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Polímeros de carboidratos 251 (2021) 117035

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Polímeros de carboidratos

página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/carbpol

Microambientes celulares projetados a partir de nanotubos de carbono de paredes

múltiplas funcionalizados integrando Zeína/Quitosana @Poliuretano para
regeneração de células ósseas

Sita Shrestha a , Bishnu Kumar Shresthaa , *, Sung Won Ko a

, Rupesh Kandel
a
, Parque Chan Hee a, b, *,
Cheol Sang Kim a, b, *
a
Departamento de Engenharia de Bionanossistemas, Escola de Pós-Graduação, Universidade Nacional de Jeonbuk, Jeonju 561-756, República da Coreia
b
Divisão de Engenharia de Projeto Mecânico, Universidade Nacional de Jeonbuk, Jeonju 561-756, República da Coreia

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: Abordagens baseadas na biomimética, especialmente com andaimes artificiais, estabeleceram um grande potencial para fornecer
Quitosana
capacidade de regeneração de tecidos e uma forma eficaz de preencher a lacuna entre as respostas das células hospedeiras e as
Andaime fibroso
demandas dos órgãos. Porém, a síntese do biomaterial é mais eficiente quando o comportamento funcional envolvido mais se
Antibacteriano
assemelha à matriz extracelular natural. Aqui, uma estrutura fibrosa foi projetada integrando zeína e quitosana (CS) em poliuretano
Biomineralização
Osteocondutor (PU) associado a nanotubos de carbono de paredes múltiplas funcionalizados (fMWCNTs) como material de reparo de células ósseas.
Pré-osteoblasto A estrutura de engenharia de tecidos à base de quitosana contendo 0,1 mg/mL de fMWCNTs mostra resultados sinérgicos potentes
onde melhor resistência biomecânica, hidrofilicidade e eficácia antibacteriana produzem uma estrutura semelhante a uma matriz
extracelular verdadeiramente natural encontrada nos microambientes das células ósseas.
A estrutura permite a comunicação rápida célula a célula através de uma biointerface e promove grandemente o efeito regenerativo
do pré-osteoblasto (MC3T3-E1), que se reflete em termos de crescimento, proliferação e diferenciação celular em nosso organismo.
experimentos in vitro. A análise da coloração vermelha de alizarina, a atividade da fosfatase alcalina e o Western blotting também
confirmam a nucleação de nanocristais de hidroxiapatita (HA) e a expressão de marcadores proteicos osteogênicos, os quais indicam
as excelentes propriedades osteoindutoras do andaime. Estes resultados sugerem que esta estrutura fibrosa PU / Zein / CS-fMWCNTs
projetada com precisão possui comportamento biológico adequado para atuar como uma matriz extracelular óssea artificial que
garantirá a regeneração das células ósseas, ao mesmo tempo que contribui com numerosos benefícios para o campo dos enxertos
ósseos artificiais.

1. Introdução bioandaimes específicos de células exibem propriedades de biodegradabilidade,

O surgimento de estruturas de engenharia de tecidos como bioimplantes marca uma
nova era na engenharia de tecidos que permite a regeneração de tecidos e a restauração
de funções orgânicas no lugar do autoenxerto e aloenxerto convencional (McDermott et
al., 2019; Shrestha, Shrestha, Baral et al . ., 2019). A implantação de órgãos biomiméticos
na engenharia de tecidos ósseos é uma opção tomada para funcionalizar ou reparar
danos às células ósseas causados por trauma, lesão ou doença. Para atender à crescente
necessidade de enxertos e substitutos ósseos artificiais, espera-se que o mercado invista
US$ 3.912 milhões até 2025, de acordo com a Análise de Oportunidades Globais e
Previsão da Indústria, 2018-2025. Os pesquisadores estão se concentrando no
desenvolvimento de substituintes ósseos, que através de seu comportamento osteogênico
e osteoindutor atuam para promover a reparação ou cura óssea. Osso
osteoindutividade, porosidade para vascularização e inércia imunológica que imitam o
microambiente de uma matriz extracelular óssea natural e comportamento osteointegrativo
com células ósseas (Jahan, Mekhail, & Tabrizian, 2019; Lee , Shrestha , Shrestha, Park
e Kim, 2020; Martine et al., 2017). Várias técnicas têm sido empregadas para desenvolver
estruturas nano/microestruturadas de estruturas porosas que podem promover a
regeneração das células ósseas e o reparo ósseo através da comunicação célula a célula
entre as células ósseas hospedeiras e a matriz da estrutura (Suvarnapathaki, Wu,
Lantigua, Nguyen, & Camci-Unal, 2019; B. Zhang, Skelly, Maalouf, Ayers e Song, 2019).
Recentemente, andaimes eletrofiados foram preparados utilizando materiais bioativos
que incluem fatores de crescimento biológicos, estes tiveram maior influência no
fornecimento de oxigênio, difusão de nutrientes e

* Autores correspondentes em: Departamento de Engenharia de Bionanossistemas, Escola de Pós-Graduação, Universidade Nacional de Jeonbuk, Jeonju 561-756, República da Coreia.
Endereços de e-mail: bishnuaampipal@hotmail.com (BK Shrestha), biochan@jbnu.ac.kr (CH Park), chskim@jbnu.ac.kr (CS Kim).

https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2020.117035 Recebido
em 29 de fevereiro de 2020; Recebido de forma revisada em 20 de agosto de 2020; Aceito em 30 de agosto de 2020.
Disponível online em 3 de setembro de 2020
0144-8617/© 2020 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.
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S. Shrestha et al.
o fornecimento de um ambiente osteogênico com porosidade apropriada e
fortes propriedades biomecânicas (Balagangadharan, Trivedi, Vair-amani, &
Selvamurugan, 2019). Um grande número de polímeros sintéticos e naturais,
tipicamente policaprolactona (PCL), poliuretano (PU), poli-acrilonitrila, poli
(ácido L-láctico (PLLA)), quitosana, gelatina, celulose e seda foram estudados
como eletrofiação de interface celular. andaimes para regeneração do tecido
ósseo (Shrestha, Shrestha, Lee et al., 2019; Zhang et al., 2018). Esses modelos
ósseos de engenharia de tecidos imitam fielmente a matriz extracelular nativa
na interface tecido-implante. Porém, para obter melhores resultados in vitro e in
vivo, ainda existem mais desafios a enfrentar, devido à sua baixa resistência
mecânica, instabilidade química e alta impedância à transferência de íons
durante atividades metabólicas. Assim, materiais híbridos micro/nanofibrilares
sofisticados são a escolha que pode reparar perfeitamente danos ósseos ou
curar permanentemente as deficiências de pacientes que sofrem de defeitos
ósseos. O uso apenas de poliuretano na fabricação de andaimes dá origem a
grandes limitações associadas à sua lenta degradação, sendo facilmente
afetado por bactérias e vírus, e à sua hidrofobicidade que dificulta as interações
célula-interface. No entanto, o seu elevado módulo de elasticidade e
biocompatibilidade são propriedades intrínsecas que muitas vezes o tornam
uma base adequada para o desenvolvimento de biomateriais de tecidos duros.
