, os condrócitos articulares são isolados de uma pequena biópsia de
tecido de uma área nominalmente sem carga de tecido saudável. Embora isso possa
fornecer um alto
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Tabela 1
Projetos de canais microfluídicos de gotículas.
fonte de células de qualidade, essa abordagem sacrifica uma região de cartilagem
saudável e gera risco potencial para a indução de OA para o paciente [144].
Além disso, a atividade biológica dos condrócitos isolados é geralmente percebida
como comprometida pela idade do paciente, e o ACI geralmente não é indicado
para indivíduos com mais de 50 anos de idade [62].
7
Biomateriais 279 (2021) 121214
Fig. 3. Fabricação de microesferas pela tecnologia 3D DLP
(digital light processing). (A) As microesferas de GelMA impressas
foram geradas em uma plataforma construída de uma impressora
3D autofabricada. A técnica introduzida permitiu a impressão
camada por camada seletivamente, controlando a posição da
plataforma construída e o foco de luz. (B) Matriz de microgéis de
vários formatos fabricados por impressão DLP. (Imagem A
reimpressa da Ref. [129] com permissão de John Wiley & Sons;
Imagem B reimpressa da Ref. [135] com permissão de John Wiley
& Sons).
Além disso, é apenas prático fazer uma pequena biópsia de tecido e, portanto, a
baixa densidade celular da cartilagem, juntamente com os baixos rendimentos
do isolamento, significa que esse procedimento não pode gerar células suficientes
para o tratamento imediato. A solução atual é expandir as células in vitro, mas os
condrócitos expandidos por cultura em monocamada 2D geralmente perdem sua
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TPT Nguyen et al. Biomateriais 279 (2021) 121214

Tabela 2
Progresso do encapsulamento de vários tipos de células em microgéis/hidrogéis para engenharia de tecidos de cartilagem.

Tipos de células fontes de isolamento formato gel Fatores de Marcadores/proteínas de Estágio translacional Referências
indução condrogênica diferenciação

medula óssea humana medula óssea humana Microgéis Indução condrogênica in Expressão gênica Condrogênese in vitro [39,84]
células-tronco mesenquimais vitro a partir do meio condrogênica (SOX-9,
(hBMSCs) (TGF ÿ3) Aggrecan, COMP,
Col2A1 e Col1A1)
Índice de diferenciação

Col2A1:Col1A1

hBMSCs, células hBMSCs foram isoladas de Microgéis Indução condrogênica Expressão gênica Condrogênese in vivo [81]
condroprogenitoras humanas medula óssea derivada do fêmur in vitro de pré- condrogênica (SOX-9,
(hCCs), condrócitos de 3 doadores independentes, hCCs cultura a partir de meios Aggrecan, COMP,
articulares humanos adultos foram isolados da epífise ulnar proximal (TGF ÿ3) por 1 semana Col2A1 e Col1A1)
(hACs) de um doador de 14 semanas Índice de diferenciação

de gestação e hACs isolados de dois Col2A1:Col1A1

doadores do sexo masculino e um

doador do sexo feminino, com idade

entre 26 e 42 anos
BMSCs medula óssea de rato Microgéis Indução condrogênica in Expressão gênica Condrogênese in vitro [74]
vitro a partir do meio condrogênica (SOX-9,
(TGF ÿ3) Aggrecan, COMP,
Col2A1 e Col1A1)
BMSCs medula óssea de rato Microgéis Indução condrogênica Expressão gênica Injeção subcutânea in vivo [73]
in vitro de pré- condrogênica (SOX-9, nas costas de
cultura a partir de meios Aggrecan, COMP, camundongos nus por 8
(TGF ÿ3) por 1 semana Col2A1 e Col1A1) semanas

Progenitor mesenquimal A cabeça tibial lateral durante microesferas Indução condrogênica in Aggrecan, COMP, Condrogênese in vitro [86]
humano osteotomia de cunha fechada vitro a partir do meio Col2A1 e Col1A1

alta da tíbia (três doadores: dois (TGF ÿ3)

homens, uma mulher, com idades
entre
40 e 62 anos) hBMSC e MSC de rato (rMSC) hBMSCs foram derivados de 6 Miçangas FGF2 coloração histológica, Implantação in vivo em [88]
pacientes submetidos a artroplastia conteúdo GAG um modelo de OA de rato em

total do quadril (idade média de 49 ± 8 semanas

11,2 anos ; proporção F:M, 1:1),

enquanto ratos Lewis machos rMSC
de 3 a 4 meses de
Condrócitos idade Condrócitos foram coletados Microtecido Fatores condrogênicos SOX-9, Aggrecan, COMP, 3 meses e 6 meses [137]
articulares de coelho da articulação do joelho, enquanto remanescentes de Col2A1 e Col1A1 de implantação in

e células-tronco ADMSCs foram coletados do tecido partículas derivadas de MEC vivo

adiposo dorsal da nuca de coelhos
mesenquimais derivadas do tecido adiposo de cartilagem
(ADMS) brancos Não fornecido
MSCs da medula óssea Microtecido Não fornecido Coloração histológica e ÿCT, Implantação de [140]
nanofibroso expressão do gene condrogênico microtecido em defeitos da

(agrecan, cartilagem articular do

COMP, Col2A1 e joelho de rato em 6 e 12
Col1A1) semanas
Células-tronco do esqueleto humano hSSCs e hACs foram isolados Chondrobags Indução condrogênica in Expressão gênica Condrogênese in vitro [45]
(hSSCs) e hACs de medula óssea humana (macho vitro a partir do meio (TGF condrogênica (SOX-9,
de 70 anos de idade) e cabeça ÿ1, 3). Os Aggrecan, COMP,
femoral de macho de 61 anos de chondrobags contêm Col2A1 e Col1A1)
idade), respectivamente fibronectina
Células estromais de ratos Fischer com 6 meses de idade Microesferas Indução condrogênica in Col2A1 Condrogênese in vitro [38]
mesenquimais da medula vitro a partir do meio (TGF
óssea de rato (rBMSCs) ÿ1)
Derivado de tecido adiposo de camundongo Tecidos adiposos foram coletados por Hidrogel híbrido Indução condrogênica in Coloração histológica e Condrogênese in vitro [83]
Células-tronco (ADSCs) biópsia de agulha de camundongos vitro a partir do meio (TGF quantificação de Col2A1 e
ÿ1) SOX-9
sem celular HAP-1- Nenhum EPIC-ÿCT e histologia Injeção em OA de joelho [100]
microgéis pós-traumática até 26 dias
funcionalizados
sem celular Nano/ Kartogen's Aggrecan, Col2A1 e Injeção em induzido [80]
micropartículas Col1A1 Modelo de OA em ratos em 14

conjugadas com Kartogenina semanas

sem celular Microgéis SDF-1a e TGF-b3 foram Coloração histológica e ÿCT Tratamento do modelo de [89]
carregados com lesão da placa de
microgéis crescimento de rato com
microgéis

epifisária humana As hECPs foram colhidas da epífise ulnar hidrogéis híbridos Indução condrogênica in SOX-9, Aggrecan, COMP, durante 4 [138]
condroprogenitores proximal de uma doação de órgãos de vitro a partir do meio Col2A1 e Col1A1, semanas 8
(hECPs) e hBMSCs 14 semanas de gestação, enquanto (TGF ÿ3) RPL13a, Ihh, PTH1R, semanas após a implantação subcutânea
as hBMSCs foram isoladas de amostras Escleraxis, TGIF1, VEGFA
de medula óssea derivadas do fêmur

(duas doadoras do sexo feminino e

um doador do sexo masculino, com
idades entre 28 e 31 anos)

(Continua na próxima página)

