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www.acsami.org Artigo de
pesquisa

Implantes de nanosilicato multinivelados podem facilitar a cicatrização

óssea quase perfeita
Mozhgan Keshavarz, Parvin Alizadeh,* Firoz Babu Kadumudi, Gorka Orive,* Akhilesh K. Gaharwar, Miguel
Castilho, Nasim Golafshan e Alireza Dolatshahi-Pirouz*
Cite isto: ACS Appl. Mater. Interfaces 2023, 15, 21476-21495 Ler on-line

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*sı Informações de apoio

RESUMO: Vários estudos demonstraram que os suportes reforçados com

Consulte https://pubs.acs.org/sharingguidelines para obter opções sobre como compartilhar

nanosilicato são adequados para a regeneração óssea. Entretanto, os hidrogéis

são inerentemente macios demais para defeitos ósseos de tamanhos críticos que
suportam carga, e os andaimes rígidos normalmente não oferecem um
Baixado via 206.43.121.56 em 4 de julho de 2023 às 17:47:06 (UTC).

microambiente tridimensional (3D) adequado para que as células se

desenvolvam, cresçam e se diferenciem naturalmente. Neste estudo,
contornamos esses desafios de longa data fabricando um implante multinível
sem células que consiste em uma estrutura óssea porosa e dura capaz de fornecer
suporte de carga e uma fase nativa mais macia que foi reforçada com
legitimamente artigos publicados.

nanosilicatos. O sistema foi testado com células-tronco mesenquimais da

medula óssea de ratos in vitro e como um sistema sem células em um defeito
ósseo de tamanho crítico em ratos. De modo geral, nosso projeto de implante
combinatório e multinível apresentou notável osteocondutividade in vitro sem
fatores de diferenciação, expressando níveis significativos de marcadores
osteogênicos em comparação com grupos não modificados. Além disso, após
Após 8 semanas de implantação, os ensaios histológicos e imuno-histoquímicos indicaram que os suportes sem células melhoraram o
reparo ósseo em até aproximadamente 84% após uma cicatrização quase completa do defeito. De modo geral, nossos resultados
sugerem que o implante de biocerâmica de nanosilicato proposto poderia anunciar uma nova era no campo da ortopedia.
PALAVRAS-CHAVE: bio vidro, alginato, laponita, hidrogéis, células-tronco mesenquimais, nanomateriais, nanosilicato
matriz extracelular (ECM), constituída de fibras de colágeno de
1. INTRODUÇÃO tamanho nanométrico a micrométrico e vários polissacarídeos,
A perda de tecido ósseo pode ocorrer por uma ampla variedade enquanto a fase dura é composta de uma mistura mineral
de motivos, incluindo trauma, osteoporose e doenças ósseas combinatória inorgânica que consiste em hidroxiapatita, sílica,
metastáticas.1,2 Atualmente, elas afetam 20 milhões de pessoas magnésio, zinco, estrôncio e lítio.13 Para
em todo o mundo a cada ano,3 tornando o osso o segundo
© 2023 The Authors. Publicado pela
tecido transplantado mais comum no mundo.4 Várias técnicas, American Chemical Society
como
O autoenxerto, o aloenxerto e o xenoenxerto têm sido
empregados há décadas como o padrão ouro no campo;5−8
entretanto, eles ainda enfrentam alguns desafios, como riscos de
infecção e rejeição, que limitam sua tradução clínica.9−11 Uma
possível solução para superar essas limitações é o tecido ósseo
engenharia. Aqui, uma combinação de estruturas, hidrogéis e, às
vezes, células-tronco é usada para gerar tecido ósseo a partir do
zero.5,12 No entanto, apesar da promessa da técnica, ela ainda
não liberou todo o seu potencial. Por exemplo, o campo ainda
carece de sistemas biomateriais que imitem totalmente as
delicadas complexidades do osso nativo. O osso é
essencialmente um órgão de vários níveis composto por duas
fases diferentes: uma fase dura e inorgânica e uma fase macia e
orgânica elegantemente organizada em uma estrutura complexa
e hierárquica. A fase mole consiste principalmente em uma
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Por esse motivo, os desenvolvimentos anteriores e atuais
têm se concentrado no uso de materiais semelhantes aos
nativos para o desenvolvimento de substitutos ósseos que
possam se assemelhar melhor às propriedades biológicas,
químicas e físicas do osso nativo.7,13
Devido à alta compatibilidade entre as cerâmicas de
vidro biológico (BG) e o tecido ósseo, elas têm sido
usadas para reconstruir a fase dura do osso. A BG é uma
classe de materiais cerâmicos com fase cristalina e vítrea,
na qual seus vários componentes podem ser controlados
para produzir ambientes bioativos e biocompatíveis para a
engenharia de tecido ósseo.14,15 Isso está relacionado
principalmente ao fato de que eles podem estabelecer
rapidamente fortes ligações interfaciais com o osso nativo
por meio da formação de uma camada de hidroxiapatita
semelhante à nativa como resultado da dissolução de
produtos minerais, como cálcio (Ca), sílica (Si) e fosfato
(P).16 Os minerais liberados, por sua vez, podem aumentar
a proliferação e a diferenciação celular e acelerar a
formação de novos ossos.15,17−23 Portanto, tanto do ponto de vista
químico quanto
Do ponto de vista biológico, o BG apresenta muitas propriedades
interessantes

Recebido: 6 de fevereiro de 2023

Aceito: 3 de abril de 2023
https://doi.org/10.1021/acsami.3c01717
Publicado: 19 de abril de 2023

