UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO BIOLOGIA ANIMAL

Efeitos da Aflatoxina B1 nos Modelos de Culturas e Co-culturas

Celulares Caco-2 e Caco-2/HT29-MTX-E12

Inês Belchior Serrenho

Mestrado em Biologia Humana e Ambiente

Dissertação orientada por:

Doutora Paula Alvito (orientadora externa)
Professora Doutora Deodália Dias (orientadora interna)

2022
Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todos, que de uma maneira ou de outra, contribuíram para a realização
desta tese. Muito obrigada!

Em primeiro lugar, quero agradecer à minha orientadora Paula Alvito por ter tornado possível esta
oportunidade e pela enorme disponibilidade e paciência para me ensinar todas as técnicas necessárias,
que me permitiram evoluir enquanto investigadora. Este tema foi um grande desafio onde aprendi
imenso e que me deu uma enorme satisfação de o desenvolver. Muito obrigada pela confiança, pelos
desafios propostos e por todo o apoio!

À professora Deodália Dias, que como orientadora interna esteve sempre disponível para me ajudar
em tudo o que necessitei. Um enorme obrigada!

Ao Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo e às Coordenadoras do Departamento de Alimentação

e Nutrição e da Unidade de Investigação e Desenvolvimento Isabel Castanheira e Helena Soares Costa,
respetivamente, por terem permitido o desenvolvimento da minha tese no departamento!

Aos membros do Departamento de Genética Humana: Henriqueta Louro, Nádia Vital, Joana Pereira,
Dora Rolo, Paulo Matos e Peter Jordan e à Andreia Rego do Departamento de Alimentação e Nutrição
por todo o apoio, pois não teria sido possível realizar este trabalho sem a vossa ajuda. Muito obrigada!

Ao projeto earlyMYCO, onde esta tese está inserida, por ter proporcionado esta oportunidade única,
à Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) pelo financiamento com fundos nacionais relativos ao
projeto earlyMYCO (PTDC/MEDTOX /28762/2017) e ao CESAM
(UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020+ LA/P/0094/2020).

À Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, que foi a minha segunda casa durante os
5 anos de Licenciatura e Mestrado onde aprendi imenso e criei recordações que não vou esquecer.

A todos os meus amigos, principalmente à Mafalda que conviveu com as minhas maluqueiras e
dramas quase 24 h por dia durante estes 5 anos de licenciatura e mestrado, temos memorias que vão
ficar para sempre! À Leonor por ser sempre a minha parceira de crime durante estes 5 anos. Tornaste-
te uma grande amiga durante esta aventura e sem ti tinha sido tudo muito mais difícil, nunca me vou
esquecer das nossas horas de almoço e das aventuras no laboratório das moscas (Pika Pika!!) e à Matilde
que já nos conhecemos desde o tempo das fraldas e continuamos aqui para o que der e vier! Muito
obrigada por todo o apoio!!

E por último, à minha família, em especial mãe, pai e avó, um grande obrigada por me terem
dado a oportunidade de estudar e chegar até aqui, pelo apoio incondicional ao longo destes anos e por
nunca me deixarem desistir dos meus sonhos!

II
Resumo

As micotoxinas são toxinas naturais presentes maioritariamente nos alimentos sendo produzidas
por várias espécies de fungos (Aspergillus, Fusarium e Penicillium). A aflatoxina B1 (AFB1) é o
carcinógeno hepático mais potente conhecido em mamíferos, sendo classificada pela IARC no Grupo 1
(carcinogénico para humanos). A exposição a AFB1 pode afetar a população em geral, existindo um
interesse crescente dos seus efeitos deletérios no trato gastrointestinal, dado as células epiteliais do
intestino constituírem a primeira linha de defesa do organismo humano. Existem poucos dados
disponíveis sobre o efeito de AFB1 no muco, uma importante barreira de proteção intestinal, sendo
importante desenvolver estudos sobre os efeitos desta micotoxina em culturas de células intestinais
produtoras de muco, o que não foi efetuado até ao momento. O objetivo deste trabalho consistiu no
desenvolvimento de um estudo comparativo sobre os efeitos da AFB1 em culturas de células Caco-2 e
co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 (produtoras de muco). Utilizou-se várias metodologias in vitro
incluindo um ensaio de citotoxicidade de AFB1; monitorização do crescimento/polarização da
monocamada das células; ensaio de transporte da micotoxina através da membrana intestinal com
verificação da integridade das células expostas através da resistência elétrica transepitelial (TEER) e
microscopia de imunofluorescência confocal para avaliação da morfologia das células. Os resultados
demonstraram que ambas as linhas celulares foram adequadas para a realização de estudos de exposição
a micotoxinas. Verificou-se que a AFB1 afetou a integridade da membrana celular, existindo uma
diminuição da TEER em função do tempo de exposição e alterações na morfologia das células expostas,
em ambas as linhas celulares. Concluiu-se assim que o modelo de co-cultura mimetizou melhor as
condições do intestino humano e evidenciou-se a ação da AFB1 na integridade das células da barreira
intestinal. Nas co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 os efeitos da AFB1, não foram tão evidentes,
demonstrando-se assim o papel fundamental do muco enquanto barreira protetora.

Palavras-Chave: Aflatoxina B1, Células Caco-2, Células Caco-2/HT29-MTX-E12, Integridade

Intestinal, Citotoxicidade

III
Abstract

Mycotoxins are natural toxins present mostly in food and are produced by several species of
fungi (Aspergillus, Fusarium and Penicillium). Aflatoxin B1 (AFB1) is the most potent liver carcinogen
known in mammals and is classified by the IARC in Group 1 (carcinogenic to humans). Exposure to
AFB1 can affect the general population, and there is a growing interest in its deleterious effects on the
gastrointestinal tract, given that intestinal epithelial cells constitute the first line of defense of the human
organism. There are few data available on the effect of AFB1 on mucus, an important intestinal
protective barrier, thus it is important to develop studies on the effects of this mycotoxin on cultures of
intestinal mucus-producing cells, which has not been done so far. The objective of this work was to
develop a comparative study on the effects of AFB1 in Caco-2 cell cultures and Caco-2/HT29-MTX-
E12 co-cultures (mucus producing cells). Various in vitro methodologies were used including an AFB1
cytotoxicity assay; growth/polarization monitoring of cell monolayers; mycotoxin transport assay
through the intestinal membrane with evaluation of the integrity of exposed cells through transepithelial
electrical resistance (TEER) and confocal immunofluorescence microscopy to evaluate cells
morphology. The results showed that both cell lines were suitable for performing mycotoxin exposure
studies. It was found that AFB1 affected the integrity of the cell membrane, with a decrease in TEER as
a function of exposure time and changes in the morphology of exposed cells, in both cell lines. It was
concluded that the co-culture model better mimicked the conditions of the human intestine, and it was
evidenced the action of AFB1 on the integrity of intestinal barrier cells. In the Caco-2/HT29-MTX-E12
co-cultures, the harmful effect of AFB1 on membrane integrity was not so evident, thus demonstrating
the fundamental role of mucus as a protective barrier.