8
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Tabela 2 (continuação )
Tipos de células fontes de isolamento formato gel
orelha de coelho As células foram isoladas da Hidrogéis híbridos Indução condrogênica in vitro a
condrócitos cartilagem da orelha de coelhos
sacrificados
Condrócitos nasais de coelho NCs foram isoladas da biópsia do Hidrogel
septo nasal de coelhos brancos
Condrócitos humanos As células foram isoladas de Hidrogel
imaturos/fetais a cabeça femoral do
tecido cartilaginoso com 12 semanas
de gestação.
morfologia arredondada única, adotam uma morfologia fibroblástica e se
desdiferenciam, perdendo assim muitos dos atributos que os tornam atraentes
para a formação da cartilagem articular. Devido à disponibilidade limitada desse
tipo de célula, poucos relatos de condrócitos articulares sendo usados em
microgéis foram relatados até agora, embora um estudo tenha cultivado
condrócitos articulares em partículas derivadas da matriz extracelular de cartilagem
que foram capazes de formar microtecidos funcionais semelhantes a cartilagem
que exibiram altos níveis de marcadores relacionados à cartilagem [137].
Outros estudos exploraram fontes alternativas de condrócitos.
Condrócitos imaturos, como condrócitos fetais, infantis e juvenis, apresentam
maior capacidade de proliferação e condrogênese em comparação com
condrócitos maduros [143,145] e podem, portanto, ser uma fonte viável de células
alogênicas para a prática clínica, removendo os problemas de morbidade do
doador e número de células em comparação com células autólogas condrócitos
maduros. Também tem havido interesse em condrócitos colhidos de outras partes
do corpo, como orelha, nariz e esterno, com estudos relatando o encapsulamento
de condrócitos auriculares [141,146] e condrócitos nasais [142,147] em redes de
hidrogel injetável para regeneração de cartilagem .
3.1.2. Células-tronco
pluripotentes A implantação em larga escala de terapias baseadas em células
para a regeneração da cartilagem pode significar que o número de células
disponíveis a partir de fontes de condrócitos é insuficiente para atender à demanda
[139]. Aqui, as células-tronco pluripotentes podem ser um meio de superar esse
desafio, pois podem ser expandidas quase indefinidamente e são capazes de se
diferenciar em vários tipos de células, incluindo condrócitos [148–151] .
As células-tronco embrionárias (ESCs) são células-tronco pluripotentes, derivadas
da massa celular interna do embrião inicial e vários estudos demonstraram que
é possível guiar a diferenciação das ESC em direção aos condrócitos [152,153] .
No entanto, as preocupações éticas e o potencial tumorigênico dessas células
permanecem obstáculos significativos que precisam ser abordados antes de
considerar seu uso mais amplo em aplicações clínicas.
Em contraste, as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), possuem
pluripotência e uma capacidade de autorrenovação semelhante às células-tronco
embrionárias (ESCs), mas sem as preocupações éticas associadas [148] . Uma
série de estudos in vitro recentes de iPSCs derivados de diferentes tipos de
células demonstraram proliferação mais rápida e maior potencial condrogênico
em comparação com MSCs [154,155]. Embora as iPSCs tenham exibido grande
potencial para regeneração de cartilagem, várias preocupações em relação à
geração e segurança de células e o alto custo de colheita, reprogramação,
proliferação, diferenciação e processo de transplante também limitam o uso desse
tipo de célula [148,152] . Para evitar a formação de teratoma cancerígeno, espera-
se que as células pluripotentes indiferenciadas sejam excluídas dos locais de
tratamento por várias estratégias. Uma delas é o uso de anticorpos tóxicos ou
toxinas guiadas por anticorpos direcionadas a células indiferenciadas [156,157].
Outra abordagem é eliminar seletivamente as células em proliferação após o
transplante celular, que é o uso de genes suicidas ligados a um gene de divisão
celular [158]. Portanto, até agora, iPSCs ainda não são viáveis em aplicações
clínicas relacionadas à regeneração da cartilagem articular [148,154,155].
Células-tronco adultas, como células-tronco mesenquimais/estromais (MSCs),
Biomateriais 279 (2021) 121214
Fatores de Marcadores/proteínas de Estágio translacional Referências
indução condrogênica diferenciação
SOX-9, Agrecan, Inserção de scaffold [141]
partir de meios Col2A1 simulando traqueia em
(TGF ÿ1) coelhos por 4 semanas
Não fornecido Coloração histológica e Injeção em defeito [142]
quantificação de Col2A1 e osteocondral de joelho
SOX-9, Aggrecan de coelho até 6 meses
Indução condrogênica in Coloração histológica e Implantação [143]
vitro a partir do meio quantificação de Col2A1, subcutânea nas costas
(TGF ÿ3) Agrecano e SOX-9 de camundongos nus até 4
semanas
são novamente uma fonte alternativa de condrócitos [139]. As MSCs têm sido
extensivamente estudadas devido às suas propriedades imunossupressoras e
são capazes de se diferenciar em condrócitos, bem como em osteoblastos e
adipócitos. Além disso, as MSCs podem ser derivadas de muitos tecidos diferentes
do corpo, como medula óssea, tecido adiposo, sinóvia, sangue umbilical e
periósteo [30], e, portanto, estão prontamente disponíveis. Mais recentemente, as
iPSCs surgiram como uma fonte alternativa de MSC porque possuem altas
capacidades de auto-renovação e multipotência que permitem que sejam
diferenciadas em MSCs [150,159,160].
Entre as fontes de MSC, as MSCs derivadas da medula óssea humana
(hBMSCs) são comumente usadas para aplicações clínicas [139,161]. hBMSCs
são fáceis de isolar de doadores e podem ser diferenciadas em condrócitos para
regenerar a cartilagem hialina [161]. Evidências adicionais sugerem que são as
hBMSCs que são mobilizadas pelas atuais terapias baseadas em microfraturas,
conforme discutido anteriormente [60]. Os sistemas de microgel têm sido bem
conhecidos como um excelente modelo de cultura 3D in vitro para a expansão de
MSCs sem perda de sua capacidade de diferenciação [38,121,137]. Mais
recentemente, o uso de microgéis foi estendido de uma ferramenta que pode
expandir MSCs em 3D para um andaime que encapsula MSCs para eventual
entrega em um modelo in vivo [67,88,102] e cada vez mais estudos estão
demonstrando resultados positivos ao usar MSC carregado microgéis para
regeneração de cartilagem [38,39,73,81,83,84,88,121,137,140], formação óssea
[37, 40,69,70,162–164] e outras aplicações in vitro e in vivo.
Com foco em microgéis para reparo de cartilagem, Yin et al. [137]
desenvolveram partículas derivadas da matriz extracelular que suportavam o
crescimento de condrócitos articulares (ACs) ou células-tronco derivadas de
tecido adiposo (ASCs) em sua superfície para formar microtecidos funcionais.
Esses microtecidos foram implantados em modelos de defeitos trocleares femorais
de coelhos. Os tecidos de cartilagem tipo hialina resultantes se formaram após 3
meses de implantação (Fig. 4 A) [137]. Em outro estudo, microcarreadores
nanofibrosos foram fabricados para cultivar BMSCs e a cultura foi realizada em
um sistema de cultura de células rotativas de microgravidade simulado que
ofereceu um sistema de cultura dinâmico com melhor troca de gases e nutrientes
para atingir um determinado número de células. Devido à alta porosidade
fornecida pelos microcarreadores nanofibrosos, houve impedimento mínimo para
a troca de nutrientes e metabólitos, levando a alta proliferação celular e
diferenciação condrogênica. Após 3 semanas de pré-cultura, tecidos de cartilagem
funcionais formados e implantados em um defeito articular do joelho em ratos,
mostrando forte condrogênese in vivo (Fig. 4B) [140]. Na maioria dos estudos, os
microgéis fabricados foram imersos em uma suspensão de MSCs, permitindo que
as células se ligassem à superfície dos microgéis [137,165]. Para aumentar ainda
mais a interação célula-estrutura, foram desenvolvidos métodos nos quais as
células são encapsuladas nos hidrogéis à medida que são formados.
Isso produz andaimes porosos, onde as células podem penetrar na estrutura
interna, tornando-a benéfica para uma melhor troca de metabólitos [82, 140].
Embora as células encapsuladas mostrassem alta viabilidade celular, assumindo
que o estresse de cisalhamento fluídico ocorreu durante a injeção, as células
devem ser encapsuladas in situ dentro dos andaimes para minimizar quaisquer
efeitos de pressão mecânica que possam afetar a sobrevivência celular. A
microencapsulação in situ tornou-se preferível recentemente, onde a encapsulação
celular ocorre simultaneamente com a formação do microgel [38,39,73,81,84,121]. Depois
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Fig. 4. Exemplos de estudos iniciais usando microgéis/

microtecidos carregados de células para implantação em
locais de cartilagem defeituosa. (A) Geração de microtecido
manipulado de tecido derivado de matriz extracelular de
cartilagem e implantação desses microtecidos no local defeituoso.
(B) Microtecido de cartilagem funcional formado a partir de
BMSCs encapsulados de microtransportadores nanofibrosos
e injeção dos microtecidos manipulados em locais de
defeito de cartilagem. (C) microgéis de gelatina-norborneno
(GelNB) carregados com hBMSC e indução das células
encapsuladas para a condrogênese. (A imagem A é
reproduzida da Ref. [137] com permissão da Elsevier; a
imagem B é reproduzida da Ref. [140] com permissão da
Elsevier; a imagem C é reproduzida da Ref. [84] com
permissão da American Chemical Society) .