21476 ACS Appl. Mater. Interfaces 2023, 15, 21476-21495

ACS Applied Materials & Interfaces www.acsami.org Artigo de
sódio, lítio e magnésio que, com o tempo, se degrada em magnésio,
pesquisa
adequado para a cicatrização óssea.5 Em particular, o BG ácido ortosilícico e minerais de lítio que, posteriormente, podem se
composto por 60% de SiO2 -34% de CaO-6% de P O25 (mol %) tornar
tem se mostrado muito promissor no campo - principalmente incorporado pelo núcleo da célula para estimular as células-tronco
porque se liga mais rapidamente ao
mesenquimais em direção à linhagem osteogênica.45−50 Notavelmente,
o tecido ósseo do que as outras variantes. Isso reduz muito as a carga positiva na superfície da borda da Laponita pode formar fortes
reações imunológicas e, portanto, evita completamente o
interações físicas com grupos hidroxila ou carboxila presentes
comprometimento das formações de tecido fibroso.24−27
No lado orgânico, os hidrogéis à base de alginato apresentam
características no campo, como maciez semelhante à da ECM,
biocompatibilidade, biodegradabilidade e baixa reação
imunológica.
resposta.28−33 Sua bioatividade pode ser aprimorada por meio da
incorporação de sequências RGD ou gelatina aderentes às
células.34−36 Entretanto, a funcionalização do RGD pode, às
vezes, ser muito
A gelatina se degrada rapidamente no corpo. Os biomateriais
em nanoescala usados na engenharia de tecido ósseo podem ser
classificados em unidimensionais (1D), bidimensionais (2D) e
tridimensionais (3D) com base em suas d i m e n s õ e s
microestruturais.37 Os pontos quânticos, nanomateriais de
dimensão zero compostos de nanocristais semicondutores com
tamanho entre 2 e 10 nm, possuem propriedades vantajosas de
estabilidade química e térmica, bem como propriedades ópticas.
Além disso, suas propriedades ópticas exclusivas permitem que
os pontos quânticos sejam efetivamente utilizados para
aplicações de bioimagem, rastreamento celular e imagens de
células vivas in vivo e in vitro. Apesar das possíveis aplicações
biológicas e biomédicas dos pontos quânticos, sua utilização
tem sido limitada pela presença de metais tóxicos pesados, como
cádmio, chumbo e mercúrio. De modo geral, os pontos
quânticos não têm sido amplamente empregados na
regeneração óssea devido ao seu tamanho pequeno e à
estabilidade estrutural inadequada. Os nanoflocos são
nanopartículas 2D que, em geral, variam de 10 a 100 nm e têm
uma morfologia semelhante a uma placa com uma área de
superfície substancial. Essa característica as torna adequadas
para aplicações como revestimentos
em implantes para aumentar a biocompatibilidade.38−40
Posteriormente,
Os nanomateriais 3D com estruturas hierárquicas distintas são
criados a partir de nanoarquiteturas 1D e 2D, proporcionando
características mais vantajosas para a regeneração óssea. Os
nanocristais são nanomateriais 3D com uma faixa de tamanho
que varia entre 200 e 500 nm, que possuem uma alta área de
superfície, o que os torna benéficos para o desenvolvimento e a
integração óssea e, portanto, são comumente aplicados como
revestimentos de implantes ou incorporados como enchimentos
de enxertos ósseos para promover a osseointegração. Devido às
suas propriedades, esses nanomateriais se diferenciam em
termos de sua capacidade de aumentar a fixação, a proliferação e
a restauração óssea das células. As características que distinguem
esses nanomateriais são suas propriedades físicas, como forma,
tamanho da dimensão da partícula, área de superfície e
composição. De modo geral, os nanocristais, devido à sua maior
área de superfície em comparação com os pontos quânticos e os
nanoflocos, podem facilitar a adesão e a proliferação celular, a
vascularização e a osteogênese, acelerando e melhorando a
regeneração óssea.41,42 Neste estudo, voltamos nossa atenção
para a família dos nanosilicatos, que é mais estável do que a
gelatina e mais fácil de ser ampliada em comparação com o RGD
modificações. Dos muitos nanosilicatos inorgânicos
investigados até o momento, a laponita (Na+0.7 [(Mg5.5 Li0.3 ) Si
O820 (OH) ]4−0.7 ) é o mais atraente devido à sua extraordinária
osteocondutividade.43−46 A laponita é um silicato hidratado de
21477 https://doi.org/10.1021/acsami.3c01717
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 ACS Applied Materials & Interfaces www.acsami.org Artigo de
hidrogel pesquisa
na espinha dorsal do alginato,50 permitindo que os faz com que eles falhem facilmente sob as cargas pesadas normalmente
usuários o incorporem na matriz do hidrogel sem recorrer presentes em
a conjugações químicas complicadas.51−53 Os implantes de O osso nativo e os scaffolds porosos substancialmente mais
nanosilicato demonstraram duros não oferecem um ambiente semelhante ao nativo para as
grande potencial como biomaterial para aplicações ortopédicas, células se desenvolverem, resultando em formação óssea
graças a seus recursos exclusivos, incluindo excelente insuficiente. A combinação dos dois em um único material
b i o c o m p a t i b i l i d a d e , capacidade de se degradar poderia permitir um equilíbrio para manter suas respectivas
em produtos inofensivos e propriedades osteoindutoras. vantagens e, ao mesmo tempo, superar suas deficiências
Foi relatado que seus subprodutos, como ácido quando usado sozinho.60,61 Por esses motivos, o scaffold-hidrogel
ortosilícico, Mg2+ e Li+ , que podem ser facilmente deveriam estar no centro do campo em termos de recriação de
assimilados pelo corpo, promovem a diferenciação tecidos duros semelhantes ao osso.62−70 Infelizmente, apenas
osteogênica de células-tronco mesenquimais humanas, o alguns estudos examinaram o desempenho desses estudos in
que os torna candidatos promissores para a engenharia de vivo em animais63,67−70 , com resultados ruins que representam
tecido ósseo. O potencial dos implantes de nanosilicato um
como um microambiente livre de fatores de crescimento e
de células para acelerar a cicatrização óssea é único graças
à sua significativa osteocondutividade in vitro sem fatores
de diferenciação, conforme demonstrado pela expressão
de níveis significativos de marcadores osteogênicos.54
Um dos desafios associados aos nanosilicatos é a
avaliação de sua toxicidade, que se deve aos seus produtos
de degradação. No entanto, em condições fisiológicas, os
nanosilicatos se dissociam em produtos não tóxicos, como
Na+ , Mg2+ , Si(OH)4 e Li+ . Os implantes de nanossilicato
têm demonstrado potencial como plataforma para o
fornecimento de medicamentos na engenharia de tecidos
devido às suas propriedades exclusivas, como alta área de
superfície e biocompatibilidade. As
nanocamadas são comumente usadas em pesquisas
relacionadas à engenharia de tecidos, fornecimento de
medicamentos e cicatrização de feridas devido à sua total
ausência de toxicidade. Elas podem ser facilmente
projetadas para o carregamento e o direcionamento de
medicamentos e são altamente biocompatíveis, não
imunogênicas, menos caras e facilmente disponíveis. As
nanocamadas também possuem propriedades exclusivas,
como intercalação, inchaço e produtos de degradação não
tóxicos. A capacidade de carregamento de medicamentos
em implantes de nanossilicato pode variar devido a alguns
fatores, inclusive o tipo específico de nanossilicato
utilizado, a forma e o tamanho dos nanossilicatos e o
medicamento específico que está sendo carregado neles.
Os nanosilicatos relevantes do ponto de vista biomédico e
comumente usados, como caulim, montmorilonita
(MMT) e haloisita, são argilas catiônicas com uma carga
negativa permanente geral na superfície, o que lhes
permite interagir com medicamentos básicos. Para a
liberação controlada de medicamentos, eles também
podem ser intercalados entre as camadas de nanosilicato.
Por exemplo, o caulim e a haloisita foram usados com
sucesso para carregar doxorrubicina (DOX) com uma
eficácia de carregamento de aproximadamente 54 e 80%,
respectivamente. A laponita, devido à sua estrutura
empilhada, à distribuição de cargas na superfície e à
ausência de impurezas, tem sido comumente usada como
veículo de administração de medicamentos para a DOX.
O MMT, um dos nanosilicatos naturais mais estudados
para aplicações biomédicas, é quimicamente resistente,
estável em condições ácidas e possui uma capacidade de
inchaço considerável, o que o torna um potente veículo de
liberação controlada de medicamentos.55,56
Os hidrogéis e os andaimes foram usados de forma
independente nas últimas duas décadas, com suas próprias
vantagens e deficiências.57−59 Baixa resistência mecânica do
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pesquisa