Assim, a modificação de superfície e os recombinantes multifuncionais são a
melhor abordagem para aumentar o sucesso de aplicações biomédicas para
materiais biomiméticos (Guan, Fujimoto, Sacks, & Wagner, 2005; Shrestha et
al., 2017). Em nosso estudo anterior, um biomaterial fibroso de quitosana/
poliamida forneceu microambientes celulares apropriados que contribuíram
para a regulação das atividades das células ósseas (BK Shrestha, Mousa et al.,
2016). Os grupos polares na quitosana reticulam-se através de grupos hidroxila
ou amina na cadeia de poliamida e melhoram o comportamento biológico do
material híbrido. É importante ressaltar que o grande número de grupos
quelantes na quitosana mostra uma capacidade de nuclear a maioria das
matrizes da MEC óssea, por exemplo, Ca2+, Mg2+, Zn2+ e proteínas, essas
matrizes são responsáveis por induzir a diferenciação de células ósseas e a reparação óssea.
Os polissacarídeos são biomateriais altamente apropriados que podem
responder facilmente ao tecido ósseo. A quitosana, um polissacarídeo natural,
possui certas propriedades essenciais (por exemplo, sua capacidade de
formação de gel, porosidade, osteoindutividade e biodegradabilidade) que
auxiliam a capacidade regenerativa das células ósseas para acelerar o reparo
'
do tecido ósseo através da diferenciação osteoblástica (Pella et al. , 2018).
Durante a última década, fatores de crescimento ósseo, incluindo osteocalcina,
proteína morfogenética óssea, colágeno tipo I e sialoproteína óssea (BSP, I/II),
IGF-1 e IGF-II, foram todos empregados em tecido ósseo modificado para
induzir reparação óssea (Deepthi, Nivedhitha Sundaram, Deepti Kadavan, &
Jayakumar, 2016; Solheim, 1998). No entanto, existe um elevado fardo
económico com estes crescimentos e torna-os apenas um recurso limitado no desenvolvimento de andaimes sintéticos.
Em contraste com isso, a zeína (proteína de milho contendo peptídeo
poliglutamina) mostrou propriedades promissoras para promover a diferenciação
de células ósseas e como nanocarreador na aplicação de entrega de
medicamentos, em vez de usar proteínas naturais de crescimento ósseo (Yue
Zhang, Li, Lan, & Wang, 2017 ). Esta proteína natural apresenta capacidade
antioxidante e antibacteriana e forma ligações covalentes e eletrovalentes com
a hidroxiapatita, ao mesmo tempo que atua como material osteoindutor (Ru et
al., 2018). Notavelmente, a glutamina na zeína induz o sistema imunológico a
apoiar o crescimento de linfócitos nas atividades mitogênicas, é também uma
fonte de nitrogênio para a síntese de purinas e pirimidinas, que é essencial para
a síntese de DNA e RNA na atividade celular (Newsholme & Calder, 1997; Szondy & Newsholme,
Os andaimes baseados em Zein exibem uma arquitetura porosa com redes
interconectadas; tal estrutura auxilia a infiltração, migração e proliferação de
células. Por exemplo, as estruturas porosas de zeína/PCL preparadas por F.
Wu et al. demonstraram fornecer osteoindutividade (Wu, Wei, Liu, O'Neill, &
Ngothai, 2012). Espera-se que a demanda por tais andaimes bioativos
inteligentes aumente devido à sua maior eficiência quando se trata de
citocompatibilidade da interface celular. Além disso, nanotubos de carbono de
paredes múltiplas (MWCNTs), um material nanoestruturado funcionalizado
com diferentes porções orgânicas/inorgânicas como peptídeos, hidroxila, sulfeto
e grupos carboxílicos, podem efetivamente estimular moléculas biológicas e
têm sido usados na preparação de andaimes para ossos.
Polímeros de carboidratos 251 (2021) 117035
crescimento celular, bem como prevenir a reabsorção óssea (Hirata et al., 2011;
Li et al., 2012). A nanoestrutura semelhante a fractal da incorporação de CNTs
em andaimes aumenta sua condutividade elétrica, resistência mecânica e
hidrofilicidade para melhorar a bioatividade dos andaimes (Yu, Files, Arepalli, &
Ruoff, 2000). Foi demonstrado que o uso de MWCNTs nas estruturas inibe a
reabsorção óssea dos osteoclastos in vivo, sugerindo que os MWCNTs têm
efeitos positivos no crescimento das células ósseas (Narita et al., 2009).
Assim, os andaimes nanoestruturados baseados em fMWCNTs são projetados
para melhorar as propriedades biológicas e se assemelhar à MEC óssea nativa
como um nicho regenerativo de células-tronco, fornecendo porosidade adequada
e uma grande relação superfície-volume para adsorver fatores de crescimento
ósseo. Consequentemente, o andaime atua como uma plataforma de regeneração
de tecidos e permitiu a utilização de uma nova metodologia em bioengenharia.
Neste trabalho, projetamos cuidadosamente um novo biomaterial compósito
(PU/Zein/CS-fMWCNTs) baseado em polissacarídeo e proteína que foi feito
usando uma técnica de eletrofiação. Esta abordagem permite a fabricação de
uma estrutura fibrosa para aplicações de engenharia de tecido ósseo.
As propriedades físico-químicas e bioativas do biomaterial são melhoradas
ainda mais com a integração de MWCNTs modificados na superfície, que são
propriedades essenciais para interações células-estrutura bem-sucedidas,
incluindo a difusão de nutrientes, fixação celular, proliferação e diferenciação.
In vitro, um estudo de células pré-osteoblastos (MC3T3E1) e aumento da
expressão de marcadores osteoindutores (proteínas) confirmam o excelente
comportamento osteointegrativo da estrutura. Acreditamos que a estrutura
preparada poderia servir como um biomaterial útil que se assemelha à MEC
óssea para estimular os osteoblastos e, posteriormente, pode ajudar a induzir a
regeneração óssea e a formação de novo osso.