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Na microencapsulação, as células são distribuídas homogeneamente nos microgéis.
No entanto, após cultura prolongada, as células tendem a migrar para a região
periférica com menos células residindo no núcleo [74,81,164].
De acordo com Li et al. [84], as hBMSCs encapsuladas em microgéis à base de
gelatina-norborneno exibiram um grau incomumente alto de condrogênese em
comparação com hidrogel em massa e culturas de pastilhas “padrão ouro” e
expressaram níveis de moléculas de matriz consistentes com a produção de ECM e
indicando a produção de hialina- tipo em vez de fibrocartilagem (Fig. 4C) [84]. Este
sistema de microgel carregado de células é um candidato particularmente promissor
para a regeneração da cartilagem articular, bem como para outras aplicações de
engenharia de tecidos. Em resumo, independentemente de como as células são
incorporadas nos microgéis, seja encapsuladas no interior ou localizadas em sua
superfície, as culturas de microgéis parecem melhorar universalmente a viabilidade
celular, proliferação e potencial condrogênico em comparação com géis a granel ou
culturas de pellets.
3.1.3. Condroprogenitores epifisários humanos
Os condroprogenitores epifisários humanos (hECPs, também conhecidos como
células condroprogenitoras fetais humanas ou hCCs) são uma fonte de células
progenitoras recentemente proposta, colhidas da epífise ulnar proximal de um doador
de gestação com 14 semanas [112,138,166] . Sua capacidade de diferenciação
condrogênica predicada e estabilidade os tornam um forte candidato para a
regeneração da cartilagem [112]. Devido à sua origem fetal, as hECPs têm baixa
imunogenicidade e características livres de risco de teratoma, que são as principais
limitações das iPSCs [138]. Além disso, hECPs têm uma alta taxa de proliferação
que permite um grande rendimento de um único doador de tecido e, consequentemente,
homogeneidade superior da população de células resultante em comparação com
fontes de células maduras [166,167]. Ressalta-se também que os estudos desse tipo
celular requerem aprovações éticas prévias antes de serem realizados, o que pode
atrasar o encaminhamento dessas células para ensaios clínicos. Ainda assim, há um
aumento no número de publicações sobre o uso desses tipos de células de origem
fetal para a regeneração da cartilagem articular devido ao seu grande potencial. Mais
recentemente, alguns estudos impulsionaram o desenvolvimento usando o
encapsulamento in situ de hECPs em diferentes sistemas de hidrogel para
regeneração de cartilagem [81,112,138]. Um estudo recente investigou a
microencapsulação de hCCs isoladas de epífises fetais para condrogênese in vitro e
in vivo com diferentes regimes de TGF-ÿ1. O estudo também mostrou maior
viabilidade celular e migração de células encapsuladas nos microgéis em comparação
com os condrócitos articulares e hBMSCs [81].
Outra fonte celular promissora são as chamadas células multipotentes derivadas
de cartilagem. Este tipo de célula foi isolado e examinado devido à sua potência
semelhante à célula-tronco; no entanto, sua origem e identidade ainda não foram
totalmente reveladas [168,169].
3.1.4. Resposta de células endógenas
Além do impacto nos tipos de células encapsuladas, também pode haver efeitos
dos microgéis nas células endógenas a serem considerados, particularmente a
resposta das células imunes que têm um grande impacto no processo geral de
cicatrização [182] . Compreender e modular o sistema imunológico poderia, portanto,
reduzir a formação de cicatrizes e fibrose e promover a regeneração tecidual [170].
É bem conhecido que a implantação de um biomaterial em um local de defeito pode
ter efeitos sobre a resposta imune [183] e que esta resposta varia com as propriedades
físico-químicas dos biomateriais, incluindo a rede de reticulação, forma, hidrofobicidade/
hidrofilicidade, superfície topografia e química [184].
Geralmente, os biomateriais derivados naturalmente têm graus mais baixos de
reticulação, enquanto os polímeros hidrofílicos demonstraram ter uma resposta menor
em termos de recrutamento de macrófagos [184]. Os microgéis apresentam uma
plataforma ideal que pode ser adaptada para apresentar esses recursos e ajudar a
minimizar qualquer resposta imune indesejável in vivo. Ainda não há relatos
comparando a diferença na resposta imune a microgéis carregados de células ou
volume após serem implantados em modelos animais.
Alternativamente, há potencial futuro para conjugar imunomoduladores a microgéis
para administração terapêutica/de medicamentos, como foi feito ao usar microgéis
para fornecer fatores de crescimento para diferenciação de células-tronco [80,163,
11
Biomateriais 279 (2021) 121214
165].
3.2. Sinais
Biomoléculas solúveis, como fatores de crescimento (GFs) e hormônios, carga
mecânica e baixa tensão de oxigênio influenciam a migração celular, proliferação,
fenótipo condrogênico e diferenciação de células-tronco [43, 74,139]. Muitos estudos
abordaram as pistas necessárias para guiar a diferenciação de células-tronco
(particularmente MSC) em condrócitos e a atividade de condrócitos na formação de
tecido cartilaginoso [80,171]. A família de fatores de crescimento TGF-ÿ é central
tanto para a condrogênese quanto para a deposição de ECM na cartilagem, sendo
TGF-ÿ1 e -ÿ3 os membros mais bem estudados para promover a diferenciação
condrogênica e manter o fenótipo condrogênico das células-tronco [172,173] .
Semelhante à família TGF-ÿ, a família de proteínas morfogenéticas ósseas (BMP)
também é um candidato promissor para regeneração óssea e cartilaginosa. Em
particular, as BMP-2 e 7 podem estimular a condrogênese e a deposição de células-
tronco na MEC cartilaginosa [172,174]. Outros fatores-chave de crescimento são os
fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), que podem reduzir a atividade
catabólica da agrecanase, manter o tecido cartilaginoso [175] e o fator de crescimento
semelhante à insulina-1 (IGF-1), que facilita a síntese de proteoglicano e colágeno e
mostrou resultados benéficos quando combinados com outros fatores de crescimento
[176]. A dexametasona é um corticosteroide amplamente utilizado em combinação
com TGF-ÿ para fornecer sinais adicionais de diferenciação condrogênica às MSCs
[173]. Embora muitos estudos tenham usado doses específicas de fatores de
crescimento simples ou duplos para indução condrogênica, o plasma rico em
plaquetas (PRP) também contém uma variedade de fatores de crescimento e sua
aplicabilidade para a regeneração da cartilagem permanece incerta [177] .
Uma aplicação alternativa de microgéis no reparo da cartilagem é usá-los para
entregar fatores pró-condrogênicos, como TGF-ÿs e BMPs [80,171], ou como um
sistema de entrega de drogas [100]. Vários benefícios do uso de microgéis para
transportar GFs foram revelados [79,173]. A entrega de GFs via microgéis pode
reduzir a necessidade de fornecer múltiplas doses, como é o caso da suplementação
de meio convencional de GFs solúveis [79]. Os microgéis também se mostram
promissores em diminuir a quantidade total de GFs carregados [171]. A falta de
suplementação de GF após a implantação também pode ser resolvida pela
incorporação de microgéis carregados com GFs.
Em sistemas de entrega GF baseados em microgel, vários parâmetros governam
a eficiência do carregamento e liberação da carga. Isso inclui o tamanho e a forma
dos microgéis; estratégias de ligação específicas de microgéis e agentes terapêuticos
carregados, propriedades de inchaço e degradação de microgéis e concentração de
GF por microesfera [75,171,178]. Um ponto chave é que esses fatores podem
potencialmente ser ajustados por uma variedade de abordagens [43]. GFs podem
ser carregados em microgéis durante a fabricação ou pós-fabricação. Na abordagem
de pré-fabricação, as moléculas bioativas são incorporadas aos materiais precursores
do microgel, o que permite alta eficiência de carregamento e liberação sustentada de
fatores carregados [88, 173]. Na abordagem pós-fabricação, os microgéis fabricados
são expostos a uma solução terapêutica bioativa [43,79,171]. Desta forma, a absorção
e a interação entre os microgéis e os fatores carregados determinam a eficiência do
carregamento e o perfil de liberação. Este processo de carregamento é fácil; no
entanto, níveis de carregamento mais baixos e liberação descontrolada foram
relatados, o que limita essa abordagem [178]. Avanços futuros na entrega buscam
investigar como a entrega de drogas pode ser modulada usando biomateriais que
podem responder a estímulos externos, como pH ou temperatura.
Os sistemas de microgéis podem fornecer liberação sustentada de GFs
condrogênicos para células-tronco para promover sua diferenciação em condrócitos
[79, 80,171,173]. As nano/micropartículas de quitosana conjugadas com cartogenina
podem ser usadas como um sistema de entrega de drogas intra-articular (IA) para
tratar a artrite osteoar (OA). A cartogenina é uma pequena molécula que pode induzir
as MSCs a se diferenciarem em condrócitos. Os resultados in vitro mostraram que
as moléculas de karto genina das partículas exibiram uma liberação sustentada ao
longo de 7 semanas in vitro. Além disso, as hBMSCs foram tratadas com partículas
conjugadas com cartogenina e exibiram expressões gênicas condrogênicas mais
altas em comparação com aquelas que foram gerenciadas por partículas com o
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TPT Nguyen et al. Biomateriais 279 (2021) 121214