Figura 1. (a) Representação esquemática da (a) estrutura óssea e sua composição variando de nanômetros a micrômetros e (b) desenvolvimento de
estruturas biomiméticas contendo as várias etapas para a preparação de um hidrogel/estrutura combinatória.
cerâmica Laponite Alginate/58S BG
eficiência de cicatrização óssea de cerca de 5-45%63,68−70 após 1
mês ou 10,6-29,2%69,70 após 2 meses. De fato, mesmo que os
requisitos mecânicos para a cicatrização óssea ideal sejam
atendidos
Nos estudos mencionados acima, eles não imitaram a complexa
arquitetura hierárquica do microambiente nativo, que contém
características que variam de nanômetros a micrômetros, bem
como a química combinatória dos depósitos minerais dentro do
osso nativo. Por esse motivo, eles resultaram em uma
cicatrização óssea abaixo do ideal. É importante ressaltar que
um dos desafios de longa data na engenharia de tecido ósseo, ou
seja, a indução de células progenitoras em direção à linhagem
osteogênica sem fatores de crescimento de diferenciação,
também não foi abordado nos estudos mencionados acima, e o
recrutamento e a estimulação de células nativas foram mínimos.
No entanto, e se fosse possível abordar todos esses problemas
criando um andaime de vários níveis semelhante ao nativo, que
consiste em uma fase inorgânica dura porosa (>400 μm) que
incorpora um ECM macio com depósitos em nanoescala na
forma de discos minerais (2 nm)? Além disso, e se a fase macia
pudesse induzir uma formação óssea recorde, recrutando células
nativas endógenas e estimulando-as em direção à linhagem
osteogênica? O objetivo geral deste estudo é exatamente esse,
algo que conseguimos com o uso de um novo suporte de
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(60SiO2 , 36CaO, 4P O25 mol %) que fornece uma fase pesquisa
mole e dura com a capacidade de recrutar e estimular as
células nativas a formar osso por meio da influência da
laponita (Figura 1).
Em comparação com os scaffolds não modificados, esse
novo scaffold levou a uma melhor diferenciação de
osteoblastos, expressão de proteínas relacionadas ao osso
e regulação positiva de genes osteogênicos, inclusive
colágeno tipo I alfa 1 (COL1A1), osteopontina (OPN) e
osteocalcina (OCN), mesmo na ausência de fatores de
diferenciação. Notavelmente, tanto a coloração
histológica quanto os ensaios imuno-histoquímicos
mostraram a alta capacidade dos andaimes sem células
implantados em um defeito ósseo da calvária de ratos para
promover a formação óssea, com uma cicatrização óssea
quase completa que atingiu aproximadamente 84%.
Portanto, dada a sua capacidade de modular a osteogênese
em um ambiente livre de fatores de crescimento e a alta
capacidade de formação óssea intimamente ligada a ela,
acreditamos que podemos ter finalmente descoberto uma
potencial combinação de ouro para reparar o tecido ósseo.

2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Materiais. O alginato de sódio (SA, A2158, Sigma-
Aldrich) e a laponita (BYK, EUA) foram utilizados como
materiais iniciais para a preparação da amostra. Nitrato de cálcio
tetra-hidratado (Ca(NO )32 -4H2 O), trietil