2. Materiais e métodos
2.1. Materiais
Quitosana (peso molecular médio, desacetilação (75-85)%), Zeína (de
milho) e ácido trifluoroacético (TFA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical
Co., EUA. Grânulos de poliuretano (Lubrizol Advanced Materials, Inc., EUA)
foram utilizados conforme obtidos. MWCNTs (ca. 10, 85 nm de diâmetro
externo) foram adquiridos da Nanosolution Co. Ltd., Coreia do Sul, e a parede
superficial dos MWCNTs foi funcionalizada com grupo carboxílico. (BK Shrestha,
Ahmad et al., 2016), mas não houve mudanças notáveis no diâmetro externo (ÿ
9,47 nm) dos fMWCNTs em comparação com os MWCNTs imaculados (Fig.S1
de informações suplementares (SI). Todos os produtos químicos e materiais
eram de análise grau e foram usados sem purificação adicional.
2.2. Fabricação de andaime fibroso
Membranas eletrofiadas com vários componentes foram preparadas usando
eletrofiação. Os fMWCNTs (0,1 mg/mL) em concentrações otimizadas com
base na resistência mecânica e morfologia das nanofibras foram dispersos em
TFA por 30 min, seguido pela adição de quitosana e zeína sob agitação
constante por 3 h. O TFA como um novo solvente apresenta grandes vantagens
por ser capaz de dissolver substratos/polímeros orgânicos, atuar como um
catalisador ácido e promover a formação de ligações peptídicas. Após a
1989). da quitosana e da zeína, foi adicionado PU (a 4,0% em
dissolução completa
peso) e a mistura foi novamente agitada durante 12 h para produzir uma solução
fina por eletrofiação. Antes da eletrofiação, otimizamos a porcentagem em peso
de quitosana (1,0% em peso) e zeína (1,5% em peso) com base em solução
fiável para fabricar diâmetro relativamente uniforme e nanofibras eletrofiadas
sem esferas com redes porosas. A estrutura fibrosa eletrofiada de PU/Zein/CS-
fMWCNTs foi fabricada sob potencial de circuito aberto (OCP) a 18 kV com
taxa de alimentação de 1,0 mL/h. Uma técnica semelhante foi empregada para
preparar os outros andaimes eletrofiados (por exemplo, PU puro e PU/Zein/
CS). Os andaimes fibrosos preparados foram secos a vácuo por 24 horas a 40
ÿ, e suas características físico-químicas e biológicas foram então estudadas.
2
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S. Shrestha et al.
2.3. Caracterização
2.3.1. Caracterização físico-química e morfológica
Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (FE-SEM, Carl Zeiss
Supra-40 VP Alemanha, no Centro de Instalações de Pesquisa Universitária (CURF)
da Universidade Nacional de Chonbuk, Jeonju Coreia do Sul) foi usada para observar a
morfologia do como - andaimes nanofibrosos fabricados. Microscopia eletrônica de
transmissão de alta resolução (HR-TEM, JEM-JEO (2010 Japão, a 200 kV) e TEM de
varredura corrigida por Cs (Cs-STEM; JEOL/JEM-ARM, 200 F) foi usada para estudar
a morfologia de os fMWCNTs, MWCNTs puros e nanofibra PU/Zein/CS-fMWCNTs.
A cristalinidade de cada material também foi examinada usando difração de raios X
(XRD, Rigaku Japão) com um alvo de Cu em um comprimento de onda (ÿ) de 0,154 nm
com uma faixa de 2ÿ de (10 – 90) ÿ a uma taxa de varredura de 5 ÿ /min. Os espectros
infravermelhos de transmissão de Fourier (FT-IR) do material puro e compósito foram
medidos pelo espectrômetro FT-IR (Perkin Elmer Spectrum GX, EUA). As propriedades
típicas de tensão/deformação dos diferentes andaimes fibrosos (de formato padrão de
osso de cachorro) foram avaliadas usando uma máquina de teste universal (MTDI Inc.
Korea). A molhabilidade dos andaimes fibrosos foi medida no NTP. A análise
termogravimétrica (TGA) foi conduzida com TA Instruments (Coréia). Além disso, foram
medidas a condutância e a viscosidade das soluções fiáveis de vários componentes.
2.3.2. Análise de biodegradação in vitro A
capacidade de degradação de diferentes amostras de igual massa (25 mg, n = 3)
foi avaliada em solução salina tamponada com fosfato (PBS at10X, pHÿ 7,4) a 37 ÿC ,
conforme descrito anteriormente em (S. Shrestha et al ., 2018). Resumidamente, cada
uma das estruturas secas foi imersa em 30 mL de PBS e depois incubada enquanto se
agitava a 100 rpm durante vários intervalos de tempo até 16 semanas. A solução foi
substituída a cada três dias por solução nova de PBS. Em intervalos de tempo
predeterminados, as amostras foram cuidadosamente retiradas da solução, enxaguadas
três vezes com água destilada para remover completamente quaisquer sais tampão e
depois liofilizadas antes de serem pesadas. A degradação in vitro das amostras foi
confirmada por análise morfológica (utilizando imagens FE-SEM). Quantitativamente, a
degradação também foi avaliada calculando-se o percentual de perda de peso, a partir
da relação: perda de peso (%) =
( w0 ÿ w1 , onde w0 e w1 representam o peso inicial (antes
w0 ) × 100
incubação) e peso final (após incubação em PBS por um determinado tempo) das
amostras, respectivamente. Além disso, também foi realizado um teste de biodegradação
enzimática (Ruan et al., 2016). O peso seco (w0) de diferentes andaimes foi medido
seguido de incubação em PBS (0,1 M) contendo 500 ÿg/mL de enzima lisozima nas
condições acima mencionadas por 2, 4 e 6 semanas. A concentração da enzima foi
baseada no padrão ASTM (F-1635-950). Após o término dos vários intervalos de tempo,
a estrutura foi lavada várias vezes com água DI e liofilizada. Os andaimes liofilizados
foram pesados novamente (w1) separadamente.
A degradação dos andaimes foi quantificada utilizando a relação acima, expressa
como% de perda de peso, e também confirmada por imagens FESEM.
2.3.3. Estudo de biomineralização
Como material de construção para a interface do tecido ósseo, foi avaliada a
biomineralização in vitro, por exemplo, a nucleação de material inorgânico, principalmente
cálcio e fósforo como hidroxiapatita (HA) na forma de nanocristal em diferentes suportes.