ausência de cartogenina. A análise in vivo demonstrou ainda que as nano/micropartículas
conjugadas com cartogenina podem reduzir a degeneração da cartilagem em um modelo de OA
induzida em ratos [80].
A discussão anterior trouxe à tona estratégias recentes de andaimes de cartilagem artificial
combinados com microgéis e células-tronco que atingiram a condrogênese in vitro e passaram
para testes in vivo . O pós-transplante de microgéis carregados de células limita o suplemento
de GFs para induzir a diferenciação osteocondrogênica. Portanto, a etapa de pré-incubação do
andaime carregado de células em GFs por um certo tempo in vitro
antes da transferência para in vivo poderia beneficiar o processo de diferenciação e melhorar a
formação de cartilagem [73,81]. Para pesquisas futuras, um andaime baseado em microgel ideal
para implantação incorporaria GFs que, então, espera-se que tenham uma liberação sustentada
para estimular as células encapsuladas a se diferenciarem em condrócitos. Esta abordagem
pode diminuir o tempo de cultura necessário antes da implantação, o que pode causar a perda
do fenótipo dos condrócitos durante a cultura in vitro a longo prazo [79]. Um estudo solubilizou
ECM derivado de cartilagem, que contém GFs condrogênicos, para encapsulamento de MSCs,
evitando assim a necessidade de suplementos exógenos de GF [137].
3.3. Montagem de baixo para cima de estratégias de microgéis para construir construções
maiores e auxiliar na ligação ao tecido nativo
A engenharia de tecidos de baixo para cima tem sido amplamente reconhecida como uma
estratégia desejável para construir construções macroscópicas que imitam estruturas de alta
ordem de tecidos reais [43,179,180]. Os microgéis carregados de células têm uma capacidade
excepcional de servir como blocos de construção a serem transformados em uma construção de
tecido biomimético [181]. Como resultado, tecidos biomiméticos macroscópicos gerados a partir
da montagem de microgéis carregados de células têm sido cada vez mais relatados
[39,76,179,182,183]. Em termos de estratégias de montagem, existem muitas abordagens
variadas para ligar microgéis, muitos dos quais amarram grupos funcionais, presentes em
superfícies de microgéis, por meio de estímulos externos, como tensão superficial reduzida ou
aplicação de calor ou luz [76-78,182,184,185 ] . Produtos químicos como tripolifosfato de sódio
[183], cola de fibrina [140,163] e reticuladores NHS têm sido usados para recozir microgéis em
uma construção [39] , enquanto interações célula-célula e deposição de ECM por células na
superfície de microgéis também podem levar à montagem do microgel [39,73,84].

Um exemplo promissor de fabricação de microgéis montou microgéis de HA injetáveis in

situ por meio de reticulação enzimática induzida por Fator XIII para formar o chamado andaime
de partícula recozida microporosa (MAP) (Fig. 5A)
[76,186]. Esta estratégia de montagem suave pode ser aplicada em ambientes in vivo para
microgéis de ligação covalente e melhorar a integração

Fig. 5. Exemplos de estratégias de reticulação para montagem de microgel. (A) Montagem enzimática de microgéis de HA usando Fator XIIIa. (B) Montagem de microgéis de PEG
usando reação de clique SPAAC (cicloadição de alcino-azida promovida por estirpe). (C) Montagem de fotoclique induzida por UV de microgéis de tiol-eno PEG. (D) As interações
convidado-hospedeiro induziram montagem reversível de microgéis de HA. (E) Montagem de radicais livres de crescimento de cadeia induzida por UV térmico de microgéis de
gelatina. (Painel A adaptado da Ref. [76] com permissão da Springer Nature; Painel B adaptado da Ref. [184] com permissão de John Wiley & Sons, Ltd.; Painel C adaptado da
Ref. [78] com permissão de John Wiley & Sons, Ltd.; Painel D adaptado da Ref. [185] com permissão de John Wiley & Sons, Ltd.; Painel E adaptado da Ref. [77] com permissão da Elsevier).