Keywords: Aflatoxin B1, Caco-2 Cells, Caco-2/HT29-MTX-E12 Cells, Intestinal Integrity,

Cytotoxicity

IV
Publicações/Comunicações

Artigos Científicos:

1. Serrenho, I.; Assunção, R.; Alvito, P. Exposição do Trato Gastrointestinal à Aflatoxina B1: Um
Impacto Negligenciado? Boletim Epidemiológico Observações 2021, 30, 37–42. (Anexo 5)

Conferências Internacionais com apresentação de posters:

1. Serrenho, I.; Assunção, R.; Alvito, P. Exposure of the gastrointestinal tract to Aflatoxin B1: an
overlooked impact?. 4th Virtual Conference on Food Contaminants ICFC2021. (Anexo 5)

2. Serrenho, I.; Vital, N.; Rolo, D.; Louro, H.; Pereira, J.; Matos, P.; Jordan, P.; Alvito, P. Effect
of Aflatoxin B1 in both Caco-2 and Caco-2/HT29-MTX models. Final UNGAP meeting titled
“Intestinal absorption assessment and enabling formulations’’. (Anexo 5)

3. Alvito, P.; Assunção, R; Bastos-Amador, P.; Boevre, M.; Duarte, E; Martins, C.; Serrenho, I.;
Silva, I.; Visintin, L.; Ferreira, M. Early-life exposure to MYCOtoxins and its impact on
health – a case study. World Mycotoxin Forum 2022. (Anexo 5)

V
Índice
Agradecimentos......................................................................................................................................II
Resumo...................................................................................................................................................III
Abstract.................................................................................................................................................IV
Publicações/Comunicações...................................................................................................................V
Lista de figuras....................................................................................................................................VII
Lista de tabelas....................................................................................................................................VII
Lista de anexos.....................................................................................................................................VII
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos...........................................................................................VIII
1. Introdução..........................................................................................................................................1
1.1. Caracterização das micotoxinas.................................................................................................1
1.1.1. Características gerais e legislação......................................................................................1
1.1.2. Aflatoxina B1......................................................................................................................4
1.1.3. Análise e Quantificação das micotoxinas...........................................................................7
1.2. Estudos in vitro com culturas de células intestinais...................................................................9
1.2.1. Intestino e células epiteliais intestinais...............................................................................9
1.2.2. Células Caco-2..................................................................................................................11
1.2.3. Células HT29-MTX-E12..................................................................................................12
1.2.4. Co-culturas de células Caco-2/HT29-MTX-E12..............................................................13
1.2.5. Integridade da membrana celular.....................................................................................13
2. Objetivos.........................................................................................................................................15
3. Materiais e Métodos.......................................................................................................................16
3.1. Cultura das células Caco-2.......................................................................................................16
3.1.1. Diferenciação das células.................................................................................................16
3.1.2. Desenvolvimento da monocamada celular.......................................................................16
3.1.2.1. Dia 1: Cultura de células .........................................................................................16
3.1.2.2. Dias 2-21: Crescimento e polarização da monocamada celular..............................17
3.2. Ensaio da citotoxicidade por MTT...........................................................................................18
3.3. Ensaio de Exposição a AFB1 e Integridade da Membrana Celular..........................................19
3.4. Microscopia de Imunofluorescência Confocal.........................................................................20
3.5. Recolha de Amostras................................................................................................................21
3.6. Análise estatística.....................................................................................................................21
4. Resultados.......................................................................................................................................22
4.1. Desenvolvimento da monocamada celular e integridade da membrana celular.......................22
4.2. Ensaio da citotoxicidade por MTT...........................................................................................23
4.3. Ensaio de Exposição a AFB1 e Integridade da Membrana Celular..........................................25
4.4. Microscopia de Imunofluorescência Confocal.........................................................................27
5. Discussão.........................................................................................................................................29
5.1. Desenvolvimento da monocamada celular e integridade da membrana celular.......................29
5.2. Ensaio da citotoxicidade por MTT...........................................................................................29
5.3. Ensaio de Exposição a AFB1 e Integridade da Membrana Celular..........................................30
5.4. Microscopia de Imunofluorescência Confocal.........................................................................32
6. Conclusões.......................................................................................................................................33
7. Bibliografia.....................................................................................................................................35
8. Anexos.............................................................................................................................................41

VI
Lista de Figuras

Figura 1.1 – Distribuição mundial do risco de exposição a AFB1...........................................................5

Figura 1.2 – Metabolização de AFB1........................................................................................................6

Figura 1.3 – Análise de amostras por HPLC.............................................................................................8

Figura 1.4 – Análise de amostras por LC-MS...........................................................................................9

Figura 1.5 – Barreira Intestinal ..............................................................................................................10

Figura 1.6 – Células Epiteliais Intestinais ..............................................................................................11

Figura 1.7 – Medição TEER...................................................................................................................14

Figura 3.1 – Poço da placa Transwell.....................................................................................................17

Figura 3.2 – Ensaio MTT........................................................................................................................18

Figura 3.3 – Ensaio de Transporte..........................................................................................................20

Figura 4.1 – Integridade da monocamada celular...................................................................................23

Figura 4.2 – Viabilidade Celular............................................................................................................24

Figura 4.3 – Integridade da monocamada celular exposta a AFB1 (1,6 μM) durante 24 h ......................26

Figura 4.4 – Evolução da integridade após exposição a 1,6 μM de AFB1...............................................27

Figura 4.5 – Efeitos da AFB1 na morfologia das culturas e co-culturas celulares...................................28

Lista de Tabelas

Tabela 1.1 – Micotoxinas com maior relevância para a saúde humana.....................................................4

Lista de Anexos

Anexo 1 – Protocolo de contagem de células........................................................................................41

Anexo 2 – Monitorização dos valores da TEER ao longo dos 18-21 dias de desenvolvimento da
monocamada celular das culturas e co-culturas e respetiva estatística...................................................42

Anexo 3 – Tabelas dos ensaios MTT e respetiva estatística..................................................................44

Anexo 4 – Ensaio de Transporte: Valores da TEER após a exposição a AFB1 (comparação entre
placas).....................................................................................................................................................46

Anexo 5 – Publicações/Comunicações realizadas no âmbito do projeto EarlyMYCO..........................48

VII
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

AFB1 – Aflatoxina B1
AFB2 – Aflatoxina B2
AFBO - AFB1-8,9-Epóxido
AFG1 – Aflatoxina G1
AFG2 – Aflatoxina G2
AFL - Aflatoxicol
AFM1 – Aflatoxina M1
AFP1 – Aflatoxina P1
AFQ1 – Aflatoxina Q1
AFs - Aflatoxinas
AMPs - Peptídeos Antimicrobianos
BHE – Barreira Hematoencefálica
CE – Comissão Europeia
CYP - Citocromo P
CYP1A - Citocromo P1A
CYP3A4 - Citocromo P3A4
CYP450 - Citocromo P450
DAPI - 4',6'-diamino-2-fenil-indol
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido Desoxirribonucleico
DON - Desoxinivalenol
FB1 – Fumonisina B1
FBS – Soro bovino fetal
FDA - Food and Drug Administration
GIT – Trato gastro-intestinal
GSH - Glutationa
GSTs - Glutationa S-transferase
HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência
HPLC-FD - Cromatografia líquida de alta eficiência com deteção por Fluorescência
HPLC-UV - Cromatografia líquida de alta eficiência com deteção por Ultravioleta
IARC - Agência Internacional de Pesquisa em Cancro
JAMs - Moléculas de Adesão Juncional
LC-MS - Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espetrometria de massa
LC-MS/MS - Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espetrometria de massa tandem
mEH - Epóxido Hidrolase Microssomal
mRNA - Ácido Ribonucleico mensageiro
MTT - Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5 difenil tetrazólio
MTX - Metotrexato
MUC - Mucina
MUC2 – Mucina 2
MUC5AC – Mucina 5AC
MUC5B – Mucina 5B
NEAA – Aminoácidos não essenciais
OTA - Ocratoxina
PAT - Patulina
sIgA - Imunoglobulina A Secretora
TCTs - Tricotrecenos
TEER – Resistência Elétrica Transepitelial
UV - Ultravioleta
ZEN - Zearalenona
ZO-1 - Zonula occludente-1