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ACS Applied Materials & Interfaces
fosfato, tetraetilortosilicato, ácido nítrico (HNO3 ), cloreto de cálcio
(CaCl2 ), álcool polivinílico (PVA), Triton X-100, Alizarin red S,
dexametasona, solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco
(DPBS) e Cell Counting Kit-8 (CCK-8) foram adquiridos da Sigma-
Aldrich. Diamidino-2-fenilindol (DAPI), solução salina tamponada
com fosfato
salina (PBS) pH = 7,4, tripsina-EDTA, soro fetal bovino (FBS),
penicilina-estreptomicina a 1%, soro de cavalo e meio essencial
mínimo de Eagle (EMEM) e meio de Eagle modificado de Dulbecco
(DMEM) foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific.
2.2. Preparação do andaime de hidrogel/BG
nanocompósito carregado de células. 2.2.1. Fabricação do
andaime de BG. O 58S BG foi sintetizado por meio do método sol-
gel, conforme descrito em nossa pesquisa anterior.15 Em resumo, uma
pasta homogênea contendo 40% em peso de BG
de etanol, 30 vol. de água deionizada e 5 wt. de PVA foi preparado após
mistura contínua em um agitador magnético a 1000 rpm a 40 °C por 5
h. Além disso, espumas de poliuretano (5 mm
× 5 mm × 5 mm) foram usados como modelos de sacrifício para fazer
o 2.4. Caracterização. 2.4.1. Microscopia eletrônica de varredura e
andaimes. As espumas foram mergulhadas em uma pasta BG estável,
retiradas e
secas durante a noite. Para sinterizar as redes BG, as espumas de
polímero foram tratadas termicamente a uma taxa de aquecimento de 2
°C/min em dois estágios diferentes usando um forno elétrico: (a) 450
°C/5 h (para queimar o modelo de sacrifício)71 e (b) 800 °C/5 h (para
consolidar e densificar a estrutura BG).
2.2.2. Preparação do hidrogel nanocompósito carregado de
células. Os hidrogéis nanocompostos carregados de células foram
preparados com alginato e laponita por meio de um projeto simples e
procedimento de mistura na presença de cloreto de cálcio.
Resumidamente, uma solução de estoque de alginato a 3% (p/v) foi
preparada misturando alginato em água deionizada usando um agitador
magnético. A laponita a 1% (p/v) foi misturada com água deionizada e
a solução foi agitada magneticamente durante a noite para dispersar e
formar uma solução de alginato.
esfoliar as folhas de laponita. Em seguida, a solução de laponita foi
lentamente
adicionado à solução de alginato e deixado misturar adequadamente
sob agitação constante em temperatura ambiente para atingir uma
concentração final de
1,5% (p/v). Por fim, as MSCs derivadas da medula óssea de ratos
(rBMSCs) foram encapsuladas nos hidrogéis de laponita-alginato a
1% (LH) em uma densidade de 1 × 106 células mL−1 misturando-as
com as soluções preparadas.
2.2.3. Combinação de hidrogel nanocompósito carregado de
células e andaime de reforço. A solução preparada de Laponita-
alginato carregada de células foi gentilmente injetada na BG porosa
hidrofílica para formar andaimes combinatórios de hidrogel de BG/
Laponita-alginato carregado de células a 1% (BGH). Para reticular os
hidrogéis carregados de células dispensados em
o BG, foi usado um procedimento de reticulação iônica. Isso foi feito
mergulhando-se os andaimes combinatórios carregados de células por
15 minutos em solução de cloreto de cálcio a 2% (CaCl2 ). Após a
reticulação, todas as amostras foram lavadas com DPBS três vezes e, em
seguida, transferidas para uma placa de 24 poços
preenchidos com um meio completo. Por fim, as amostras foram
incubadas a 37 °C em uma incubadora úmida com 5% de CO2 para
estudos posteriores. Um esquema do processo de fabricação é
apresentado na Figura 1.
No total, para todos os experimentos, três categorias de amostras
foram fabricadas e codificadas da seguinte forma: BG, LH carregado de
células e BGH referiam-se ao suporte BG, hidrogel de laponita-alginato
1% carregado de células e
andaime BG combinatório/hidrogel de alginato de laponita a 1%
carregado de células,
respectivamente.
2.3. Cultura de células in vitro. As rBMSCs foram usadas nas
passagens 3-4 e cultivadas em DMEM suplementado com 10% (v/v)
de FBS e 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina em uma
incubadora a 37 °C com 5% de CO2 . A solução contendo as células foi
misturada com um meio completo, transferida para uma placa de
cultura de células e incubada a 37 °C em uma estufa úmida.
5% CO2 incubadora. Quando as células aderentes se tornaram 80-90%
confluentes, elas foram subcultivadas com uma solução de tripsina
21481
www.acsami.org Artigo de
pesquisa
Os três grupos de andaimes foram colocados em uma placa de 24 poços
e incubados com 500 μL d e meio completo. O grupo BG foi colocado
na placa de
primeira fileira, e as células foram semeadas nelas em uma densidade de
1 × 106 células mL−1 ; os grupos de LH e BGH carregados de células,
nos quais as células foram encapsuladas, foram colocados na segunda e
terceira fileiras,