Esteira fibrosa de PU puro, esteiras eletrofiadas de PU/Zein/CS e PU/Zein/CS-fMWCNTs
(n = 3) em (2 cm x 2 cm) de tamanho igual foram incubadas em solução de fluido
corporal simulado (SBF) (pH 7,2 ) a 37 ÿC separadamente em diferentes períodos de
tempo de (1, 3, 5, 7 e 14 dias). A solução SBF foi preparada dissolvendo sais inorgânicos
incluindo MgSO4 (0,097 g), NaHCO3 (0,35 g) e CaCl2 (0,185 g) em água destilada (1 L)
com sal de Hank (Sigma-Aldrich, EUA). A solução de amostra incubada foi substituída
por nova solução de SBF a cada dois dias. Posteriormente, os andaimes mineralizados
foram lavados várias vezes com água destilada, secos e examinados com imagens FE-
SEM e espectros de raios X de energia dispersiva (EDAX), para confirmar a
3
Polímeros de carboidratos 251 (2021) 117035
deposição de AH.
2.3.4. Estudo de atividade antibacteriana
Medição da zona de inibição: Neste teste, as esteiras eletrofiadas de PU puro, PU/
Zein/CS e PU/Zein/CS-fMWCNTs foram testadas contra diferentes bactérias, como
Escherichia coli (E. coli), Staphylococcus aureus (S. aureus), Micrococcus luteus (M.
Luteus) e Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), para atividade antibacteriana.
Após a incubação das bactérias por 12 horas a 37 ÿC, agitando a incubadora em meio
de caldo de soja Tryptic, a suspensão bacteriana de 1 x 107 unidades formadoras de
colônias UFC/mL (calculada a partir de espectrofotometria UV a 600 nm) foi espalhada
uniformemente sobre ágar nutriente. placa de Petri. Em seguida, as amostras estéreis
(mantas eletrofiadas) foram colocadas na placa de petri de ágar bacteriano e incubadas
por 12 horas a 37 ÿC , para observar a eficiência bactericida de cada esteira eletrofiada.
As imagens foram tiradas com câmera digital convencional. Além disso, sua eficácia
antibacteriana foi avaliada pelo método de contato direto dinâmico, discutido
detalhadamente na informação suplementar.
2.4. Proliferação celular e avaliação de viabilidade
As células pré-osteoblastos (MC3T3E1) (do Clone 4 de camundongo normal, ATCC
CRL-5293) após descongelamento foram cultivadas em uma modificação alfa de Meio
Essencial Mínimo (ÿ- MEM) contendo 1,0 g/L de glicose suplementado com 10% de soro
bovino fetal (FBS, Gibco Life Technol-ogies) e anticorpos (1% de penicilina-
estreptomicina (Gibco Life Technologies). A placa de cultura foi incubada a 37 ÿC sob
5% de dióxido de carbono (CO2). Com 80% de confluência, o as células foram
destacadas por tripsina-EDTA (Gibco, Thermo Fisher Scientific) para uso experimental
na terceira passagem. Os andaimes (cada um com massa ÿ 35,0 mg) foram dobrados
em um lado de uma lâmina de vidro (12,0 mm de diâmetro) e fixadas em placas de 48
poços (SPL Life science, Coréia). Antes da semeadura celular, as amostras preparadas
foram esterilizadas sob luz ultravioleta (UV) por 24 horas e lavadas com etanol a 96%,
seguido por PBS (1X). as células foram semeadas a uma densidade de 2 x 104 por
poço (placas de 48 poços), mas somente após pré-tratamento das amostras, mergulhando-
as em meio celular por 1 h. As placas foram incubadas por (1, 3, 5 e 7) dias a 37 ÿC
em atmosfera com 5% de CO2 . A avaliação quantitativa associada à viabilidade e
proliferação de células MC3T3E1 em diferentes estruturas fibrosas foi realizada
utilizando kit de contagem de células-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc.
EUA) após (1, 3, 5 e 7) dias . Após o tempo definido, a solução CCK-8 foi adicionada a
cada placa de poços e incubada por 2 h em uma incubadora umidificada a 37 ÿC no
escuro. Finalmente, a densidade óptica (DO) de cada placa de poço para um ensaio
CCK-8 foi medida a 450 nm (n = 6) para examinar a proliferação de células utilizando
um leitor espectrofotométrico de microplacas (Tecan, Áustria).
Para a citotoxicidade dos suportes, as células MC3T3E1 em diferentes suportes
foram avaliadas usando o Kit de Viabilidade/Citotoxicidade LIVE/DEAD® de acordo
com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células MC3T3E1 foram semeadas
com uma densidade de 5 x 104 células por poço em placas de 48 poços fixadas com
diferentes suportes e placa de cultura de tecidos (TCP) como grupo de controlo. As
células continuaram a ser cultivadas por 24 horas a 37 ÿC em uma incubadora com 5%
de CO2 e 95% de umidade. As células foram lavadas com PBS, seguida de incubação
durante 30 min com 2 ÿM de Calceína AM e 4 ÿM de Ethidium Homodimer 1 (EthD-1)
em condições escuras. As células vivas e mortas foram determinadas usando imagens
de microscopia confocal.
2.4.1. Estudo morfológico da célula
A fixação e a morfologia celular foram examinadas por imagens FE-SEM (Carl Zeiss
Supra-40 VP Germany). A morfologia das células aderentes foi observada após (1, 3 e
7) dias do período de cultura em diferentes suportes. Antes da fixação com glutaraldeído
a 4% à temperatura ambiente (TA) durante 1 h, as células cultivadas nas amostras
foram lavadas duas vezes com PBS, seguida de desidratação em série com etanol
através de uma série ascendente graduada de (20, 30, 50, 70 e 100)%. A morfologia
das células foi observada após secagem. Para imagens de fluorescência confocal (por
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1. Imagens FE-SEM da membrana eletrofiada (a) PU puro, (b) PU/Zein/CS e (c) PU/Zein/CS-fMWCNTs. Histogramas (a1, b1 e c1) mostrando distribuições de
diâmetro das nanofibras correspondentes a (a), (b) e (c) na Fig. 1, imagens FE-SEM respectivamente.
microscopia confocal, Carl Zeiss, LSM 880, Airyscan, Alemanha), as células
cultivadas em diferentes suportes por vários períodos foram enxaguadas com
Solução de PBS duas vezes após aspiração da mídia da placa de 48 poços, seguida
de fixação das células com paraformaldeído a 4% (PFA) por 10 min. As células
foram permeabilizadas em triton a 0,3% (X-100) durante 3 min à temperatura
ambiente, foram então bloqueadas com albumina sérica humana a 1% (HAS) durante
30 min. Posteriormente, as células foram coradas com verde de actina (por 20 min)
e com DAPI (por 5 min) em ambiente escuro à temperatura ambiente.