VIII
α- ZOL – Alfa Zearalenol
β-ZOL – Beta Zearalenol

IX
1. Introdução

1.1. Caracterização das micotoxinas

1.1.1. Características gerais e legislação

As micotoxinas são metabolitos secundário produzidos por algumas espécies de fungos

filamentosos, nomeadamente os géneros Aspergillus, Fusarium e Penicillium. São consideradas
contaminantes naturais dos alimentos. A sua principal via de exposição é via alimentar (diretamente,
através do consumo de alimentos contaminados de origem vegetal, ou indiretamente, através do
consumo de alimentos de origem animal como carnes, ovos, leite e derivados) mas pode também ocorrer
exposição por inalação de esporos e por via dérmica [1–9]. As micotoxinas apresentam propriedades
tóxicas que provocam efeitos agudos ou crónicos, podendo provocar o aparecimento de doenças ou até
mesmo morte de seres humanos e animais. A toxicidade aguda encontra-se associada a uma resposta
rápida do organismo, geralmente exposto a doses elevadas da micotoxina, enquanto que a toxicidade
crónica resulta da exposição a baixas doses de micotoxina num longo período de tempo, originando
quadros clínicos complicados, como aparecimento de cancro e outros danos irreversíveis, devido à
bioacumulação no sangue ou órgãos de baixas doses da micotoxina, durante um longo período [1–3,5–
7,9]. Podem ainda afetar a homeostase intestinal, levando a uma diminuição da resistência a doenças
infeciosas através do comprometimento da integridade das células epiteliais intestinais, devido aos
danos causados nas proteínas de junção oclusiva. Desta forma podem induzir um aumento da
probabilidade de desenvolvimento de doenças inflamatórias intestinais e alergias alimentares,
particularmente em populações vulneráveis como é o caso de idosos, grávidas e crianças [1,3–6,10].

A exposição a micotoxinas através dos alimentos é considerada um fator importante em saúde

humana e animal, podendo a ingestão de alimentos contaminados causar danos em órgãos vitais como
o intestino e afetar o sistema imunológico, dependendo da estrutura química, concentração e grau de
exposição [1,2,4,6]. As micotoxinas possuem baixo peso molecular, podendo contaminar uma grande
diversidade de produtos alimentares (cereais, frutos, bebidas, café, produtos de origem animal e carnes)
e desenvolverem-se em diferentes condições ambientais, como por exemplo climas temperados e
tropicais. Estas toxinas naturais formam-se principalmente durante o armazenamento dos alimentos,
podendo também formar-se durante a produção e processamento, onde existem níveis de humidade e
oxigénio favoráveis para estimular o seu crescimento [3,6,8]. As micotoxinas que causam maior
preocupação em saúde pública e na segurança alimentar são as aflatoxinas (AFs), ocratoxina A (OTA),
tricotecenos (TCTs) (incluindo o deoxinivalenol (DON)), zearalenona (ZEN), fumonisina B1 (FB1) e
patulina (PAT. São quimicamente estáveis e por isso resistem aos métodos de processamento e
armazenamento mais utilizados. Muitas destas micotoxinas apresentam propriedades citotóxicas,
genotóxicas, hepatotóxicas, embriotóxicas, teratogénicas, carcinogénicas, neurotóxicas e
imunossupressoras [2,4,6–8].

Como forma de controlar os níveis de ocorrência nos alimentos e, desta forma, contribuir para
reduzir os níveis de exposição humana a estas micotoxinas, foram estabelecidos regulamentos a nível
mundial, incluindo o Regulamento (CE) Nº 1881/2006 da Comissão Europeia, de 19 de Dezembro de
2006, que estabelecem os teores máximos que podem estar presentes nos alimentos destinados a crianças
e adultos para as OTA, ZEN, PAT, FB1, DON, toxinas T-2 e HT-2 (tricotecenos) e as AFs (abordadas

1
no capitulo seguinte por serem o objetivo deste trabalho), visto serem este grupos que apresentam uma
maior importância para a saúde humana. [6,7,11–13].

No entanto é importante mencionar que para além das micotoxinas com regulamentação,
existem outras sem regulamentação e que podem constituir também um perigo para a saúde humana,
como as toxinas modificadas (metabolitos de micotoxinas que podem ser hidrolisados nos compostos
parentais mais tóxicos durante o processo digestivo como alguns metabolitos da DON), emergentes
(novas micotoxinas, micotoxinas que ocorrem pela primeira vez em novas regiões, micotoxinas pouco
estudadas, incluindo por exemplo, as eniantinas, beauvericina e alternariol, entre outras) e misturas de
micotoxinas e outros contaminantes [4,6,7,11,14]

As ocratoxinas, são produzidas por diversas espécies de fungos, Aspergillus e Penicillium. A

sua forma mais abundante é a ocratoxina A (OTA) que tem a sua estrutura química representada na
Tabela 1.1. e possui um tempo de semi-vida longo de 35 dias [3,4,6]. A OTA encontra-se presente em
diversos géneros alimentícios como cereais, café, vinho, uvas, chocolate, cacau, cerveja, carne de porco,
leite e derivados, especiarias e frutos secos. Para além disso também se encontra presente no leite
materno e no sangue [3,6]. Os seus efeitos de exposição incluem nefrotoxicidade, hepatotoxicidade,
imunossupressão e teratogenicidade, sendo classificada pela Agência Internacional de Pesquisa sobre o
Cancro (IARC) no grupo 2B, em que se incluem os compostos com possível atividade cancerígena para
humanos [4,6]. Estudos efetuados na área da toxicologia demonstraram que os rins e o trato
gastrointestinal são os órgãos alvo desta micotoxina, pois na sua presença verifica-se que a barreira das
células epiteliais intestinais é afetada ocorrendo redução das proteínas de junção oclusiva e verifica-se
a ocorrência de nefrite túbulo-intersticial crónica. Poderá ainda estar associada ao desenvolvimento de
tumores urinários [3,4].