respectivamente, e a quarta linha foi atribuída ao grupo TCP no qual as
células foram semeadas na placa de poços de cultura. O meio de cultura
foi trocado por um meio completo (-) ou de diferenciação
(+) a cada 2 dias.
Para os ensaios de diferenciação osteogênica (ou seja, atividade e
coloração de fosfatase alcalina (ALP), Alizarin red S), as células em
uma densidade maior de
2 × 106 células mL−1 por hidrogel e suporte foram semeadas em
e encapsulados em hidrogéis em um meio de diferenciação
composto por DMEM suplementado com FBS, dexametasona, 1β-
glicerofosfato, ascorbato-2-fosfato e antibióticos. Os andaimes que
foram cultivados em meios de crescimento e diferenciação foram
considerados como amostras negativas e positivas, respectivamente.
análise de raios X com dispersão de energia. A morfologia e a
microestrutura dos scaffolds liofilizados foram observadas por meio de
microscopia eletrônica de varredura (MEV: um FEI Quanta 200)
equipada com um espectrômetro de raios X por dispersão de energia
(EDX). Os
Os andaimes foram lavados em PBS três vezes, congelados a -80 °C e liofilizados
As amostras foram então pulverizadas com ouro (10 nm) e
observados no MEV. A distribuição elementar nos scaffolds foi avaliada
pelo espectrômetro EDX.
2.4.2. Análise de porosidade. A porosidade do andaime foi calculada usando
o princípio de Arquimedes. Os andaimes foram retirados em triplicata em
um tamanho de 10 × 10 × 10 mm3 e imersos em água deionizada.
Porosidade
(P) foi definido como eq. 1.
ijW Wd yz
P = jt z × 100%
jk z{ (1)
Wt Ws
aquecida. Em
Em seguida, elas foram lavadas duas vezes com PBS aquecido e, em seguida,
foi adicionada a solução de tripsina, seguida de incubação por 3 minutos. Para
cultura de células adicional, as células destacadas foram cultivadas em meio de
crescimento na placa de cultura em uma densidade adequada. Antes da
semeadura das células, os andaimes foram esterilizados com etanol 70% sob
luz ultravioleta por 2 horas e, em seguida, lavados três vezes com PBS estéril.
Em geral, para cada teste celular, foram considerados os quatro grupos a
seguir: (1) BG, (2) LH carregado de células, (3) BGH e (4) placa de
poliestireno para cultura de tecidos (TCP) considerada como grupo de
controle. Todos os
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ACS Appl. Mater. Interfaces 2023, 15, 21476-21495
em queACS Wd éApplied
o peso Materials & Interfaces
seco dos andaimes, Ws é o peso dos www.acsami.org Artigo de
andaimes suspensos em água e Wt é o peso dos andaimes pesquisa
saturados com água.
2.4.3. Análise de difração de pó por raios X. Para identificar os elementos
inorgânicos
e determinar a natureza cristalina de BG e BG, seus padrões de
difração de raios X foram registrados após a sinterização da
amostra usando
um difratômetro de raios X (Philips PW3040/60) com uma
fonte de radiação Cu Kα (λ = 1,5405 Å) na faixa de 2θ = 10-
80° em um tamanho de passo de 0,02°. A cristalinidade das
amostras foi determinada pela divisão das áreas integradas dos
picos cristalinos pelas áreas integradas totais sob
os picos de difração de raios X (XRD). Além disso, a composição
de fase dos andaimes testados in vitro, bem como dos andaimes
antes e depois da imersão em SBF, foi avaliada pela análise de
XRD usando as condições de aquisição mencionadas
anteriormente.
2.4.4. Análise de espectroscopia de infravermelho com transformada de
Fourier. Análise de infravermelho por transformada de Fourier
A espectroscopia de infravermelho com transformada (FTIR,
PerkinElmer Frontier, EUA) foi usada para confirmar os grupos
funcionais químicos da laponita e do alginato no BGH. Os
espectros de transmitância do hidrogel liofilizado, do andaime
BG e do andaime combinatório carregado com
do hidrogel de laponita-alginato foram registrados a 4000-500 cm−1 .
2.4.5. Avaliação da liberação de íons. Para estudar o perfil de liberação de
íons
incluindo Ca, P, Si, Mg, Li e Na de BG e BGH até 28 dias de
imersão em solução SBF, foi usada a espectroscopia de emissão
óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES, Varian,
Vista-MPX). A
As amostras foram mantidas em frascos de polietileno contendo
SBF em uma incubadora a 37 °C em condições estáticas, e a
liberação de íons foi avaliada em 1, 3, 5, 7, 14, 21 e 28 dias. A
relação massa/volume foi de 1,5 mg mL−1 . A concentração de
íons foi determinada pela análise de alíquotas das várias soluções
coletadas em cada momento
ponto.
2.4.6. Medidas reológicas. As propriedades reológicas,
incluindo o módulo de armazenamento (G′) e a viscosidade da
solução de alginato de laponita a 1% (LA), foram avaliadas
antes e depois da aplicação da solução.
reticulação com 2% de CaCl2 por 3 min por um reômetro (TA
Instrument, EUA) suplementado com geometria de placa (25
mm de diâmetro) com uma distância de lacuna de 200 μm. O
módulo de armazenamento (G′) foi medido