2.4.2. Atividade da fosfatase alcalina (ALP)
Depois que as células MC3T3E1 foram cultivadas por (6 e 10) dias in vitro, a
atividade da ALP foi determinada quantificando a quantidade de p-nitro-fenol
(hidrólise de p-nitrofenil fosfato (pNPP)) presente usando um Kit de ensaio
colorimétrico ALP (ab83369) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente,
as células nas várias amostras (n = 3) foram lavadas com 1X PBS, seguido de
colheita utilizando tripsina, depois as células foram ressuspensas em tampão de lise
(1% Triton X-100) durante 5 min à temperatura ambiente. Os lisados celulares foram
centrifugados a 4 ÿC a 13.000× g por 15 min. Os sobrenadantes foram transferidos
para uma placa de 96 poços e tratados com 5 mM
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Solução pNPP por 1 hora em temperatura ambiente. A reação foi extinta pela adição
de solução de parada. A atividade da ALP foi quantificada por absorvância a um
comprimento de onda de 405 nm utilizando um leitor de microplacas. O conteúdo
total de proteína foi calculado e a atividade da ALP foi normalizada pela proteína total
contente.
2.4.3. Ensaio Alizarin Red-S (ARS) e teste de coloração Von Kossa
A capacidade dos andaimes para garantir a estimulação do sal de cálcio pelas
células MC3T3E-1 foi avaliada separadamente através da coloração com Alizarin
Red-S (ARS) e dos testes de coloração com nitrato de prata de Von Kossa. Para
coloração ARS, as células foram semeadas a uma densidade de 2,5 x 104 por poço
numa placa de 24 poços fixada com suportes. As células foram cultivadas durante
vários períodos (6, 14 e 21 dias). Após o período determinado, as células foram
lavadas duas vezes com PBS gelado e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 1
h à temperatura ambiente. Posteriormente, as amostras de células foram lavadas
três vezes com água destilada e incubadas com 1 mL de solução ARS (pH (4,1-4,3))
por 1 h à temperatura ambiente. Posteriormente, o excesso de corante foi removido
lavando as amostras celulares três vezes com água deionizada (DIW) e imagens digitais foram tira
Para quantificação da coloração foi utilizado cloreto de cetilpiridínio a 10%
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2. (a) e (b) imagens HR-TEM de fMWCNTs bem dispersos em nanofibras eletrofiadas PU / Zein / CS. (A inserção também mostra os fMWCNTs dentro das nanofibras).
para extrair o corante absorvido, e a absorbância foi medida a 620 nm por
espectrofotometria. Da mesma forma, a formação de minerais/íons de fosfato de cálcio
por MC3T3E-1 in vitro foi examinada através da coloração de Von Kossa. Depois que as
células MC3T3E-1 foram fixadas com 4% de PFA por vários períodos de (6, 14 e 21
dias), foi adicionado 1 mL de solução de nitrato de prata a 1% e as culturas celulares
foram mantidas sob UV por 30 min. As amostras de células foram lavadas diversas vezes
com DIW para remover qualquer resíduo de nitrato de prata que não reagiu (já que o
AgNO3 tem a capacidade de substituir o cálcio ligado ao fosfato na camada de cristais
de HA com a formação de Ag reduzido), imagens do preto acastanhado nódulos
mineralizados com fosfato foram obtidos utilizando microscopia de contraste de fase
invertida, bem como com uma câmera digital.
2.4.4. Análise de Western Blot
As células MC3T3-E1 foram cultivadas em placas de 12 poços a uma densidade de
5 x 104 por poço durante 21 dias. As células foram lisadas e a proteína foi extraída com
solução de extração de proteínas (iNtRON Biotechnology).
Quantidades iguais de proteína foram resolvidas por SDS-PAGE e o gel a 15% foi
transferido para a membrana de PVDF (membrana de celulose). As membranas foram
bloqueadas com BSA a 3% em TBST (TBS/Tween-20 a 0,05%) à temperatura ambiente
durante 2 h. Sucessivamente, as membranas bloqueadas foram incubadas com o
anticorpo primário específico apropriado durante a noite a 4 ÿC. Anticorpos primários
contra os seguintes alvos foram utilizados: anticorpo anti-osteopontina ab8448 (coelho
policlonal, 1:1.000, abcam), gliceraldeído3-fosfato desidrogenase (GAPDH, 1:1.000,
Santa Cruz Biotechnology), anticorpo anti-osteocalcina (OCG4) ab13421 ( monoclonal
de camundongo, 1:2.000, abcam). As membranas foram incubadas com anticorpo
secundário conjugado com peroxidase de rábano, numa diluição de 1:5.000. Os sinais
de proteína foram detectados utilizando solução de kit ECL (Amersham, Picataway, NJ)
e expostos a filme de raios X médico. O software Image J foi usado para analisar as
intensidades relativas de proteína de um blot. Todos os experimentos de análise de
western blot foram repetidos 3 vezes, de forma independente. Além disso, para análise
imunocitoquímica, as células foram fixadas com PFA a 4% e permeabilizadas com Triton
X-100 a 0,3%. As células foram então bloqueadas com BSA a 1% (22,52 mg/mL de
glicina em PBS e Tween 20), seguido de incubação com o anticorpo primário (anticorpo
anti-osteopontina ab8448) a 4 ÿC durante a noite . As células foram novamente incubadas
com um anticorpo secundário (IgG anti-coelho de cabra Rhodamine Red™-X, sondas
moleculares Invitrogen) durante 2 h à temperatura ambiente. Os núcleos das células
foram corados usando DAPI enxaguando com PBS em cada etapa. Por último, foram
tiradas imagens de micrografia de fluorescência das células coradas utilizando microscopia
confocal.
2.4.5. Análise estatística
A diferença estatística entre os vários grupos foi realizada por análise de variância
unidirecional (ANOVA) e análise post hoc de Tukey.
5
Polímeros de carboidratos 251 (2021) 117035
Todos os resultados quantitativos foram obtidos de uma amostra de pelo menos seis (n =
6). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). O nível de significância
foi estabelecido em *p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001.
3 Resultados e discussão
3.1. Propriedades físico-químicas dos andaimes nanofibrosos
A Figura 1 mostra a morfologia das várias nanofibras eletrofiadas.