A ZEN é produzida por diversos fungos do género Fusarium e a sua estrutura química está
representada na Tabela 1.1. Possui propriedades estrogénicas e pode ser encontrada em alimentos como
cereais incluindo milho, aveia, cevada, trigo e sorgo. Após a sua absorção, esta micotoxina é
metabolizada em alfa-zearalenol (α-ZOL) e beta-zearalenol (β-ZOL) [3,4,6,8]. Devido à inexistência de
evidências adequadas sobre os seus efeitos carcinogénicos em humanos, é incluída pela IARC no grupo
3 (compostos não classificáveis quanto à sua carcinogenicidade em humanos). No entanto é descrita
como disruptor endócrino de origem natural e tem a capacidade de provocar efeitos graves no sistema
reprodutor, pois compete pela ligação aos recetores de estrogénio, com as hormonas endógenas [3,4,6,8].
Apesar de o sistema reprodutor ser o alvo desta micotoxina, também existem outros efeitos conhecidos
como, por exemplo, a indução de efeitos citotóxicos, hepatotóxicos, hematotóxicos, imunotóxicos e
genotóxicos, que provocam danos oxidativos no DNA e apoptose celular e ainda alterações da barreira
das células intestinais, que conduzem a uma perturbação da sua permeabilidade [3,4].

A PAT, cuja estrutura química se representa na Tabela 1.1., é produzida por vários fungos dos
géneros Penicillium, Aspergillus e Byssochlamys, que são conhecidos como fungos destruidores da
fruta. Esta micotoxina tem sido detetada em alimentos como frutas, produtos hortícolas, cereais, frutos
de casca rija e queijo, sendo que a principal via de exposição é a alimentar, através da ingestão de maçãs
e produtos à base de maçãs contaminadas [2–4,6,15]. A PAT é altamente reativa com os grupos tióis de
proteínas, produzindo danos estruturais no DNA. Devido à falta de evidencia de efeitos carcinogénicos,
esta micotoxina é incluída no grupo 3 (compostos não classificáveis quanto à sua carcinogenicidade em
humanos), da IARC [2–4,6,12]. Os seus principais alvos são o trato gastrointestinal, onde provoca
distúrbios intestinais e o sistema imunológico, embora também existam evidências de sintomas agudos,
que incluem alterações renais, ulceração, convulsões, congestão pulmonar, edema e vómitos, enquanto

2
que os efeitos tóxicos incluem neurotoxicidade, imunotoxicidade, genotoxicidade e teratotoxicidade [2–
4,12,15]. A sua citotoxicidade é induzida pela formação de aductos covalentes com tióis celulares
essenciais (cisteína e glutationa), inibindo a atividade de muitas enzimas [2,4]. Sabe-se também que a
exposição a esta micotoxina provoca um comprometimento da integridade da barreira epitelial intestinal
através da destruição das proteínas de junção oclusiva, afetando assim a sua permeabilidade, e podendo
provocar um aumento do transporte de bactérias como a E. coli.[3,4,15].

As fumonisinas são um grupo de micotoxinas produzidas por fungos da espécie Fusarium que
contaminam habitualmente culturas de milho [3,6,8]. A principal representante deste grupo é a
fumonisina B1 (FB1), cuja sua estrutura química se encontra na Tabela 1.1. A FB1, está associada a um
aumento da prevalência de cancros no esófago em humanos [3,4,8]. Um dos seus efeitos característicos
é a redução da absorção do folato que provoca deformações no tubo neural durante a gestação devido a
uma exposição materna a esta micotoxina, sendo que em termos de efeitos carcinogénicos a micotoxina
FB1 está incluída no grupo 2B da IARC (possível atividade cancerígena em humanos) [4,6,8]. Esta
micotoxina é considerada hepatotóxica, nefrotóxica, carcinogénica e reprotóxica, sendo o fígado e os
rins os principais tecidos alvo [4]. No entanto, é reconhecido que o trato gastro intestinal é considerado
também um possível órgão alvo, visto que a exposição a FB1 compromete a integridade da barreira
intestinal e reduz a expressão das proteínas de junção oclusiva, afetando assim a permeabilidade que
poderá ter consequências como o aumento da translocação de patogénicos através da barreira [3,4].

As micotoxinas incluídas no grupo dos tricotecenos são produzidas por fungos do género
Fusarium. Este grupo de micotoxinas inclui mais de 200 exemplares, classificados em quatro tipos,
variando entre A e D (de acordo com as características do grupo funcional), sendo os grupos A e B
conhecidos como os tricotrecenos mais prevalentes. [3,6,8]. As células alvo deste grupo de micotoxinas
são as células epiteliais intestinais e as células do sistema imunológico [4]. Alguns exemplos mais
relevantes de tricotecenos incluem o desoxinivalenol (DON) e a toxina T-2/HT-2, cuja estrutura química
se representa na Tabela 1.1 [4,6,8]. A micotoxina DON encontra-se presente em alimentos como o trigo,
a cevada, o milho, aveia, arroz, centeio e sorgo e quando ingerido, os seus efeitos agudos originam
vómitos, irritação ou necrose da mucosa intestinal, diarreia, redução na ingestão de alimentos e alteração
nas funções imunológicas [3,8]. Os seus efeitos crónicos incidem principalmente sobre o crescimento e
reprodução e também sobre o sistema imunológico onde induz respostas imunoestimulatórias e
imunossupressoras. Pode também possuir um efeito genotóxico e mutagénico. Esta micotoxina pertence
ao grupo 3 segundo a classificação da IARC (sem evidência de carcinogenicidade em humanos) [4,6,8].
Quando as células epiteliais intestinas são expostas a DON, ocorre uma perda da função da barreira
intestinal, devido à perturbação da integridade da barreira intestinal e à redução da expressão das
proteínas de junção oclusiva, permitindo uma maior translocação de potenciais patógenos do lúmen para
o interior do organismo [3,4]. No caso da toxina T-2/HT-2, esta é associada a uma doença conhecida
como aleucia tóxica alimentar cujo quadro clínico inclui náuseas, vómitos, diarreia, gastroenterite,
leucopenia (aleucia), hemorragias, inflamação da pele e, em casos graves, morte por asfixia [4]. Esta
micotoxina é também considerada no grupo 3 segundo a IARC, devido a evidências inadequadas do seu
efeito carcinogénico [4,6]. Os seus principais efeitos tóxicos incluem inibição da síntese de proteínas e
stresse oxidativo levando à apoptose celular. Nas células epiteliais intestinais provoca um
comprometimento da função da barreira, devida a perturbações na integridade desta e na diminuição da
expressão das proteínas de junção oclusiva [4,8].

3
 Tabela 1.1. Micotoxinas com maior relevância para a saúde humana. Representação das estruturas químicas, fungos
produtores e valores máximos permitidos (adaptado de [3,6]).
**
* Valores presentes no regulamento (CE) No 1881/2006 da Comissão Europeia de 19 de Dezembro de 2006; ** Somatório
da Fumonisina B1 e B2; NA – Não aplicável

1.1.2. Aflatoxina B1

As aflatoxinas foram caracterizadas e isoladas pela primeira vez em 1962, após a morte de,
aproximadamente, 100000 perus (doença X) que se atribuiu ao consumo de farinha de amendoim
contaminada com metabolitos secundários de Aspergillus flavus, as aflatoxinas. Devido à possibilidade
de existirem outros metabolitos de fungos, foi criado assim o termo micotoxinas [9].