12
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TPT Nguyen et al.
entre os microgéis e o tecido local. Anseth et ai. introduziu outra maneira elegante de montar
microgéis via química de clique SPAAC (Fig. 5B) [184]; ao quebrar a razão estequiométrica
entre os grupos DBCO (diben zocyclooctyne) e azida (N3) durante a reticulação do
microgel, a superfície dos microgéis apresentou quantidades excessivas de grupos clicáveis,
que foram posteriormente utilizados para a ligação dos microgéis. Diferentes tamanhos de
poros e propriedades mecânicas podem ser alcançados ajustando a distribuição do tamanho
do microgel. Em um estudo semelhante, as superfícies de microgéis foram primeiro
funcionalizadas com uma quantidade excessiva de grupos norborneno e subsequentemente
reagidas com reticulador PEG-ditiol adicional para montar microgéis via reação de fotoclique
de tiol-eno (Fig. 5C) [ 78 ] . Uma abordagem adicional introduziu a ligação hóspede-
hospedeiro para reticular microgéis HA para formar um sistema injetável de "hidrogel
granular" (Fig. 5D)
[185]. Microgéis de HA fotopolimerizados com tioleno foram reticulados através das
interações hóspede-hospedeiro entre os grupos ada mantano e ciclodextrina pré-conjugados
em HA. Devido ao recurso reversível dessa reticulação convidado-hospedeiro, os microgéis
de HA reticulados também demonstraram propriedades de redução de espessura e
autocura. Além dos procedimentos de reticulação covalente em duas etapas acima para
geração e montagem de microgel, a gelificação e montagem de GelMA foram obtidas ao
mesmo tempo por meio de recozimento térmico de uma etapa e processo de fotopolimerização
(Fig. 5E) [ 77 ] . Resumidamente, as gotículas de GelMA pré-gel geradas foram primeiro
purificadas e estabilizadas por reticulação física em DPBS frio (4 ÿC) contendo fotoiniciador.
Os microgéis de GelMA estabilizados fisicamente foram então recozidos termicamente e
fotorreticulados simultaneamente a 37 ÿC para obter o andaime final estável de GelMA (B-
GelMA).
Embora a reticulação enzimática, click, guest-host e térmica/foto tenha demonstrado
biocompatibilidade, esses estudos geralmente incorporam células durante o processo de
montagem do microgel e não via microencapsulamento in situ . Isso significa que as células
são cultivadas na superfície dos microgéis montados [76,78,83,182,184,187]. É relatado que
as células podem migrar entre os espaços interiores através dos poros interconectados
dentro de micro-andaimes altamente porosos em 3D [23,67,70,76,82,140]. Portanto, pode-
se dizer que essas abordagens não oferecem proteção às células durante o processo de
injeção. Além disso, o processo de fabricação altamente sensível à temperatura pode
dificultar o uso como um sistema injetável para aplicações clínicas. Outros estudos
desenvolveram microgéis carregados de células usando métodos que permitem a
microencapsulação in situ e a administração injetável [73,74,81]. Por exemplo, Feng et al.
introduziu o encapsulamento in situ de BMSC dentro dos microgéis híbridos de gelatina/
ácido hialurônico por uma abordagem microfluídica baseada em gotículas. Esses microgéis
carregados de células foram automontados para formar andaimes injetáveis semelhantes
a cartilagem por meio da interconectividade célula-célula, que foi então implantado
hipodermicamente em camundongos [73].
Uma vez implantados in vivo, é essencial que os implantes se integrem ao tecido nativo
circundante para que permaneçam dentro do defeito para facilitar a cicatrização [73,81,84].
Um aspecto positivo de muitos sistemas de microgéis é que as células tendem a migrar
para a superfície do microgel ao longo do tempo [73,188] e, posteriormente, depositar ECM
que 'cola' os microgéis e integra as construções ao tecido nativo circundante.
Outras abordagens tentam ativamente unir os implantes ao tecido circundante. O gel de
fibrina tem sido amplamente utilizado para fixar dobras de scaf carregadas de células ao
tecido hospedeiro devido às suas propriedades biocompatíveis e adesivas [140,163,189].
Uma abordagem alternativa procurou ligar rapidamente os microgéis e o tecido circundante
usando reticuladores multifuncionais de poli (etilenoglicol)-N-hidroxissuccinimida (NHS) de 4
braços. A construção 3D resultante não apenas facilitou alta viabilidade celular e excelente
condrogênese, mas também se uniu a um tecido mímico, mostrando potencial como
estratégia para estudos clínicos em cartilagem articular [39]. Além da montagem de microgel
covalente, Woodfield e colegas de trabalho desenvolveram um processo de montagem
assistido por impressora 3D de várias etapas para fabricar uma construção de microgel
carregada de células montadas com estruturas de embalagem aleatória simples a uma
organização hierárquica híbrida complexa [179] . Embora esta plataforma abra um novo
caminho para utilizar
13
Biomateriais 279 (2021) 121214
microtecidos para construir um tecido biomimético mais estrutural, o requisito de instalação
relativamente alto, o processo complexo e o alto custo podem retardar sua absorção em
pesquisas e aplicações clínicas.
4. Caminho para a clínica
4.1. Vantagens dos microgéis injetáveis – comparação com hidrogéis a granel
As tecnologias de engenharia de tecidos apresentam uma estratégia promissora para o
tratamento de defeitos condrais, auxiliada pelo surgimento de vários biomateriais, fontes
celulares e técnicas de fabricação [190,191]. Há uma preferência por terapias de cartilagem
que podem ser administradas por meio de uma injeção minimamente invasiva, o que atraiu
um amplo corpo de pesquisa ativa em hidrogéis injetáveis [29]. No geral, os hidrogéis
injetáveis exibiram muitos atributos positivos, incluindo excelente biocompatibilidade,
estrutura ajustável, capacidade de incorporar fatores bioativos, bem como administração
por injeção minimamente invasiva para preencher defeitos irregulares [71,163 , 192,193].
No entanto, nenhum desses sistemas mencionados produziu ainda tecido de cartilagem
com propriedades equivalentes ao tecido de cartilagem nativo e, portanto, o campo ainda
busca melhorar suas capacidades atuais. Consequentemente, os microgéis têm atraído
cada vez mais atenção, pois evidências crescentes indicam que eles podem apresentar
inúmeras vantagens sobre os hidrogéis a granel.
4.1.1. Microgéis de tamanho pequeno e alta proporção de
superfície para volume demonstraram suportar maior proliferação e migração celular
em comparação com os hidrogéis a granel [77,81]. Isso foi atribuído ao aumento da troca de
metabólitos (tanto os fatores necessários quanto os produtos residuais) com o ambiente
circundante, impulsionado pela alta relação entre área de superfície e volume. Os microgéis
também podem ser um candidato melhor para a administração de medicamentos do que os
hidrogéis em macroescala, com a alta proporção de área de superfície para a proporção de
volume, promovendo uma maior eficiência de carga e liberação mais controlada da
terapêutica. A extensão futura dessa tecnologia com populações mistas de microgéis
também pode ser usada para fornecer vários bioativos com perfis de liberação independentes.
É importante ressaltar que os microgéis retêm muitos dos atributos necessários para o
sucesso em cenários clínicos. Em primeiro lugar, eles podem ser entregues localmente em
defeitos irregulares por seringa em um tratamento minimamente invasivo, reduzindo assim
a dor, minimizando o risco de infecção durante o procedimento cirúrgico e encurtando o
tempo de recuperação [100] .
4.1.2. Blocos de construção modulares
Uma abordagem baseada em microgel para a regeneração da cartilagem é altamente
versátil, como já comprovado pelas muitas combinações de técnicas de fabricação,
biomateriais, variantes de tamanho e forma e tipos distintos de células encapsuladas até o
momento. O potencial para gerar uma biblioteca tão ampla de tipos de microgéis, juntamente
com a flexibilidade oferecida por meio da combinação espaço-temporal específica e
colocação de vários tipos de microgéis em um andaime complexo, oferece uma enorme
oportunidade para melhor imitar as arquiteturas de tecido nativo. A montagem hierárquica
de blocos de construção de tamanhos variados é uma abordagem que ainda pode produzir
propriedades multifuncionais. Além disso, existem possibilidades de controlar espacialmente
microgéis contendo diferentes tipos de células ou fatores de crescimento dentro de um
composto de microgel para melhor gerar estruturas de tecido ou construir interfaces entre
tecidos. Por exemplo, o controle espacial de microgéis carregados de células provavelmente
será de grande benefício na interface osteocondral.
Esta propriedade modular é, portanto, uma vantagem fundamental sobre os hidrogéis a
granel para a construção de estruturas heterogêneas.
Outra superioridade dos andaimes de microgéis montados é que a embalagem de
microgéis cria naturalmente uma estrutura microporosa que é mais permissiva ao transporte
de massa, difusão molecular e capacidade de permeabilidade do que materiais a granel
[ 23,43,76,82,140,180]. Estudos descobriram que as células cultivadas em estruturas
microporosas tiveram maior sobrevivência e proliferação celular em comparação com
aquelas cultivadas em estruturas a granel [67]. Os vazios entre os microgéis também
fornecem maior oportunidade para as células
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TPT Nguyen et al.
migrar e espaço para as células proliferarem e depositarem ECM sem impedimento
de uma matriz existente [70,82,180]. Vários estudos observaram que as células
tendem a migrar do núcleo para a área externa dos microgéis [73,188] , o que
aumentará ainda mais a acessibilidade do espaço e dos nutrientes e pode contribuir
para indicações de que a formação de tecido cartilaginoso em estruturas de microgéis
montadas ocorre principalmente pela deposição de matriz cartilaginosa nos vazios
dentro dos microgéis montados [81]. Ao contrário desses andaimes microporosos, as
construções de hidrogel a granel em macroescala devem se degradar para dar esse
espaço.
4.1.3. Flexibilidade, cisalhamento e auto-reparação
A injeção de microgéis nos locais desejados pode ser realizada simplesmente
por meio de uma seringa manual. Durante o processo de injeção, a forma esférica
dos microgéis permite um fácil movimento das partículas umas sobre as outras, o
que pode ajudar em um processo de injeção suave e na capacidade de preencher
defeitos com formas irregulares. Em alguns casos, a presença de ligação não
covalente (ligação de hidrogênio, forças eletrostáticas) e ligação covalente entre
microgéis também pode ajudar a estabilizar os microgéis como um andaime de
ordem superior após a injeção [131] (veja mais na Seção 3.3 ) . A injetabilidade para
injetar células encapsuladas em microgéis pode ajudar a reduzir a força aplicada às
células durante o processo de injeção, aumentando assim a viabilidade celular [185].
A colocação guiada por imagens clínicas (por exemplo, TC) do aparelho de injeção
também pode ser realizada para a colocação precisa dos microgéis.
4.1.4. Microgéis para administração de células e
medicamentos Os microgéis possuem propriedades que os tornam superiores
em comparação com outros sistemas de hidrogel injetável em termos de administração
de células/medicamentos. A geometria em microescala facilita o aumento da
exposição a nutrientes do ambiente circundante, o que pode fornecer maior troca de
metabólitos em comparação com células incorporadas em um hidrogel a granel
altamente reticulado. Eles também podem ser mais favoráveis para a formação de
cartilagem articular, em comparação com hidrogéis volumosos; resultados da
morfologia do tecido, expressão gênica relacionada à cartilagem e níveis de deposição
de proteína cartilaginosa para microgéis carregados de células sugerem que eles
produzem mais tecido cartilaginoso do tipo hialino do que muitos sistemas de hidrogel
a granel nos quais um fenótipo mais fibrocartilaginoso é observado [39,137] . A
estrutura geral dos microgéis montados assemelha-se bastante à cartilagem articular
madura nativa, na qual as células estão alojadas em lacunas [39,81]; um estudo
também revelou que nenhum vaso sanguíneo se formou em microgéis montados in
vivo, enquanto alguma vascularização estava presente em construções paralelas de
hidrogel [81]. Em termos de análise molecular da condrogênese, as células
carregadas em microgéis não só produziram uma quantidade notável de colágeno
tipo II, como também depositaram uma quantidade elevada de outros componentes
da matriz da cartilagem.
Embora os hidrogéis a granel possam ser injetados antes da reticulação, também
pode haver algumas vantagens na capacidade de injetar microgéis pré-reticulados.
Esta injeção de microgéis pré-formados permite a entrega de construções pré-
diferenciadas ou pré-cultivadas, proporcionando uma oportunidade para iniciar a
formação de cartilagem antes da injeção. Por exemplo, microgéis carregados de
células mostraram resultados promissores quando cultivados in vitro com TGF-ÿ por
14 dias, antes de sua entrega no corpo [81]. Desta forma, os microgéis podem ser
injetados sem interromper as células encapsuladas e a formação de tecido nascente,
enquanto as células só podem ser incorporadas em hidrogéis a granel no ponto de
injeção. Os microgéis carregados de células também podem ter mais flexibilidade
para armazenamento a longo prazo do que os géis a granel carregados de células;
um estudo relatou que as MSCs carregadas por microgéis preservaram suas
funcionalidades de células-tronco após o processo de congelamento e
descongelamento, o que foi verificado pela análise de marcadores de diferenciação
osteogênica e condrogênica [136].
Além disso, os microgéis possuem maior ajuste, controle e flexibilidade do que
os géis a granel em termos de tamanhos, formas e composições. Com microgéis, é
possível construir estruturas de tecido de ordem superior com complexidade
estrutural, ou mesmo formação de gradiente, combinando microgéis de tamanho ou
composição variados, o que é um desafio quando se usa um sistema de hidrogel em
massa. Isto é particularmente relevante para a cartilagem
14
Biomateriais 279 (2021) 121214
regeneração, por exemplo, com quatro zonas distintas e interconectadas na
arquitetura nativa da cartilagem.
Os sistemas de microgel também são benéficos para aplicações de entrega de
drogas, por exemplo, com uma alta eficiência de carga devido à alta proporção entre
área de superfície e volume. Esta propriedade pode auxiliar na incorporação e entrega
de fatores de crescimento para promover a condrogênese. O formato modular dos
microgéis também oferece a capacidade de misturar e combinar diferentes
populações de microgéis em uma construção final, com oportunidades aprimoradas
de usar microgéis como transportadores para fornecer vários fatores de crescimento,
aumentando assim a flexibilidade e o controle para aprimorar a condrogênese. É
possível combinar espacialmente diferentes drogas/fatores de crescimento/células
em um único microgel ou mesmo usar microgéis variados para transportar
separadamente células e substâncias necessárias para as células, adaptando assim
diferentes perfis cinéticos de liberação [74] .
Possíveis limitações para o uso de microgéis para entrega de células/fármacos
podem ser a estabilidade mecânica reduzida de construções baseadas em microgéis
em comparação com hidrogéis a granel, especialmente nos estágios iniciais da
regeneração da cartilagem. A fabricação de microgéis também envolve mais etapas,
como fabricação de dispositivos microfluídicos, produção de microgéis e etapas de
lavagem, que requerem equipamentos específicos, bem como pessoal experiente.
Apesar do rápido surgimento de técnicas de fabricação de microgel e
microencapsulamento para regeneração de cartilagem, o campo ainda está em sua
infância e carece de procedimentos bem estabelecidos e referências padrão. Alguns
fenômenos observados com mecanismos desconhecidos que ainda não foram
explorados, como migração celular, deposição de matriz nos vazios entre microgéis
adjacentes e encolhimento do scaffold, permanecem desafios para estudos futuros.
Outro desafio para a encapsulação de microen é alcançar densidades celulares
consistentes e carga de droga em cada microgel. No entanto, com os rápidos avanços
feitos até hoje em microgéis, é provável que muitos desses problemas sejam
superados no futuro.
4.1.5. Avaliação in vivo de microgéis para regeneração de cartilagem
No geral, muitos modelos de defeitos diferentes foram usados para testes in vivo
de microgéis para reparo de cartilagem, desde uma simples injeção subcutânea
[67,73,81,82,88] até a injeção em defeitos de tamanho crítico, incluindo defeitos de
cartilagem troclear femoral de coelho [ 137], defeitos da cartilagem articular do joelho
de rato [140], um modelo de rato de lesão da placa de crescimento [89] e um modelo
de fenestração periodontal mandibular de rato [77]. É digno de nota que, após a
implantação in vivo, as células migram dos transportadores artificiais para a área do
defeito [73,81]. Durante o processo de injeção, a viabilidade das células nuas pode
ser dificultada pela exposição a altos níveis de estresse de cisalhamento fluídico, mas
acredita-se que o encapsulamento em microgéis oferece proteção física à célula
encapsulada, resultando em alta viabilidade celular após a implantação. A otimização
das condições de injeção, como taxa de fluxo, também pode ajudar a eliminar a
pressão fluídica aplicada às células para alcançar alta sobrevivência celular.
O sucesso das técnicas baseadas em microgel para regenerar a cartilagem
articular in vivo foi testado, com a determinação do sucesso avaliada em estágios
relativamente iniciais de 2 semanas [89], 7 semanas [81] e 8 semanas [73], bem
como em um estudo que reteve amostras aos 6 meses [137] (Fig. 6). Uma abordagem
encapsulava condrócitos articulares ou células-tronco derivadas de tecido adiposo
dentro de partículas derivadas de matriz extracelular de cartilagem (CEMPs) e as
implantava em um defeito osteocondral em um modelo de coelho. Cartilagem hialina
formada em defeitos tratados com microtecidos carregados de células, enquanto os
locais de defeitos tratados com amostras de controle de fibrina, ou CEMPs sem
células, formaram cartilagem fibrosa (Fig. 6A) [137]. A ressonância magnética (MRI)
da cartilagem recém-formada forneceu resultados consistentes com os da análise
de coloração histológica e observação macroscópica. A formação de cartilagem
ectópica após injeção subcutânea de microgéis carregados com BMSC em
camundongos nus também foi avaliada. Os microgéis carregados de BMSC inibem a
vascularização e a hipertrofia e, assim, facilitam o reparo da cartilagem (Fig. 6B)
[73]. Os microgéis montados com NHS (NHSA) carregados com hCCs [81] foram pré-
induzidos à condrogênese por 2 semanas antes da injeção em um modelo de
camundongo. Após 7 semanas, os microgéis NHSA exibiram melhor
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Fig. 6. Estudos iniciais in vivo usando microgéis carregados de células para reparo de cartilagem. (A) Morfologia bruta dos tecidos formados após o tratamento com implantes projetados (onde
as abreviaturas para CEDP, AC e ASC são partículas derivadas da matriz extracelular de cartilagem (ECM), condrócitos articulares e células-tronco derivadas de tecido adiposo, respectivamente).
(B) Morfologia e resistência mecânica de microgéis carregados de BMSC após implantação no camundongo e avaliação de marcadores de vascularização e hipertrofia em tecidos reparados. (C)
Análise histológica de hidrogéis a granel carregados de hCC (células condroprogenitoras fetais humanas) injetados subcutaneamente e microgéis de NHSA em camundongos 49 dias após a
injeção. (D) Morfologia bruta e histologia da área de defeito da cartilagem preenchida com microtecido formado usando BMSCs encapsuladas em microgel 12 semanas após a implantação em
rato. (Painel (A) adaptado da Ref. [137] com permissão da Elsevier; Painel (B) adaptado da Ref. [73] com permissão de John Wiley & Sons; Painel (C) adaptado da Ref. [81] com permissão de
Royal Society of Chemistry; Painel (D) adaptado da Ref. [140] com permissão da American Chemical Society).