21482 https://doi.org/10.1021/acsami.3c01717
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ACS Applied Materials & Interfaces
Tabela 1. Sequências de primers de qRT-PCR para ratos
gene primer forward
COL1A1 GAATATGTATCACCAGACGCAG AGCAAAGTTTCCTCCAAGAC
OPN GAGGAGAAGGCGCATTACAG GTCATCGTCGTCGTCATCAT
OCN GAGGGCAGTAAGGTGGTGAA GTCCGCTAGCTCGTCACAAT
GAPDH GAAACCTGCCAAGTATGATGAC CATTGTCATACCAGGAAATGAGC
usando o teste de varredura de tempo, e as propriedades de afinamento
por cisalhamento foram investigadas usando testes de varredura de
fluxo, monitorando a curva de viscosidade versus taxa de cisalhamento
sob condições de frequência de 1 Hz e uma taxa de cisalhamento
de 0,1-102 s−1 a 25 °C.
2.4.7. Caracterização mecânica. As propriedades de compressão
dos andaimes foram investigados usando uma máquina de teste
universal (Santam, stm20, Coreia) equipada com uma célula de carga
de 100 N a uma taxa de 1 mm s−1 . Os andaimes com dimensões de 10
× 10 × 10 mm3 foram
testados em temperatura ambiente, tanto no ar (seco) quanto em
condições úmidas.
Assim, antes do teste de compressão, os andaimes foram reidratados
com PBS durante a noite a 37 °C para condições úmidas. A resistência à
compressão e o módulo de Young dos scaffolds foram determinados
pelo método
teste de compressão usando pelo menos três réplicas. A resistência à
compressão dos corpos de prova foi calculada dividindo-se a força
máxima aplicada pela área da seção transversal, e o módulo de Young
foi
determinada como a inclinação de uma curva de tensão-deformação
em (0-0,1 do total de
strain).
2.4.8. Avaliação da degradação in vitro. Para estudar o
comportamento de degradação, os três grupos de scaffolds
desenvolvidos, incluindo BG, LH e BGH (n = 3 amostras por grupo),
foram imersos em PBS (pH 7,4)
e incubadas a 37 °C por 30 dias. O peso inicial (Wi ) do
foi registrado. Após os períodos de incubação, os andaimes
foram removidos do PBS, enxaguados com água deionizada e secos ao
ar em temperatura ambiente. O peso seco final dos andaimes (Wf ) foi
medido em cada momento. Por fim, a perda de peso (%) de cada grupo
foi quantificada conforme a eq. 2.
jiWi Wf
zy
Perda de peso (%) = j
j zz × 100
k Wi { (2)
2.5. Estudos de citocompatibilidade. 2.5.1. Ensaio de
coloração de vivo/morto. A viabilidade celular foi avaliada
quantitativamente usando o ensaio vivo/morto (Thermo Fisher, EUA)
após 1, 7 e 14 dias de cultura de células. Após o enxágue três vezes em
PBS, os andaimes foram incubados por 45 minutos em DMEM
suplementado com 2 mM de calceína AM e 4 mM de homodímero de
etídio-1. Um microscópio confocal de varredura a laser (TE2000-S,
Nikon, Tóquio, Japão) foi usado para registrar imagens das células
coradas após a lavagem dos andaimes com PBS três vezes. As células
verdes foram consideradas vivas, enquanto as vermelhas foram
consideradas mortas. Por fim, a porcentagem de células viáveis em
relação ao número total de células encontradas em cada imagem foi
calculada para determinar a viabilidade celular (%).
2.5.2. Morfologia celular. Morfologia e adesão de células dentro de
os três grupos de andaimes foram observados por MEV. A incubação
dos andaimes por 7 dias foi seguida pela fixação das células com
solução de glutaraldeído a 2,5% (Sigma-Aldrich), seguida por 10
minutos de desidratação com etanol (30, 50, 75, 90 e 100%). Um
processo de liofilização de 24 horas foi realizado nos andaimes. Por fim,
um microscópio eletrônico de varredura FEI Quanta 200 foi usado para
observar os andaimes revestidos de ouro.
Os núcleos das células incubadas foram visualizados por meio de
coloração fluorescente com diamidino-2-fenilindol (DAPI). Em
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pesquisa
primer reverso tamanho do número de registro
produto (bps)
186 NM_053304.1
198 XM_008769996.2
135 NM_013414.1
200 NM_017008.4
Os andaimes foram avaliados em pelo menos quatro imagens por
andaime e analisados com o software ImageJ.
2.5. 3. Coloração imunocitoquímica. Após 21 dias de tratamento in vitro
Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas com
paraformaldeído a 4% por 20 minutos a 4 °C. As células foram
incubadas em TritonX-100 a 0,3% em PBS por 30 minutos e, em
seguida, bloqueadas com BSA a 1%
em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, a
coloração de osteopontina (OPN) e osteocalcina (OCN) foi realizada
incubando-se os andaimes contendo células fixadas com anticorpos
primários, anti-OPN (ab8448, 1:100; Abcam) e anti-OCN (ab13418,
1:100;
Abcam) diluído em PBS contendo overnight a 4 °C. Após três vezes
Lavados com PBS, os andaimes foram incubados na solução secundária de
(conjugado com farinha Alexa 488, 1:150; Abcam) em temperatura
ambiente por 1 hora em um local escuro. As amostras foram
novamente lavadas com PBS três vezes e, por fim, os núcleos foram
corados com uma solução de DAPI diluída a 1:500. As amostras foram
lavadas com PBS três vezes, e as imagens foram capturadas e analisadas
em um microscópio fluorescente (Olympus Corporation, Tóquio,
Japão).
2.5.4. Análise de PCR em tempo real. Para analisar quantitativamente a
diferenciação osteogênica de rBMSCs em andaimes de BG, LH
carregado de células e BGH, a PCR em tempo real (RT) foi realizada
no 14º dia. Para isso, a expressão do gene dos marcadores osteogênicos
ósseos, inclusive colágeno tipo I alfa 1 (COL1A1), osteopontina
(OPN) e osteocalcina (OCN), foi avaliada pelo ensaio da técnica de
RT-PCR. Em resumo, o RNA total foi isolado das células cultivadas em
andaimes usando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA) e depois
sintetizado em cDNA de acordo com as instruções usando o
PrimeScript RT Master Mix.
A RT-PCR foi realizada para determinar a expressão em nível de gene de
COL1A1, OPN, OCN e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(GAPDH) como gene de manutenção (Tabela 1), usando o método
SYBR
resumo, os andaimes foram lavados três vezes com PBS após 14 dias de
cultura de células e, em seguida, fixados em uma solução de formaldeído a 4%
(Thermo Fisher, EUA) por 15 minutos em temperatura ambiente. Para
permitir a permeabilização da membrana, os andaimes foram incubados em
PBS contendo 0,1% (v/v) de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) por 10 minutos.
Depois disso, os
Os andaimes foram enxaguados duas vezes com PBS e incubados em solução
de DAPI em um estado escuro a 37 °C por 30 minutos, seguidos de três
lavagens suaves com DPBS, e as imagens foram obtidas com um laser confocal
microscópio de varredura (Nikon TMS). Contagem de núcleos dentro do
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Green ACS PCRApplied
master Materials
mix (Applied Biosystems Life
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Technologies). Todas as amostras foram testadas em triplicata, e pesquisa
os níveis de expressão de todos os genes foram normalizados em
relação ao GAPDH e medidos usando o
comparativo 2−ΔΔCt método. As sequências dos primers usados neste
estão listados na Tabela 1.
2.5.5. Coloração e atividade de ALP. A coloração de ALP foi
realizada para determinar a atividade intracelular de ALP das
rBMSCs usando uma solução de BCIP/NBT (5-bromo-4-cloro-
3-indolil fosfato/nitro azul de tetrazólio, Thermo Scientific,
EUA). Resumidamente, após 14 dias de cultura de células, os
andaimes foram removidos e lavados duas vezes com PBS,
corados com BCIP/NBT e incubados no escuro em temperatura
ambiente por 2 h. A reação foi então interrompida descartando-
se o excesso de solução de coloração BCIP/NBT e enxaguando
suavemente três vezes com PBS. As imagens foram tiradas em
um microscópio óptico. A expressão de ALP foi determinada a
partir da área circundada pelas células coradas de roxo.
Além disso, para confirmar a diferenciação osteogênica que
foi indicada pela coloração de ALP, a atividade de ALP das
rBMSCs foi testada usando o kit de ensaio de ALP (ab83369,
Abcam, Reino Unido). Após 7 e 14 dias de indução osteogênica
das CTMs nos suportes, elas foram lavadas suavemente três
vezes com PBS. Os suportes foram
primeiro tratadas com uma solução de citrato de sódio 1,6 M por 2 h a 37 °C
para
degradar os hidrogéis, rompendo as ligações cruzadas iônicas e, em seguida
permeabilizados em um tampão Tris 10 mM contendo uma
solução de Triton X-100 a 0,1% em temperatura ambiente. Em
seguida, a solução foi centrifugada por 2 minutos a 4 °C. Em
seguida, 50 μL do sobrenadante foram misturados
com 100 μL de lisados e adicionados a cada poço contendo 50 μL de
pNPP preparada usando um kit ALP (Sigma-Aldrich) e
incubada a 37 °C por 2 h. A conversão de p-nitrofenil fosfato em
p-nitrofenol foi avaliada medindo-se o
absorbância (OD) da solução de amostra reagida a 405 nm
usando um leitor de microplacas Tecan Infinite M2000.