Este grupo de micotoxinas é produzido por diversas espécies de fungos do género Aspergillus,
nomeadamente Aspergillus flavus, e o grupo inclui as aflatoxinas B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1), G2
(AFG2) e M1 (AFM1), metabolito de AFB1 que pode ser encontrado no leite de mamíferos. A AFB1 é o
mais potente carcinogéneo hepático conhecido em mamíferos, estando por isso incluída no grupo 1
(carcinogénico para humanos), segundo a classificação da IARC, apresentando também propriedades
mutagénicas, teratogénicas e imunossupressoras. O principal órgão alvo de AFB1 é o fígado [3,4,8,9,16]
e a sua estrutura química encontra-se representada na Tabela 1.1. A sua fórmula química corresponde a

4
C17H12O6 e o seu peso molecular é de 312,3 g/mol. De uma forma geral as AFs são cristais que podem
ser incolores ou amarelos-pálidos, sendo que apresentam uma fluorescência azul (caso da AFB1) na
presença de luz ultravioleta (UV). Estas moléculas são instáveis na presença de vários fatores tais como
presença de luz UV, oxigénio, pH extremo (menor que 3 e maior que 10) e agentes oxidantes. São ainda
insolúveis em solventes apolares e solúveis em solventes orgânicos polares como é o caso do
clorofórmio e metanol. [17]

Esta micotoxina está presente numa grande variedade de alimentos como é o caso dos
amendoins, frutos de casca rija, frutos secos, cereais e ainda especiarias [1]. A nível mundial, a
contaminação de alimentos por AFB1 ocorre principalmente nos países em desenvolvimento (Figura
1.1.) sendo que a contaminação de alimentos como o milho, arroz, frutos secos e cereais foi reportada
em países como a Suécia, Índia, Malásia, Paquistão, Equador, Brasil, China, Canadá, Croácia e
República Democrática do Congo, apresentando este último, os resultados mais críticos para o milho,
onde se verificou uma contaminação com AFB1 de 1401.45 μg/kg [18,19]. Em Portugal, através de
estudos realizados no Departamento de Alimentação e Nutrição do Instituto Nacional de Saúde Dr.
Ricardo Jorge ao abrigo de projetos com o MYCOMIX e EarlyMYCO, verificou-se que a contaminação
de cereais consumidos por crianças por várias micotoxinas, nomeadamente a AFB1, origina uma
potencial preocupação para a saúde das crianças até aos 3 anos, em particular, as que consumiam
elevadas quantidades deste grupo de alimentos [2,20]. Face à evidência de que a AFB1 tem a capacidade
de atravessar a placenta e de ser transferida para o feto durante a gestação, tornando-o suscetível aos
potenciais efeitos decorrentes desta exposição, será importante conhecer o impacto da exposição precoce
a esta micotoxina. [21,22].

Em Risco

Baixo Risco

Alto Risco

Figura 1.1. Distribuição mundial do risco de exposição a AFB1. Representação do risco de contaminação com
AFB1 a nível mundial através do consumo de alimentos, assim como alguns dos principais surtos que ocorreram
devido ao consumo de elevadas concentrações de AFB1. (adaptado de [18])
1) Doença X no Perú (1962) - Identificação de micotoxinas pela primeira vez; 2) Surto na Gâmbia (1988);
3) Envenenamento com Aflatoxina no Egito (1992); 4) Surto na Guiné (1999); 5) Surto no Quênia (2004).

5
 A AFB1 é absorvida no intestino delgado e depois distribuída até ao fígado onde irá sofrer um
complexo processo de metabolização/biossíntese (Figura 1.2) [17]. Neste órgão, a AFB1 é convertida
no seu epóxido, podendo assim ligar-se ao DNA assim como às proteínas do organismo. Estudos
recentes demonstraram que a absorção desta micotoxina e dos seus metabolitos no organismo humano
é rápida, absorvendo uma grande quantidade destes compostos em pouco tempo [17,22]. O nível de
toxicidade de AFB1 após a sua ingestão depende das vias de bioativação e desintoxicação que ocorrem
no fígado [23]. A bioativação das enzimas CYP, nomeadamente CYP450, CYP1A2 e CYP3A4 (enzimas
metabolizadoras da fase I) que metabolizam a AFB1, vai originar o epóxido AFB1-8,9-epóxido (AFBO)
que é extremamente reativo e eletrofílico, para além de ser tóxico, mutagénico e carcinogénico
(Figura1.2). Este AFBO poderá então ligar-se covalentemente às proteínas e ao DNA, formando adutos.
Este aductos originam depois citotoxicidade crónica/aguda e causam mutações no DNA levando ao
aparecimento de tumores. Para além deste epóxido, pode ocorrer também a formação por redução dos
grupos cetónicos de aflatoxicol (AFL) que é menos toxico que o anterior. Ocorre ainda a transformação
de AFB1 em AFM1, Aflatoxina Q1 (AFQ1) por hidroxilação e Aflatoxina P1 (AFP1) por desmetilação
que apresentam uma baixa toxicidade e ausência da mesma, respetivamente, sendo consideradas por
isso uma via de desintoxicação. Nas vias de desintoxicação de AFBO e AFM1 ocorre uma conjugação
com a glutationa (GSH) catalisada pela glutationa S-transferase (GSTs) que corresponde a uma enzima
de desintoxicação da fase II [23,24]. O restante AFBO que não se conjuga com GST irá ser hidrolisado
e origina AFB1-dihidrodiol, sendo este transformado em AFB1-dialdeído que por sua vez será
metabolizado pelas enzimas aldo-ceto redutase (AKR7) e o epóxido hidrolase microssomal (mEH),
formando um metabólito não tóxico AFB1-dialcool [24].

Toxicidade
P roteica
Ligação

Desintoxicação

Figura 1.2. Metabolização de AFB1. Representação esquemática das principais vias de metabolização de AFB1
que ocorrem no fígado, após a sua ingestão. (adaptado de [23])
AFB1 - Aflatoxina B1; AFM1 – Aflatoxina M1; AFQ1 – Aflatoxina Q1; AFP1 – Aflatoxina P1; AFBO - Exo-AFB1-
8,9-Epóxido; AFB1-dhd - AFB1-8,9-di-hidrodiol; AFAR - Aflatoxina-Aldeído Redutase; CYP450s - Citocromo
P450s; GSH - Glutationa; GSTs - Glutationa S-transferases; mEH - Epóxido Hidrolase Microssomal.

Os principais efeitos agudos decorrentes da ingestão de aflatoxinas são as aflatoxicoses, que

correspondem a hepatites agudas associadas a vómitos, dores abdominais e edemas, podendo, nos casos
mais graves, levar à morte. Contudo um dos maiores problemas associados a esta micotoxina, é a
exposição crónica podendo contribuir para o aparecimento de cancro hepático, supressão imunológica

6
e outras patologias de ação lenta no organismo [5,9]. Os principais surtos de AFB1 (Figura 1.1)
ocorreram principalmente nos países em desenvolvimento, onde em 2004, se estimou que cerca de 4,5
biliões de pessoas estivessem em risco de exposição crónica a aflatoxinas [19]. O surto na Gâmbia em
1988 originou 391 mortes; no Egito, em 1992, ocorreu um envenenamento por aflatoxinas que originou
em 19 mortes; na Guiné, em 1999, o surto de aflatoxinas originou aproximadamente 600 mortes e por
último o surto de aflatoxinas mais recente ocorreu no Quénia, em 2004, onde resultaram
aproximadamente 100 mortes [18,19,25].