formação de tecido de cartilagem em termos de morfologia e propriedades mecânicas do
que nos hidrogéis a granel (Fig. 6C) [81]. Outro estudo in vivo fabricou microesferas
nanofibrosas carregando BMSCs para produzir microtecidos funcionais semelhantes a
cartilagem, que foram então implantados em um defeito de tamanho crítico em ratos. A
morfologia e a coloração histológica do tecido formado mostraram condrogênese positiva
e efeitos cicatrizantes (Fig. 6D) [140]. Neste estudo, as células foram marcadas com
proteína fluorescente verde que permitiu o seu rastreamento pós-implantação, fornecendo
informações sobre a distribuição celular e a remodelação tecidual.
Ao examinar a função da articulação, a análise da intensidade da pegada 3D da marcha
mostrou melhor desempenho do grupo de joelho tratado com microtecido em comparação
com os outros dois grupos. As propriedades biomecânicas são fatores importantes na
avaliação da qualidade do reparo do tecido cartilaginoso por causa de suas funções de
sustentação de peso e absorção de choque. A formação da matriz cartilaginosa resulta
em um aumento do módulo de elasticidade dos andaimes, que pode ser medido pelo
teste de nanoindentação [81,137,194]. No entanto, deve-se notar que, embora um
progresso notável tenha sido feito na avaliação dos resultados por meio da análise das
características morfológicas, mecânicas e bioquímicas da cartilagem regenerada, existem
poucos estudos publicados até o momento que incluem a análise funcional da cartilagem
manipulada, conforme é relevante para desempenho do lubrificante, desempenho de
absorção de choque, etc. No futuro, estudos devem ser realizados para estabelecer
referências para o exame de cartilagem engenheirada, que auxiliarão neste tratamento
promissor
chegar à tradução clínica.
Juntos, esses estudos suportam fortemente o potencial de microgéis carregados de
células serem usados como blocos de construção para construir tecido de cartilagem.
Embora a maior parte do trabalho atual ainda esteja em um estágio de prova de conceito,
dados preliminares in vitro e in vivo confirmaram o potencial significativo das estratégias
de montagem de microgéis carregados de células para melhorar a função do tecido
manipulado. Espera-se que estudos adicionais de montagem de microgéis carregados
de células continuem nos próximos anos e tenham como alvo diferentes defeitos de
tecidos, além de explorar potenciais translacionais.
4.2. Potenciais desafios e abordagens para ampliar, fabricar e esterilizar microgéis
para aplicação clínica
Embora os microgéis carregados de células injetáveis tenham mostrado uma grande
promessa para a regeneração da cartilagem em estudos laboratoriais e pré-clínicos,
ainda há muitos desafios antes que possam ser traduzidos funcionalmente para a clínica,
alguns dos quais são aplicáveis à engenharia de tecidos de forma mais ampla e alguns
específico para tecnologias de microgel [195,196]. Em primeiro lugar, a falta de mão de
obra com habilidades especializadas que serão necessárias para cada etapa, desde a
pesquisa até a tradução, comercialização, fabricação de tecidos modificados, bem como
a entrega do produto final ou terapia ao paciente, é uma barreira [196] . Em segundo
lugar, em termos de políticas regulatórias, a engenharia de tecidos é definida como a
combinação complexa de