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pesquisa

Figura 2. Análise microestrutural, química, mecânica e de degradação. (a) Imagens de SEM de poros e estruturas de suporte de BG. (b) Imagens
ópticas e de MEV do andaime de BGH desenvolvido. (c) Porosidade média dos scaffolds BG, LH e BGH. (d) Padrões XRD do pó de BG e BG. (e)
Espectros FTIR do BG, LH e BGH desenvolvidos. (f) Concentração de minerais liberados, incluindo Ca2+ , SiO44− e PO43− da BG e BGH, como
bem como a liberação de Mg2+ e Li+ do LH. (g) Resistência à compressão e módulo de compressão de BG, LH e BGH em condições úmidas e secas.
(h) Degradação in vitro dos três grupos após 30 dias em PBS. Significado estatístico: *p < 0.05.
protegido da luz.
2.5.6. Coloração com Alizarin Red S e Ensaio Quantitativo. A
deposição de cálcio foi examinada por meio da coloração de rBMSCs
cultivadas em três grupos de estruturas após 2 e 3 semanas de cultura
com Alizarin Red S (ARS). Em resumo, os suportes foram fixados em
paraformaldeído a 4% por 15 minutos. Em seguida, os andaimes foram
enxaguados em PBS duas vezes, seguido pela adição de solução de
vermelho de alizarina S a 1% por 30 minutos em um ambiente
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em temperatura ambiente. Após a coloração, os andaimes foram pesquisa
lavados repetidamente com PBS para remover qualquer cor
adicional, e os nódulos mineralizados após 3 semanas de cultura
foram então fotografados usando um microscópio óptico. Além
disso, a deposição de cálcio foi quantificada pela coloração ARS.
Cloreto de cetilpiridínio a 10% (Sigma- Aldrich Co., EUA) foi
adicionado aos andaimes por 15 minutos em temperatura
ambiente