O clima favorável para a ocorrência dos fungos responsáveis pela produção de AFs caracteriza-
se por ser um clima quente e húmido e o grau de contaminação com AFB1 depende de fatores como a
temperatura, humidade, solo e condições de armazenamento [17]. Na Europa, e em particular nos países
da região mediterrânica como Portugal, prevê-se um aumento de contaminação dos cereais
(particularmente no milho) por AFB1 em virtude do aumento de temperatura decorrente das alterações
climáticas, permitindo o desenvolvimento de espécies fúngicas toxigénicas em temperaturas próximas
dos 33ºC, como é o caso da espécie Aspergillus flavus, produtor de AFB1 [17,26,27].

Os fungos produtores de micotoxinas normalmente têm a capacidade de produzirem mais do

que uma variedade de micotoxinas, fazendo com que as diferentes micotoxinas interajam umas com as
outras. Os efeitos induzidos por estas interações na saúde são classificados como sendo sinergéticos
(efeito da mistura é maior que o efeito aditivo originado pelas micotoxinas), aditivo (efeito da mistura é
igual ao efeito originado pela adição das dos efeitos das micotoxinas) e antagónico (efeito da mistura é
menor que o efeito aditivo originado pelas micotoxinas) [28–31]. Por exemplo, num estudo realizado
verificou-se que estava presente a combinação de micotoxinas AFB1, OTA e ZEN, em grãos de cereais
e rações para animais; sabe-se ainda que a mistura de AFB1 e ZEN apresenta um efeito antagónico em
baixas concentrações e sinergético para grandes concentrações [5]. O estudo realizado no âmbito do
projeto MYCOMIX, no Departamento de Alimentação e Nutrição do Instituto Nacional de Saúde Dr.
Ricardo Jorge, revelou que cerca de 75% dos cereais e biscoitos destinados a crianças estavam
contaminados com mais do que uma micotoxina, tornando esta questão particularmente importante pois
trata-se de um grupo populacional vulnerável devido à sua fisiologia e alimentação restrita [28].

1.1.3. Análise e Quantificação das micotoxinas

A análise e quantificação do teor de micotoxinas em alimentos, amostras biológicas ou extratos

celulares, é geralmente efetuada por técnicas cromatográficas como a cromatografia líquida de alta
precisão com deteção por ultravioleta (designada por HPLC-UV ou, abreviadamente, LC-UV),
fluorescência (HPLC-FD ou LC-FD), cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-
MS) ou espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Estes métodos para além de identificarem
os compostos presentes, permitem também a identificação de várias micotoxinas na mesma amostra
apresentando elevada seletividade e sensibilidade, fatores fundamentais para uma boa quantificação
[6,12,32–37].

O sistema de HPLC (Figura 1.3), é composto por uma fase móvel líquida (impelida no sistema
por ação de uma bomba de alta precisão, que gera um determinado fluxo no sistema) que irá transportar
a amostra (inserida através do injetor) até à coluna de HPLC (fase estacionária) onde se efetua a
separação cromatográfica dos compostos a analisar. Existem variados tipos de bomba, sendo a mais
comum, a bomba de seringa, visto que esta é bastante confiável e precisa, permitindo uma taxa de fluxo

7
continuo do solvente [37]. Após separação na coluna, os compostos passam através de um detetor ligado
a um computador, gerando um registo gráfico denominado de cromatograma (onde se visualizam picos
correspondentes à presença dos compostos detetados, representando, no eixo do x, o tempo de eluição
do composto e no eixo do y, no caso do detetor UV, a intensidade de absorção) [37,38].

Os analitos em estudo são identificados no cromatograma, através de um tempo de retenção

específico para cada um. A identificação dos compostos a analisar é efetuada por comparação do tempo
de retenção do pico do composto obtido com o tempo de retenção do pico de um padrão comercial da
toxina e a sua quantificação é extrapolada a partir da curva de calibração [37,38]. No método de HPLC,
existem diferentes detetores, visto que os compostos não apresentam todos as mesmas característica.
Por exemplo, no caso das micotoxinas, a AFB1, Fumonisinas, OTA e ZEA apresentam fluorescência,
utilizando-se, por isso, normalmente o método HPLC-FD, enquanto que para a determinação de PAT
utiliza-se normalmente o método HPLC-UV. Devido à elevada especificidade do método, o HPLC é
considerado um método padrão para a análise de micotoxinas [12,35,38].

Figura 1.3. Análise de amostras por HPLC. Representação esquemática das várias etapas e componentes do sistema
HPLC. (adaptado de [38]).

Os métodos de LC-MS ou LC-MS/MS têm revelado grande interesse e utilidade pois permitem a
identificação inequívoca de várias micotoxinas na mesma corrida (análise cromatográfica). A
combinação das duas técnicas LC e MS, promove uma redução do erro experimental e uma melhoria na
precisão [37]. No método LC-MS, os compostos são separados pelas suas propriedades físicas e
químicas, e detetados pelo seu espetro de massa (massa molecular e carga). Neste método analítico
(Figura 1.4), a amostra é introduzida numa câmara de ionização, onde será ionizada, gerando assim
catiões/aniões que serão separados num analisador de massa, com base na relação massa/carga. A
identificação dos compostos estudados é efetuada através de um detetor que identifica a espécie e
quantidade dos iões. De forma a manter a sensibilidade de deteção e a ionização completa, as taxas de
fluxo devem ser inferiores às que são utilizadas em HPLC [12,37,39]. A metodologia de LC-MS/MS é
utilizada essencialmente para determinar pequenas quantidades de compostos em amostras de alimentos
quando apenas uma ionização (LC-MS) não permite atingir a sensibilidade pretendida, sendo que a sua
elevada seletividade, sensibilidade, robustez e capacidade de multi-análise, facilita a identificação
simultânea de várias micotoxinas. Com estas técnicas é ainda possível reduzir o tempo de execução no
laboratório [36,39,40].

8
 Figura 1.4. Análise de amostras por LC-MS. Representação esquemática das várias etapas e componentes do sistema
LC-MS. (adaptado de [38]).

1.2. Estudos in vitro com culturas de células intestinais

1.2.1. Intestino e células epiteliais intestinais

As células epiteliais do intestino são das mais importantes e relevantes no domínio da absorção
intestinal, visto que o intestino é o primeiro órgão a entrar em contacto com possíveis contaminantes
alimentares presentes no lúmen intestinal após a ingestão de alimentos contaminados, sendo por isso a
primeira linha de defesa do organismo humano contra possíveis infeções intestinais [1,10,11,20,41].
A absorção de contaminantes presentes nos alimentos, como as micotoxinas ocorre principalmente no
intestino delgado (onde se efetua 90% da absorção total do que se ingere). É ainda neste órgão que
ocorrem os níveis de exposição de contaminantes mais elevados [7,12,41–44], sendo este a primeira
barreira entre os meios externo (lúmen) e interno (corrente sanguínea) [1,2,10,16,41,43,44]. O epitélio
intestinal, que está em contacto direto com o lúmen, é constituído por diferentes células: as que
pertencem ao primeiro nível de proteção (enterócitos, células caliciformes, células de paneth e células
enteroendócrinas) e uma rede complexa que é responsável pela resposta imunitária e participa na
homeostase intestinal (linfócitos T e B, linfócitos intraepiteliais, macrófagos e células dendríticas)
[3,10,20].