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produtos farmacêuticos, dispositivos ou serviços médicos, bem como células humanas,
tecidos ou produtos celulares ou baseados em tecidos (HCT/Ps), quando células
humanas estão envolvidas ( https://www.fda.gov/vaccines-blood- biológicos/tecido-tecido-
produtos). Portanto, cada produto de tecido manipulado pode seguir um caminho
regulatório diferente, que depende de quais componentes estão incluídos, tornando
mais demorado obter aprovações.
Os regulamentos também variam entre os países; assim, é crucial implementar uma
regulamentação padrão consistente para produtos à base de tecido que permita que
eles sejam comercializados legalmente nos mercados globais. Por fim, mais esforços
devem ser feitos para o desenvolvimento da infraestrutura de fabricação, porque o
trabalho baseado em células deve ser realizado em instalações de salas limpas
de acordo com as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação (GMP).
Relevante para a necessidade de produção em larga escala de microgéis
encapsulados em células, um enorme desafio permanece se a escala exigida pelo
tratamento clínico for atendida. Esta questão de aumento de escala abrange métodos
de fabricação, biomateriais, esterilização, avaliação de segurança, recursos e custos.
Entre as muitas abordagens de fabricação que têm sido usadas para gerar microgéis,
as técnicas microfluídicas baseadas em gotículas são as mais comumente usadas
devido a características como uniformidade, maneira de alto rendimento e custo-
benefício [40,73,76,77,84,121,127,128,180,185] .
Do ponto de vista da fabricação, as técnicas microfluídicas baseadas em gotículas
podem garantir a uniformidade entre lotes, o que frequentemente é limitado em outras
abordagens, como emulsão e extrusão [180]. Além disso, pelo design adequado dos
microcanais dos dispositivos microfluídicos, os microgéis gerados são uniformizados
em termos de tamanho e forma, podendo até incorporar propriedades multicompartimentais
que permitem que multiterapêuticos sejam carregados simultaneamente com controle
espaço-temporal. Este método também é adequado para uma ampla gama de materiais
de hidrogel e estratégias de reticulação. Além disso, há um pequeno volume de material
necessário que é benéfico para a produção em larga escala de terapêuticas caras
[77,127]. Na prática, a entrega de microgéis transportando agentes terapêuticos e/ou
células em pacientes provavelmente seria realizada em hospitais onde a disponibilidade
de equipamentos de microfluidos provavelmente não seria alcançada. Nesse caso, a
criopreservação pode ser uma opção potencial para o armazenamento a longo prazo
de tecidos manipulados. Um estudo investigou a manutenção das funcionalidades das
células-tronco de hMSCs carregadas em microgéis após congelamento e
descongelamento. É promissor observar que as hMSCs descongeladas mantiveram alta
viabilidade celular e células-tronco, como diferenciação osteogênica e condrogênica
[136].
A escolha dos biomateriais também é crítica na produção de microgel.
No entanto, para utilização futura de microgéis em cenários clínicos, há poucos
biomateriais disponíveis aprovados para uso em tratamentos clínicos. Além disso, a
esterilização biocompatível também é um pré-requisito que deve ser atendido durante a
fabricação e armazenamento de microesferas carregadas de células, ou seja, o produto
de microgel deve estar livre de contaminantes biológicos e químicos, enquanto a
viabilidade e as funcionalidades celulares são preservadas. Vários métodos, como luz
ultravioleta e autoclavagem, podem ser utilizados para esterilizar os biomateriais,
microdispositivos e outras ferramentas usadas para a produção do microgel antes do
carregamento das células, bem como fatores condroindutores. No entanto, esses
métodos de esterilização só podem ser usados para descontaminação antes da
microencapsulação porque as células e compostos bioativos serão danificados pelo
calor ou UV. Para evitar a contaminação durante a fabricação do microgel, o processo
de produção deve ser realizado em laboratórios apropriados com contenção física de
alto nível de acordo com as diretrizes GMP. À medida que as terapias celulares surgem,
o progresso está sendo feito nessas questões, com um número crescente de terapias
baseadas em células-tronco para o reparo da cartilagem sendo exploradas e abertas
para ensaios clínicos anualmente com resultados promissores [197, 198 ] . A iniciativa
de regeneração de tecidos em rápida expansão indica fortemente que recursos mais
sustentáveis devem ser alocados com sabedoria em seções específicas, como
fabricação em escala, treinamento de médicos e marketing estratégico dos produtos,
para superar os atrasos atuais na entrega de novas terapias aos pacientes [196,199] .
Outra preocupação ou desafio no uso de células-tronco para terapia de regeneração
de cartilagem é a aplicação de fatores condroindutores para
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Biomateriais 279 (2021) 121214
condrogênese in vivo. Microgéis carregados com GFs podem ser um sistema de
entrega ideal para entregar células-tronco e GFs para induzir a diferenciação após a
implantação [79,173]. É assim desejável desenvolver estratégias para incorporar os
GFs diretamente nos microgéis carregados de células, tornando-os menos dependentes
de GFs externos, suplementados por exemplo via meio de cultura celular. O
encapsulamento ou amarração de GFs à matriz de microgel também pode ajudar a
protegê-los da degradação rápida, um problema comum de fornecimento de GF. Em
resumo, muitos desafios permanecem, principalmente em relação a como obter carga
altamente eficiente e liberação sustentada de GFs. Durante o aumento de escala e a
fabricação, a fonte e o armazenamento dos microgéis carregados com fator de
crescimento e células devem ser otimizados.
5. Direções futuras
5.1. bioimpressão 3D
5.1.1. O uso de microgéis como biotinta para impressão 3D Os
tecidos vivos são arquiteturas complexas e heterogêneas, compostas por blocos de
construção de tamanhos variados organizados hierarquicamente para obter propriedades
multifuncionais [136,165,179]. A impressão 3D tem sido cada vez mais utilizada na
engenharia de tecidos devido à sua capacidade de criar andaimes tridimensionais bem
definidos para imitar tecidos nativos [128, 185], e a escolha da biotinta desempenha um
papel crítico em que propriedades físicas, printabilidade e propriedades biológicas todos
devem ser equilibrados [200]. Os hidrogéis estão sendo amplamente empregados como
biotintas na impressão 3D devido às suas características ajustáveis e injetáveis, mas
estudos recentes também testaram o potencial de aplicação de microgéis para impressão
3D [200].
Estudos pioneiros empregaram uma biotinta complexa que é composta de microgéis
carregados de células misturados em um macrogel injetável para construir um único
andaime 3D onde a integração do ambiente micro e macro foi realizada
[128,131,136,165,185,201,202] . Os processos de impressão conseguiram obter
organização espacial e hierarquia 3D por meio da montagem direcionada de unidades
de microgel (Fig. 7A). Espera-se que esses andaimes abram a capacidade de controlar
os comportamentos de liberação e degradação de componentes independentes dentro
de uma construção em macroescala. Em um estudo, microgéis de PEGDA carregados
com MSC foram suspensos em uma variedade de soluções de pré-polímeros, gerando
muitas biotintas distintas como resultado das diferentes estratégias de reticulação
aplicadas. Essas estratégias são vantajosas para a geração de diversos tecidos (Fig.
7B) [201]. Em outro estudo, um conjunto diversificado de biotintas foi criado pela mistura
de microgéis de diferentes composições e obteve fluxo suave e alta estabilidade após a
deposição. Juntos, eles exemplificam a promessa de combinar microgéis de diferentes
composições e métodos de reticulação partícula-partícula para criar uma estrutura
impressa de ordem superior (Fig. 7C) [202].
Exemplos de sucesso na impressão de microgéis incluem bioimpressão de microgéis
de alginato metacrilado oxidado (OMA), microgéis clicáveis de PEG e um sistema
GelMA [128,136,203]. Desses estudos, há o uso de microgéis carregados de células
descongeladas como biotinta para impressão (Fig. 7D)
[203]. Vários andaimes impressos foram criados onde as células-tronco carregadas
mostraram grande diferenciação em tecidos osteogênicos ou condrogênicos [136].
Recentemente, uma interessante impressão gel-em-gel foi relatada, onde a biotinta foi
extrudada do bocal de impressão para um banho de suporte de hidrogel. Este método
ajudou a reter o complexo 3D de construções formadas, que poderia ser usado como
uma alternativa à superfície de suporte 2D usada na impressão convencional. Em
termos de suporte físico, os compósitos de microgel funcionam como bases robustas
de hidrogel, onde a biotinta pode ser impressa com menos gravidade e tensão em
comparação com os hidrogéis a granel [204,205].
Em resumo, a versatilidade dos microgéis na impressão 3D está apenas começando
a surgir. Os microgéis impressos podem ter vantagens em relação às tintas de hidrogel
impressas convencionalmente, pois podem fornecer às biotintas alta complexidade,
estabilidade e recursos de diluição por cisalhamento. Além disso, seu uso potencial
como suporte de hidrogel em bioimpressão também é uma característica interessante
que deve ser explorada.
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Fig. 7. Várias estratégias para aplicações expandidas de novas biotintas para impressão 3D. (A) Esquemas das estratégias atuais para o desenvolvimento de biotintas modulares
baseadas em microgéis: (a) Biotinta feita de microgéis carregados de células com hidrogéis injetáveis (b) Biotinta criada a partir de microgéis carregados de células que são unidos. (B)
A geração de andaimes de tecido contém microgéis de PEGDA (poli(etileno glicol) diacrilato) como blocos de construção modulares que se misturam em vários macrogéis pelo uso
de técnicas convencionais de biofabricação. (C) Formação de biotinta pela montagem de microgéis emperrados. (D) Fabricação de construções impressas em 3D usando biotintas
à base de microgel. (a) Biotinta feita de microgéis carregados de células OMA (alginato metacrilado e oxidado) extrudados de bicos de vários tamanhos e (b-f) várias construções
impressas em 3D fabricadas a partir da biotinta introduzida. (Painel B adaptado da Ref. [201] com permissão de John Wiley & Sons; Painel C adaptado da Ref. [202] com permissão
de John Wiley & Sons; Painel D adaptado da Ref. [203] com permissão de Sociedade Real de Química).