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temperatura para extrair a coloração. Por fim, a absorbância (OD) foi
medido a 562 nm usando um leitor de microplacas (Tecan Infinite
M2000). Todos os valores de dados são definidos como média ±
desvio padrão (DP) (n = 5).
2.5.7. Mineralização in vitro. A bioatividade in vitro dos suportes
foi examinada pela taxa de capacidade de formação de apatita durante
sua imersão em fluido corporal simulado (SBF). A solução de SBF foi
preparada de acordo com o procedimento de Kokubo.21 Os três grupos
de scaffolds, incluindo BG, LH e BGH, foram imersos em SBF por até
14 dias e, em seguida, removidos da solução SBF, lavados com água
deionizada e liofilizados por 48 h. Por fim, a formação de apatita na
superfície dos scaffolds foi caracterizada usando SEM, XRD e FTIR.
2.5.8. Regeneração óssea in vivo. Os experimentos com animais
foram
realizado em um modelo de defeito ósseo na calvária de ratos para
avaliar a capacidade potencial de vários suportes para promover a
regeneração óssea in vivo. Todos os experimentos com animais foram
aprovados e realizados de acordo com as normas para experimentos
com animais do Comitê de Ética Animal da Universidade Tarbiat
Modares. As cirurgias foram realizadas em 12 ratos Wistar saudáveis,
machos, com 8 semanas de idade, pesando 250 g, obtidos do Instituto
Pasteur do Irã. Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro
grupos: (1) grupo de controle (defeitos vazios), (2) BG sem células,
(3) LH e (4) andaimes de BGH (três animais/grupo). O
procedimento cirúrgico foi realizado primeiramente com a anestesia
dos animais por meio de uma injeção intramuscular de duas partes
[cetamina (100 mg/mL) com xilazina (1%)], seguida de raspagem e
desinfecção das regiões de implantação. Em seguida, foi feita uma
incisão na pele e um defeito circular com 5 mm de diâmetro foi criado
no crânio esquerdo de cada rato usando uma broca de trefina, onde os
andaimes foram implantados. Todos os grupos, exceto o grupo de
controle, foram implantados no defeito calvarial e, por fim, as feridas
foram suturadas com pontos. Os animais foram sacrificados após 8
semanas de implantação usando asfixia com CO2 e as calvárias foram
recuperadas para análise posterior.
2.5.9. Coloração histológica e imuno-histoquímica. O
As amostras de calvária colhidas foram fixadas com paraformaldeído a
4% por 48 horas a 4 °C e, em seguida, desidratadas com uma série
gradual de etanol. Em seguida, as amostras foram descalcificadas
usando 0,5 M de etil-
ácido enediaminotetracético (EDTA) por 2 semanas e incorporados
em blocos de parafina. Foram preparadas seções de parafina com 5 μm
de espessura
usando um micrótomo para demonstrar o defeito com o
regeneração óssea. Em seguida, as lâminas foram coradas com
hematoxilina-eosina (H&E) e tricrômio de Masson e visualizadas em
um microscópio óptico.
microscópio. Para quantificar o osso recém-formado, as imagens
histológicas foram avaliadas pelo ImageJ com base na diferença do
limiar, e a área média do osso recém-formado em relação à área total
em cada grupo foi determinada. Para a coloração imuno-histoquímica,
as amostras foram lavadas com PBS, seguidas de permeabilização com
Triton X-100 a 0,3% por 30 minutos e, em seguida, bloqueadas com
BSA a 10% em temperatura ambiente por 30 minutos antes de serem
incubadas com anticorpos primários, incluindo osteopontina (OPN,
ab8448, 1:100; Abcam) e osteocalcina
(OCN, ab13418, 1:100; Abcam) a 4 °C durante a noite. Depois de ser
lavadas com PBS, o anticorpo secundário (Alexa flour 488-
conjugado, 1:150; Abcam) foi aplicado por 1:30 h em temperatura
ambiente. Em seguida, as amostras foram lavadas com PBS três vezes
em um local escuro, e os núcleos foram corados com DAPI, seguido de
lavagem com PBS. Por fim, as amostras foram observadas em um
microscópio fluorescente (Olympus Corporation, Tóquio, Japão) e
analisadas com o software ImageJ para quantificar a área de reação
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www.acsami.org Artigo de
pesquisa
3. RESULTADOS
3.1. Caracterização microestrutural. É importante
considerar um tamanho de poro de cerca de 300 μm em
combinação com alta interconectividade e porosidade no
projeto do andaime, pois eles podem permitir a troca eficiente
de nutrientes e resíduos e, o mais importante, facilitar a
vascularização. Sem isso, um núcleo necrótico se desenvolverá
com o tempo, levando à falha do implante.72,73 Por esse motivo, a
superfície e a seção transversal dos nossos suportes foram
caracterizadas com MEV e mostradas na Figura 2a,b. As
imagens de MEV mostram estruturas porosas com poros
abertos interconectados, tamanhos de poros homogêneos e
suportes. O tamanho médio dos poros do andaime BG foi de
foi de cerca de 451,7 ± 40 μm, enquanto a do hidrogel de
alginato de laponita a 1% (LH) e do andaime combinatório de
BG/1% de hidrogel de alginato de laponita (BGH) foi de
110,6 ± 35 e 414,3 ± 20 μm,
respectivamente. Pelas imagens, também podemos ver que o
LH foi carregado com sucesso no suporte de BG mais duro.
Além disso, a imagem do MEV indicou que a integridade
estrutural, a interconectividade e a porosidade observadas da
BG também prevaleceram aqui. Além disso, as porosidades da
BG e da BGH medidas pelo método de Arquimedes são
mostradas na Figura 2c. Aqui, a BG
apresentou uma porosidade de cerca de 92,5 ± 3,5%, enquanto
a porosidade do LH diminuiu para 82 ± 3,7% e a do BGH para
79 ± 2,8%. A queda observada no BGH provavelmente está
relacionada à menor porosidade do BGH.
poroso do composto de LH que o preenche. Em resumo,
podemos concluir que os sistemas de andaimes empregados
aqui são suficientemente porosos e interconectados e, portanto,
não são um fator comprometedor no processo de regeneração
de tecidos.
3.2. Análise química. A natureza cristalográfica do BG
foi determinado usando XRD e é exibido na Figura 2d. O pó de
BG mostrou uma estrutura amorfa caracterizada por uma banda
larga entre 15 e 30°.15 O padrão XRD do pó de
Por outro lado, o andaime BG tratado termicamente mostrou uma
estrutura semicristalina com um valor de cristalinidade de
52,3%, conforme calculado a partir dos dados de XRD e com
picos de difração em valores 2θ de 30, 32 e 37°. Esses picos
coincidem com o padrão de difração conhecido do silicato
dicálcico (Ca2 SiO4 ).74 Portanto,
A natureza cristalina da BG é feita principalmente de Ca SiO . 4
2
positiva.
2.6. Análise estatística. A análise estatística foi realizada com o software
GraphPad Prism 6. As barras de erro são representadas como média ± SD.
Todas as amostras foram testadas em triplicata, salvo indicação em contrário.
Estatísticas
A comparação foi examinada por meio de uma análise de variância (ANOVA)
unidirecional, seguida por um teste post hoc de Tukey. Por fim, a significância
estatística foi determinada como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 e ****p <
0.0001.
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A partirACS Applied
da análise do Materials
espectro de&FTIR,
Interfaces
observamos que www.acsami.org Artigo de
o BG apresentou picos característicos de vibrações de pesquisa
flexão e alongamento de Si-O-Si em 467 cm−1 e 819 e
1067 cm−1 , respectivamente (Figura 2d). Além disso, a
presença de vibrações de flexão P-O foi explicada por um
pico em 570-620 cm−1 .75 Em geral, isso, juntamente com
os dados de XRD, confirma que o
A estrutura química da BG é dominada por cálcio, silicato
e fosfato - mineralitos essenciais para garantir um alto
bem-estar ósseo. Por outro lado, a presença de Laponita
A presença de LH foi confirmada pelos picos de 640 e 984
cm−1 , que estão associados às vibrações de Mg-O e às
bandas de estiramento de Si-O, respectivamente. Os
picos relacionados ao alginato também foram observados
em 1411 e 1594 cm−1 , que correspondem às bandas de
estiramento de
vibrações de alongamento simétricas e assimétricas de
ligações de carboxilato (COO-), respectivamente. Um
amplo pico de vibração de estiramento O-H
correspondente ao grupo hidroxila dos alginatos também
foi observado em 3200-3600 cm−1 .76−79 Por fim, a análise
de FTIR do BGH mostrou que os picos relacionados às
ligações de carboxilato (COO-) do alginato se deslocaram
para uma posição mais alta em relação ao grupo hidroxila
do alginato.
comprimentos de onda em 1416 e 1601 cm−1 (Figura 2e). Isso pode ser
devido às interações dos grupos carboxílicos do alginato com o
grupos de sílica da Laponita, levando à formação de
ligações de hidrogênio (Si-O-Si) na BGH. Além disso, a
combinação de BG e LH foi confirmada pela presença de
picos sobrepostos

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