Este epitélio apresenta duas funções essenciais, que, em conjunto, impedem a passagem para o
sangue de agentes prejudiciais que se encontram no lúmen, tais como toxinas e agentes patogénicos. A
sua primeira função corresponde a uma barreira protetora importante contra o ambiente externo, atuando
a quatro níveis distintos (Figura 1.5) [2,3,10,11,20,41]. O primeiro nível de proteção corresponde à
microbiota (barreira biológica), constituída por bactérias comensais presentes no lúmen intestinal, e cujo
principal papel consiste na manutenção da homeostase da saúde intestinal. O segundo nível, é
representado pelo muco (barreira química) constituído por mucinas (MUC) e peptídeos antimicrobianos
(AMPs), produzidos pelas células caliciformes e pelas células de paneth, respetivamente, cuja função
consiste em impedir que as bactérias luminais estabeleçam um contacto direto com o epitélio. O terceiro
nível, diz respeito ao epitélio (barreira física) constituído por uma monocamada de células epiteliais
semipermeáveis (enterócitos) que se encontram ligadas por junções de oclusão (tight junctions),

9
constituídas por proteínas transmembranares, moléculas de adesão juncional (JAMs), claudinas e
ocludinas, que regulam seletivamente a passagem de nutrientes e água e impedem a passagem de
moléculas nocivas, através da via paracelular e transcelular no intestino. Por último, refere-se o quarto
nível que corresponde ao sistema imunitário intestinal (barreira imunológica) constituído por células
imunes (células dendríticas, macrófagos, linfócitos B e T) e mediadores imunológicos (citocinas e
imunoglobulina A secretora (sIgA), que regulam as respostas inflamatória e imune [1–
4,10,20,29,41,45,46].

Figura 1.5 Barreira Intestinal. Representação esquemática da barreira intestinal numa situação de homeostase e numa
situação de exposição à micotoxina AFB1. (adaptado de [29]).
sIgA: imunoglobulina A secretora. AMPs: peptídeos antimicrobianos.

A segunda função deste epitélio corresponde à sua capacidade de atuar ainda como uma barreira
seletiva que permite a translocação de nutrientes e água através dos enterócitos, que têm a função de
absorção e transporte de nutrientes [2,3,10,11,20,41]. Esta seletividade que o epitélio apresenta deve-se
a duas vias de transporte (Figura 1.6), a via transepitelial/transcelular (através das células) e a via
paracelular (entre as células). Esta última está associada à formação de 3 complexos adesivos
(desmossomas, junções aderentes e junções oclusivas) que se encontram no domínio apical das células,
ligando-se a estas células e separando o espaço apical do basolateral, isolando assim o espaço
intercelular entre as células epiteliais aderentes e evitando a difusão paracelular dos contaminantes
[20,41]. As junções oclusivas (Figura 1.6) são das mais importantes relativamente à homeostase da
integridade da barreira celular e asseguram a integridade da barreira intestinal, sendo constituídas por
quatro proteínas transmembranares (Claudinas, JAMs, Tricelulina e ZO-1) que se localizam nas
extremidades apicais, fornecendo assim uma barreira para moléculas nocivas e poros para a
permeabilidade seletiva [1,3,4,10,20,41].

A alteração do equilíbrio da barreira intestinal, por exposição a agentes tóxicos, constitui uma
grande preocupação devido aos efeitos que provoca na saúde humana, como é o caso da perturbação da
homeostase intestinal, provocada por exposição a micotoxinas, e do desenvolvimento de distúrbios
intestinais, doenças autoimunes e inflamatórias, pois uma barreira intestinal funcional é essencial para
uma proteção eficaz [2–5]. Após a ingestão de alimentos contaminados com micotoxinas, as células
epiteliais intestinais são expostas aos contaminantes, o que provoca alterações como o aumento da
permeabilidade epitelial e o transporte de contaminantes para o interior do organismo [1,4,10,16,20].

10
No caso da AFB1, estudos recentes demonstraram o seu transporte ocorre em ambas as direções da
monocamada de células Caco-2 [47]. Ao afetar a barreira intestinal, a AFB1 vai perturbar este equilíbrio
(figura 1.5) fazendo com que haja uma disrupção da barreira e tornando o organismo mais suscetível a
inflamações intestinais crónicas, alterações imunológicas e metabólicas que levam ao aparecimento de
doenças inflamatórias, principalmente em indivíduos geneticamente predispostos, como é o caso da
doença celíaca e de Crohn ou da colite ulcerosa [1,3,15,34].

Figura 1.6 Células Epiteliais Intestinais. Representação da monocamada de células epiteliais do intestino e vias de
transporte. (adaptado de [20])

1.2.2. Células Caco-2

Nos estudos de transporte com micotoxinas, é comum recorrer-se a metodologias in vitro que
utilizam diferentes linhas de células epiteliais intestinais, humanas e animais, permitindo assim, obter
uma compreensão sobre o efeito tóxico de contaminantes alimentares, como é o caso das micotoxinas,
no trato gastrointestinal, em particular no intestino [4,11,47,48].

De todas as linhas disponíveis usadas em ensaios de transporte, o modelo de células Caco-2 é

aquele reconhecido como referência pela Food and Drug Administration (FDA). Segundo testes
efetuados por esta instituição, esta linha celular representa um excelente modelo para a avaliação da
citotoxicidade, nomeadamente dos efeitos de diversos contaminantes e fármacos no epitélio intestinal,
capaz de prever o transporte in vivo de fármacos e compostos tóxicos (xenobióticos) e simular a barreira
epitelial intestinal [4,33,41,48,49]. Esta linha celular humana, originalmente isolada por Fogh et al.
(1979), a partir de um adenocarcinoma de cólon humano, tem origem intestinal e capacidade de se
diferenciar e polarizar em culturas que apresentam características semelhantes aos enterócitos do
intestino delgado. Para além disso, demonstra ser sensível a micotoxinas, sendo por isso utilizada nos
estudos de toxicologia que envolvem estas toxinas [4,5,41,47–51]. O seu uso constitui ainda uma
ferramenta essencial, pois permite obter resultados reprodutíveis e possíveis de serem aplicados em
estudos in vivo, fornecendo assim um modelo adequado para se observar efeitos de toxicidade direta ou
indireta das micotoxinas, contribuindo para uma melhor avaliação do risco associado à sua exposição
[11,33,41,48].

11
 A cultura destas células, em laboratório, é efetuada em placas transwell com uma membrana
semipermeável durante 18-21 dias, de forma a obter monocamadas diferenciadas que mimetizam a
camada epitelial do intestino delgado através da polarização da monocamada e formação de junções
oclusivas entre as células adjacentes. Quando formadas, estas células apresentam membranas apicais
com microvilosidades (mucosas) e basolaterais (serosas) polarizadas que funcionam de forma
semelhante às do intestino delgado (Figura 1.6) [4,41,49,50].