As imagens FE-SEM de nanofibra de PU com diâmetros médios de (160-262) nm (n =
100) foram obtidas (Fig. 1 (a)), isto é quase cinco vezes menor que o diâmetro da
nanofibra de PU relatado em nosso trabalho anterior (Shrestha, Shrestha, Lee et al.,
2019). A diminuição do diâmetro da fibra é resultado da baixa viscosidade da solução de
PU (ÿ28,56 ± 0,25 cp) que ficou sob agitação contínua por muito tempo (viscosidade da
solução, Tabela S1 do SI). Em contrapartida, a adição de quitosana juntamente com
zeína aumentou a viscosidade da solução (78,33 ± 0,11cp). Conseqüentemente, as fibras
eletrofiadas que foram produzidas a partir desta solução eram maiores em diâmetro de
fibra, na faixa (193 a 356) nm, em comparação com PU (( Fig. 1 (b)). A% em peso
otimizada de ambas as quitosanas e zeína em solução de PU produziram nanofibras
contínuas com um diâmetro relativamente uniforme juntamente com uma superfície
lisa.Esta membrana fibrosa fabricada tem a capacidade de imitar a nanoestrutura da
ECM biológica nativa, fornece um microambiente adequado para a atividade celular,
incluindo proliferação e diferenciação. A imagem FE-SEM do material compósito fibroso
(PU/Zein/Cs-fMWCNTs) mostra fibras contínuas, sem esferas e uniformes de pequeno
diâmetro (em média ÿ126 nm (Fig. 1 (c)). A modificação polar para As paredes laterais
dos nanotubos aumentam sua solubilidade em solução aquosa, o que os torna capazes
de formar peptídeos bioativos ligados covalentemente ou ligações cruzadas de CN com
zeína e quitosana (Pantarotto et al., 2003).A presença de fMWCNTs na solução aumenta
sua solubilidade. peso molecular tornando-o mais viscoso (88,93 ± 0,61 cp).
No entanto, a presença de fMWCNTs aumenta a condutância da solução num
campo eléctrico. É importante ressaltar que a condutância da solução PU (21,84 ±
0,09 ÿs/cm) e da solução PU/Zein/Cs (119,13 ÿs/cm) é notavelmente inferior à
condutância da solução PU/Zein/Cs-fMWCNTs (179,83 ± 0,4 ÿs/ cm) (condutividade
das soluções, Tabela S1 do SI).
Isso torna a solução PU / Zein / Cs-fMWCNTs facilmente fiável, produzindo nanofibras
de menor diâmetro devido ao maior estiramento do jato eletrificado. Além disso, as curvas
de distribuição de diâmetro obtidas para as nanofibras PU, PU/Zein/Cs e PU/Zein/Cs-
fMWCNTs correspondem à Figura 1 (a1, b1 e c1, respectivamente), estas também
mostram o pequeno diâmetro éter das nanofibras PU/Zein/Cs-fMWCNTs. A presença de
grupos -COOH nos nanotubos de carbono aumenta a densidade de carga da solução, o
que pode reduzir a tensão superficial durante a eletrofiação e a formação de pequenos
diâmetros de fibras.
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S. Shrestha et al. Polímeros de carboidratos 251 (2021) 117035

3. (A) Espectros FT-IR de pelotas de PU puro e membrana eletrofiada de PU. (B) Espectros de FT-IR de (a) membrana PU, (b) Zeína, (c) quitosana, (d) membrana PU/
Zein/CS e (e) membrana PU/Zein/CS-fMWCNTs . (C) Espectros FT-IR de Zeína (a1), membrana PU/Zein/CS (b1) e membrana PU/Zein/CS-fMWCNTs (c1) (faixa de 1000
a 2000 nm), (D) FT-IR espectros de membrana PU, quitosana e membrana PU/Zein/CS-fMWCNTs (faixa de 3.000 a 4.000 nm), (E) Curvas de tensão-deformação
representativas de nanofibras eletrofiadas e (F) Módulo de Young de membranas nanofibrosas (dados são apresentados como média ± desvio padrão, n = 3). (G)–(I)
Imagens ópticas dos ângulos de contato com a água de várias membranas nanofibrosas (n = 3).

6
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S. Shrestha et al.
2 (a e b) ilustram a distribuição homogênea de fMWCNTs (imagens TEM
de varredura corrigidas por Cs) nas nanofibras PU / Zein / Cs-fMWCNTs. A
propriedade inerente de condutividade dos fMWCNTs influencia a redução
do diâmetro das fibras. De fato, os andaimes fibrosos exibem porosidade e
alta resistência mecânica devido à sua arquitetura especializada, o que os
torna uma opção atraente de andaime para infiltração e migração celular.
Figos. 3 (A) – (D) mostram o espectro FT-IR de cada componente junto
com o próprio material compósito. Nos espectros de PU puro, os picos
característicos em (3320 e 1703) cm-1 são atribuídos a N – H (alongamento)
e C = O (isocianatos/uretano), respectivamente. O exame da membrana de
PU revela que não ocorreram alterações significativas na composição química
ou mudança nas bandas IR de PU após tratamento com TFA (Fig. 3 (A)).
Além disso, as bandas de absorção em (2.960 e 2.870) cm-1 (bandas de
alongamento simétrico e bandas de alongamento assimétrico,
respectivamente) devido ao sp3 das ligações C – H na membrana de PU
estão de acordo com o FT-IR. dados de UP relatados na literatura anterior
(Carone, D'Ilario, & Martinelli, 2002). No entanto, os picos fracos associados
a CH, CH2 e CH3 na membrana de PU, em contraste com PU puro, em torno
de (2.840-2.970) cm-1 , poderiam ser o efeito da participação do TFA na
ligação de hidrogênio como um doador de prótons. , reduzindo assim o
momento dipolar dos grupos C – H no alongamento das ligações vibratórias
(Denisov, Mikheev, Sokornova, & Shraiber, 1986). Na Figura 3 (B) (b), o
espectro da zeína está associado às bandas características em torno de
((1646–1725) e 1521) cm-1, estas podem ser atribuídas à amida I e amida II
(N –H flexão), respectivamente (Mejia, Mauer, & Hamaker, 2007). O pico de
baixa intensidade que aparece em 1725 cm-1 pode ser o modo vibracional
de alongamento C = O com a influência do acoplamento dipolo no
alongamento C – N e flexão NH (no plano) na amida I (Surewicz , Mantsch e
Chapman, 1993). Os picos em torno de 1723 cm-1 e 3370 cm-1 são atribuídos
a C = O e -OH nos fMWCNTs, confirmando a modificação da superfície com
grupos –COOH (Fig. S2 do SI). A vibração de alongamento C = O relacionada
à confirmação da estrutura principal da amida I como porções orgânicas
(Bancila, Ciobanu, Murariu, & Drochioiu, 2016) e grupos carbonila na
superfície dos fMWCNTs podem formar ligação covalente. Notavelmente, as
interações entre grupos -COOH em fMWCNTs e -NH2 ou -OH na quitosana
são responsáveis pela formação de ligações de hidrogênio covalentes e
intermoleculares (Venkatesan, Qian, Ryu, Ashok Kumar, & Kim, 2011).