5.1.2. Encolhimento do tecido de cartilagem manipulado construído a partir de a fabricação deve se concentrar na seleção e desenvolvimento de biomateriais que
microgéis exibem taxas de biodegradação adequadas para garantir que a estabilidade geral dos
carregados de células in vivo O uso potencial de microgéis carregados de células andaimes seja suficiente para manter sua arquitetura física de suporte mecânico
para reparo de cartilagem foi adequadamente comprovado, com resultados durante a formação da cartilagem.
promissores, em particular com base em estudos in vivo , conforme discutido nas
seções anteriores. No entanto, um desafio chave permanece em que há mudanças
5.2. co-cultura
notáveis na morfologia de construções baseadas em microgel pós-implantação [206].
Os primeiros estudos descobriram que as células carregadas com microgel sofreram
encolhimento algumas semanas após a implantação em modelos animais. Os Além de usar tipos de células únicas, tem havido uma série de estudos
autores levantaram a hipótese de que esse fenômeno não poderia ser uma investigando sistemas de co-cultura para superar as limitações das monoculturas,
consequência combinada do aumento da retração celular ou condensação durante a como perda de potencial condrogênico pós-expansão 2D e formação de cartilagem
hipertrófica
formação precoce da cartilagem e degradação progressiva do bioscaffold [81]. Estudos futuros comocarregados
em microgéis um ponto final da diferenciação de células-tronco. Apesar de não
de células
envolver microgéis, vários co-cultivos

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sistemas contendo condrócitos articulares e MSCs demonstraram um potencial
promissor para a engenharia de tecidos de cartilagem [118,141,207]. O principal
papel das MSCs em tais culturas parece ser a promoção da proliferação de
condrócitos [208] e produção de matriz cartilaginosa, enquanto os condrócitos
protegem as MSCs diferenciadas da hipertrofia [209]. Existem várias maneiras
de realizar co-cultura na plataforma de microgel. Pode ser uma co-cultura de
microgéis contendo diferentes tipos de células ou mesmo uma co-cultura de
diferentes tipos de células em um único microgel. Para expandir essa estratégia,
uma sugestão é gerar microgéis núcleo-concha onde cada tipo de célula
coabitante é encapsulado em uma parte separada da estrutura geral do microgel,
permitindo a imitação da estrutura hierárquica do tecido cartilaginoso. Vale
ressaltar que algumas coculturas usando microesferas para regeneração óssea
foram publicadas com resultados promissores. A co-encapsulação de MSCs e
células endoteliais em cápsulas liquefeitas contendo partículas sólidas para
suportar a adesão celular também promoveu a formação de tecidos
mineralizados, potencialmente aplicáveis na regeneração óssea e outros tecidos
complexos [162] .
6. Resumo
Os microgéis carregados de células possuem alta versatilidade, modularidade
e ajuste, tornando-os uma tecnologia promissora em muitas aplicações em
engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Devido à sua geometria
microesférica única, os microgéis facilitam as atividades celulares dinâmicas
com interações célula-célula e célula-material aprimoradas. Além disso, os
microgéis podem servir como blocos de construção modulares para construir
estruturas de tecidos maiores e altamente complexas. Em particular, os
microgéis podem ser fabricados e montados com geometrias definidas, permitindo
a integração espacial de vários tipos de células e fatores bioativos. Tecidos de
engenharia microporosa resultantes da montagem de microgéis também
facilitam a transferência eficiente de oxigênio/nutrientes, minimizando assim a
morte celular indesejável. Descobertas recentes também demonstram que as
biotintas à base de microgel podem ser usadas na impressão 3D, aumentando
ainda mais as perspectivas para a criação de tecidos biomiméticos altamente complexos.
Em particular, os microgéis carregados de células mostraram grande
potencial para a engenharia de tecidos da cartilagem articular. Dados promissores
de estudos in vitro e in vivo demonstram que a aplicação de microgéis aumenta
a qualidade da cartilagem de engenharia de tecidos em comparação com os
hidrogéis a granel convencionais. Avanços adicionais nas técnicas de fabricação
de microgéis, bem como o controle da diferenciação condrogênica e da entrega
de biomoléculas, juntamente com as oportunidades oferecidas pela bioimpressão,
ilustram que a tecnologia de microgéis é um campo empolgante a ser observado.
Com trabalho adicional de desenvolvimento e translação e ensaios pré-clínicos
e clínicos bem desenhados, a aplicação de microgéis tem o potencial de
transformar futuras terapias no campo do reparo e regeneração da cartilagem.
Declaração de interesse concorrente
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes
conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam parecer influenciar o
trabalho relatado neste artigo.
Agradecimentos
O TPTN foi financiado pela Monash Graduate Scholarship, Monash
International Tuition Scholarship e CSIRO Top-up Scholarship. As imagens
gráficas neste trabalho são criadas com BioRender.com.
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