Isto pode ser confirmado pela posição dos picos observados em torno de
1.768 cm-1, estes são deslocados da posição da banda de grupos C = O
individuais em zeína e fMWCNTs, como mostrado na Fig . ). Um pico amplo
notável em torno de 3456 cm-1 origina-se dos grupos O – H na quitosana
(Fig. 3. (B), (c)) e também é observado na membrana eletrofiada de PU /
Zein / CS-fMWCNTs (Fig. 3 . (D)), este pico indica que o biopolímero de
quitosana está homogeneamente misturado ao biomaterial híbrido.
As propriedades mecânicas da membrana fibrosa eletrofiada foram
avaliadas através das curvas típicas de tensão-deformação, como mostrado
na Figura 3 (E). Principalmente, os suportes de tecido precisam ter boas
propriedades mecânicas para permanecerem no local em que foram
colocados e resistirem às forças do tecido circundante, ao mesmo tempo em
que fornecem suporte estrutural para a proliferação celular e secreção de
matriz óssea e deixam espaço. para novo crescimento de tecido ósseo
durante a degradação do andaime. Em particular para andaimes baseados
em materiais biodegradáveis nativos, eles devem ter ligações interatômicas
e intermoleculares suficientemente altas, bem como uma estrutura adequada
para manter a carga designada durante o período de tempo necessário até
que o novo tecido se regenere (Hutmacher, 2000) . As esteiras eletrofiadas
compostas à base de quitosana com zeína e fMWCNTs formam fortes
ligações de hidrogênio intermoleculares e ligações peptídicas. O tratamento
ácido do PU pode modificar ligeiramente a química de sua superfície com um
excesso de porções –C – O e –C = O, que são propensas a formar ligações
covalentes e eletrovalentes. Consequentemente, a membrana eletrofiada de
PU/Zein/CS-fMWCNT apresentou maior resistência à tração (ÿ7,05 MPa),
que é maior do que a resistência à tração da membrana eletrofiada de PU/
Zein/CS (ÿ5,27 MPa). Esta química superficial do material afeta um aumento
no módulo de Young do material compósito (Fig. 3 (F)). O valor do módulo de Young dasÿ, esteiras
Polímeros de carboidratos 251 (2021) 117035
Descobriu-se que os fMWCNTs são ÿ52,55 ± 2,9 MPa e ÿ43,96 ± 4 MPa,
respectivamente, enquanto o módulo de Young da esteira de PU é ÿ8,03 ±
1,5 MPa. Os numerosos radicais e frações químicas em cada material nas
membranas compósitas são responsáveis por ligações químicas intra e
intermoleculares associadas a possíveis reticulações devido aos grupos
carbonila na cadeia de PU. Esses grupos químicos têm efeito sinérgico,
aumentando o módulo de Young nos biomateriais híbridos.
Obviamente, as propriedades inerentes de rigidez e resistência mecânica
robusta dos CNTs nas nanofibras eletrofiadas aumentaram a resistência à
tração juntamente com o módulo de Young aprimorado. Além disso, a
concentração particular de fMWCNTs (0,1 mg/mL) na esteira eletrofiada
proporciona a maior resistência à tração em comparação com outras
membranas contendo diferentes concentrações de fMWCNTs. (Fig. S3 do
SI). Uma concentração mais alta de fMWCNTs (0,5 mg/mL) em uma esteira
eletrofiada aumenta a rigidez da esteira fibrosa, o que, por sua vez, causa
uma diminuição no alongamento no ponto de ruptura, diminuindo a resistência
à tração final, o que não é um bom compromisso para biomaterial de suporte
de carga. Assim, fMWCNTs (0,1 mg/mL) em membrana eletrofiada exibiram
as melhores propriedades mecânicas e foram escolhidos como a concentração
otimizada para fabricação de andaime bioativo. 3 (G) – (I) exibe imagens
ópticas dos valores estáticos de WCA para diferentes esteiras eletrofiadas. A
molhabilidade de um biomaterial é um fator importante para o transporte de
nutrientes e metabólitos. Isso estimula muito a atividade das células-tronco,
como a fixação, o crescimento, a migração e a proliferação das células
(Lampin, War-ocquier-Cl´erout, Legris, Degrange, & Sigot-Luizard, 1997). O
valor WCA é notavelmente diminuído nas esteiras eletrofiadas compostas
incorporadas com zeína e CS. O comportamento hidrofílico da quitosana
vem da presença de grupos polares que podem facilmente absorver água.
Surpreendentemente, o WCA na membrana eletrofiada de PU foi medido
como (101,9 ± 0,7)ÿ indicando o efeito do TFA para gerar mais polaridade
nos grupos C = O e -NH na superfície do PU, isso aumenta a energia livre da
superfície e diminui o WCA (Kuang, Lee, Kim, Ho e Constant, 2010). Além
disso, a incorporação de fMWCNTs em biomateriais compósitos diminui ainda
mais o WCA para (37,85 ± 2,4)ÿ, que é menor que o WCA de PU/Zein-CS
(ÿ40,38 ± 1,4)ÿ, isso confirma que o efeito hidrofílico dos grupos -COOH
associados aos fMWCNTs responsáveis pela formação de ligações de
hidrogênio com a água (Türk et al., 2018), estão expostos na superfície da
nanofibra. A redução dos valores do ângulo de contato da água para as
membranas fibrosas compostas (Tabela S2 do SI) indica o mecanismo do
movimento capilar devido a grupos amantes da água e arquitetura porosa na
superfície do biomaterial (De Bartolo, Morelli, Bader, & Drioli, 2001).
A figura S4 (a) do SI mostra os padrões de XRD de cada componente e
material compósito da membrana eletrofiada. Dois picos regulares no PU em
ângulos de 2ÿ em torno de (8,2 e 20,15) ÿ mostram o grau de cristalinidade,
mas as intensidades dos picos nessas posições são relativamente fracas,
indicando semicristalinidade do PU macio. A dissolução do PU no TFA por
um longo período pode aumentar a polaridade da cadeia do PU, podendo
causar um aumento na reticulação dos grupos uretano no PU; como resultado,
o PU pode apresentar baixa propriedade cristalina (Trovati, Sanches, Neto,
Mascarenhas, & Chierice, 2010). O pó de zeína apresentou picos em torno
de 2ÿ= (8,9 e 19,8) ÿ. Esses valores são consistentes com a conformação da
hélice ÿ da zeína (Han, Xu, Lu, & Wang, 2014). Além disso, o difratograma
associado aos conhecidos picos agudos em (9,3 e 20,1) ÿ da quitosana
confirma a forma semicristalina das nanopartículas de quitosana. Além disso,
o pico de baixa intensidade observado para PU/Zein/Cs-fMWCNTs em 2ÿ =
41,8ÿ é devido à presença de fMWCNTs em uma camada hexagonal de
grafite e sugere uma fina camada de PU/Zein/CS aderida à sua superfície.
Os picos são amplos e de baixa intensidade no material compósito quando
comparados com as intensidades dos picos de cada biomaterial, indicando
uma distribuição homogênea do material na membrana eletrofiada composta.
Para confirmar a presença de zeína e CS nas fibras de PU, pré-formamos a
análise de TG das esteiras eletrofiadas, incluindo as amostras de PU, PU/
Zein/CS e PU/Zein/CS-fMWCNTs . Como mostrado na Fig. S4 (b) do SI, a
membrana de nanofibra de PU se decompôs a uma temperatura inicial de
358
como resultado da terminação
PU/Zein/CS com e semda cadeia do
7
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4. Imagens FE-SEM de degradação in vitro de membrana fibrosa (a) PU puro, (b) PU/Zein/CS e (c) PU/Zein/CS-fMWCNTs após 16ª semana de imersão em PBS, ( d)
curvas de perda de peso (%) em vários momentos (dados apresentados como média ± desvio padrão, n = 3).

grupo diisocianatos em PU. Acima de 500 ÿC, uma massa muito baixa de morfologia, incluindo aumento da rugosidade e porosidade da superfície,
quase 2,1% em peso na forma de material de carbono foi obtida como com fibras altamente descontínuas e deformadas em termos de forma e
resíduo. Em contraste, descobriu-se que a zeína era desnaturada a uma tamanho, bem como diminuição dos diâmetros das fibras que diferiram
temperatura de 84 ÿ e quase decomposta a ÿ122 ÿ na membrana fibrosa PU/zeína/CS.
drasticamente do estágio original (imagens FE-SEM na Fig. 1 ) . Os
Também confirmamos a presença de quitosana, que tem um efeito notável resultados quantitativos da degradação in vitro nos intervalos de tempo
na diminuição da temperatura de início de decomposição para ÿ310 ÿ. Essa predeterminados revelam a biodegradação das membranas compósitas
diminuição na temperatura inicial das membranas pode ser proveniente da (Fig. 4 (d). Verificou-se que a % de perda de peso do andaime de PU não
decomposição de segmentos moles dos grupos dióis no PU e até mesmo apresentou quaisquer alterações significativas, mas nos andaimes
na quitosana. Além disso, a evaporação da umidade na membrana foi compósitos, perda de peso % indicando uma diminuição na massa com o
confirmada a partir da perda mínima de massa (cerca de 0,5% em peso) aumento do tempo de imersão. No entanto, PU/Zein/CS-fMWCNTs
em temperaturas a partir de 43 ÿ. Embora um resultado semelhante tenha apresentaram rápida perda de peso (ÿ 38,3% em peso) após imersão por
sido obtido a partir das membranas eletrofiadas PU/Zein/CS e PU/Zein/CS- 16 semanas. Enquanto isso, os valores de perda de peso para PU/Zein/ CS
fMWCNTs , a temperatura de início de decomposição aumentou para ÿ321 e PU puro após imersão por 16 semanas foram encontrados em (26,53 e
ÿ com a adição de fMWCNTs. Isto possivelmente se deve à alta rigidez dos 6,9)% em peso, respectivamente. Maior perda de massa em andaimes
nanotubos de carbono. No entanto, a membrana composta com fMWCNTs compósitos revelou a maior extensão de moléculas de água sendo
mostrou uma massa residual ligeiramente superior de quase ÿ 0,33% em absorvidas pelos andaimes e aumentando a taxa de hidrólise de proteínas
peso (inserção Fig. S4 do SI), juntamente com uma massa residual total de e polissacarídeos (Fen-gel & Wegener, 1979). Além disso, a degradação
ÿ13,8% em peso, indicando a presença de fMWCNTs no membrana eletrofiada. dos andaimes também foi avaliada na presença de lisozimas. As imagens
Os resultados da biodegradação in vitro, incluindo imagens FESEM e FE-SEM (Fig. S5) de PU/Zein/CS e PU/ Os andaimes Zein/CS-fMWCNTs
dados quantitativos dos vários suportes fibrosos, são mostrados nas Figs. 4 mostram estruturas altamente deformadas associadas à diminuição do
e S5. Ambas as estruturas compostas (PU/Zein/CS e PU/Zein/CS- diâmetro da fibra após 4 semanas. No entanto, nenhuma mudança notável
fMWCNTs) apresentaram excelente comportamento de biodegradação. A foi observada na estrutura de PU puro. A enzima em fluidos físico-químicos
rede macromolecular dos andaimes projetados tem a capacidade de se ou tecidos tem a capacidade de degradar a estrutura e fornecer uma
degradar com o tempo e, em última análise, constrói um microambiente plataforma para regenerar células. As imagens FE-SEM (Fig. S5 (ac))
para a regeneração de novo tecido ósseo simultaneamente. A hidrólise da diferem das imagens (Fig. 4, (a – c)) indicando que os lisossomos estão
zeína associada à sua lenta clivagem da ligação peptídica poderia melhorar envolvidos na quebra das ligações glicosídicas na quitosana (Andrea,
suas propriedades físico-químicas, incluindo sua solubilidade em condições Marica, & Anamarija, 2017) fazendo com que os andaimes se tornem mais
aquosas, capacidade emulsificante e digestibilidade (CASELLA & deformados e descontínuos. No entanto, algumas partículas minerais
WHITAKER, 1990). Sem dúvida, o polissacarídeo/peptídeo natural sofre granulares (de PBS) fixadas nas nanofibras foram observadas devido à forte
hidrólise aquosa, onde a água atua como solvente anfotérico. A morfologia hidrofilicidade dos andaimes compósitos. Os perfis de perda de peso (Fig.
da superfície, orientação, tamanho e forma dos diferentes andaimes fibrosos S5 (d)) dos andaimes PU/Zein/CS e PU/Zein/CS-fMWCNTs após 6 semanas
foram avaliadas utilizando imagens FE-SEM após imersão em PBS. A de imersão em solução enzimática foram de 21,27% e 28,28%,
membrana fibrosa de PU ao final de 16 semanas não apresentou diferenças notáveis.
respectivamente. Estes dados ilustram a rápida degradação dos andaimes
(Fig. 4. (a). Em contraste, observou-se que as estruturas fibrosas compostas na presença de enzimas e os tornam um biomaterial promissor para a construção de bio
com (Fig. 4. (c)) ou sem fMWCNTs (Fig. 4. (b) tinham diferentes