Apesar da sua ampla aplicação em estudos onde é necessário mimetizar o epitélio intestinal, esta
linha celular apresenta algumas limitações como é o caso da expressão excessiva de junções oclusivas,
o que se traduz em valores muito mais elevados de resistência elétrica transepitelial (TEER) do que os
que se verificam no intestino humano. Estas células não possuem também a capacidade de produzir
muco, que representa uma das principais barreiras intestinais [43,50].

1.2.3. Células HT29-MTX-E12

As células HT29 têm origem num adenocarcinoma colorretal humano e são bastante utilizadas
em estudos que envolvem a determinação de biodisponibilidade de xenobióticos (velocidade/quantidade
do xénobioticos, ou dos seus metabolitos, presente na circulação sistêmica até alcançar o local de ação)
em culturas de células, e a resposta imune a infeções intestinais bacterianas que afetam o muco
produzido. Lesuffleur et al. (1990) descobriram que ao tratar as células HT29 com metotrexato (MTX)
estas eram capazes de se diferenciar em células caliciformes e de produzirem muco, dando origem à
subpopulação de células HT29-MTX [49,50,52].

A subpopulação de células HT29-MTX (tratadas com metotrexato) corresponde ao modelo mais

utilizado para avaliar a forma como os alimentos e xénobioticos (agentes químicos presentes nos
organismos, mas que lhe são estranhos) podem alterar a produção e composição do muco, dando uma
especial atenção às alterações que ocorrem a nível das mucinas produzidas, em função das concentrações
estudadas. Esta subpopulação apresenta um fenótipo semelhante ao das células caliciformes
diferenciadas e tem a capacidade de produzir uma camada de muco e mucinas MUC2, MUC5AC e
MUC5B (expressas principalmente no intestino delgado e grosso) [49,50,53–55]. A quantidade de MTX
utilizada irá influenciar a qualidade das células obtidas. Baixas quantidades de MTX vão originar um
conjunto heterogéneo de células colunares absortivas e produtoras de muco. À medida que se aumenta
a quantidade de MTX, aumenta também a prevalência destas células. O facto de possuírem a capacidade
de produzir muco, potenciou o aumento do interesse da utilização das células HT29-MTX nos estudos
sobre a digestão de alimentos e a biodisponibilidade de xenobióticos, uma vez que o muco vai
influenciar a homeostase da barreira epitelial intestinal [50].

O subclone, HT29-MTX-E12, destaca-se pela sua capacidade de formar monocamadas

uniformes com valores de ligação das junções oclusivas mais baixos e consequentemente, com uma
permeabilidade mais próxima da realidade e com uma camada de muco contínua. Esta camada apresenta
uma espessura semelhante à do muco intestinal humano, e está associada a uma expressão das mucinas
constituída principalmente por MUC5AC, MUC1 e MUC6 existindo apenas em quantidade vestigial a
expressão de MUC2 e conseguindo manter por mais de sete passagens a sua estabilidade [49,50].

12
 1.2.4. Co-cultura de células Caco-2/HT29-MTX-E12

Os modelos celulares que utilizam monoculturas apresentam uma grande desvantagem pois não
têm a capacidade de replicar as interações complexas entre diferentes populações de células que ocorrem
no intestino humano. Uma das principais limitações da utilização das células Caco-2 é a incapacidade
destas células produzirem uma camada protetora de muco [50,55]. De forma a ultrapassar esta
dificuldade, foram criados modelos de co-culturas de células, onde as células Caco-2 são conjugadas
com outros tipos de células de origem intestinal, obtendo-se assim um modelo celular capaz de prever
melhor os resultados obtidos in vivo [50].

Um dos modelos mais utilizados é a co-cultura de células Caco-2/HT29-MTX nas proporções

90:10 (Caco-2:HT29-MTX) para o intestino delgado e 75:25 (Caco-2:HT29-MTX) para o intestino
grosso, cultivadas nas membranas transwell. Nestas condições a co-cultura apresenta uma monocamada
intestinal com uma camada de muco. No entanto, este modelo apresenta uma limitação que é o facto de
não existir uma uniformidade em termos da produção da camada de muco e na mistura das duas
linhagens de células, levando ao aparecimento de espaços sem a camada de muco [49,54,55]. A co-
cultura de células Caco-2/HT29-MTX-E12, surge como uma alternativa ultrapassando esta limitação,
pelo que tem sido bastante utilizada no estudo do impacto do muco intestinal no transporte de
xenobióticos [43,49,50].

Na bibliografia disponível, apenas existem dois estudos que utilizam a co-cultura de células
Caco-2/HT29-MTX para estudar os efeitos das aflatoxinas e ambos são feitos com a AFM1 (metabolito
de AFB1) [54,55]. Ambos os estudos pretendem perceber de que forma a micotoxina AFM1 vai
influenciar a modulação da expressão do mRNA, produção de proteínas e secreção das mucinas,
nomeadamente das MUC2, MUC5AC e MUC5B [54,55]. Os resultados obtidos nestes estudos,
demonstram que a exposição a AFM1 reduz significativamente a viabilidade e os valores de TEER das
células e altera a expressão do mRNA e a quantidade das proteínas das mucinas. Verificou-se ainda que
ao adicionar mais uma micotoxina (OTA e ZEN) a esta equação ocorrem efeitos sinergéticos em todos
os parâmetros avaliados [54,55]. Os resultados demonstraram também que ocorre alteração e disrupção
na morfologia das proteínas e estruturas das junções oclusivas, sendo que os danos na integridade
intestinal estão relacionados com os danos que ocorrem nas junções oclusivas e na produção de mucinas
[55].

1.2.5. Integridade da membrana celular

A integridade da membrana das células antes e após a exposição às micotoxinas é avaliada

através da medição de TEER na monocamada das células epiteliais, sendo este um dos melhores
métodos de avaliação da integridade da barreira epitelial intestinal e respetivas junções oclusivas, em
modelos de cultura e co-cultura de células [3,41,56].

O valor de TEER é determinado com um voltímetro equipado com um par de elétrodos que
quantifica, na monocamada, os movimentos dos iões. É também um bom indicador para avaliar o estado
da integridade da barreira celular antes e após esta ser exposta a xenobióticos e para estudar o transporte
destes compostos [4,56]. É, por isso, uma técnica utilizada durante o processo de diferenciação das
células, existindo valores pré-estabelecidos (variam com fatores como tipo de célula escolhida,

13
condições do ensaio (in vitro/ in vivo) e o aparelho escolhido para a medição de TEER) para os diferentes
modelos de barreiras, como é o caso da barreira hematoencefálica (BHE), o trato gastrointestinal (GIT)
e os modelos pulmonares, que ajudam a verificar o estado de integridade e, no caso do trato
gastrointestinal, a permeabilidade da barreira intestinal [4,11,56].

Um dos métodos mais utilizados para a medição da integridade da membrana celular é o método
da lei de Ohm onde a resistência elétrica da monocamada das células é medida em ohms (Ω) e
corresponde a uma medida que quantifica a integridade da barreira intestinal. Para se efetuar esta
medição é necessário um par de elétrodos, sendo um deles colocado no compartimento apical e outro
no compartimento basolateral e estando separados pela membrana semipermeável e a monocamada
celular (Figura 1.7). O sistema de medição TEER mais utilizado é o Epitelial Volt/Ohm (EVOM) que
utiliza uma frequência de corrente alternada de 12,5 Hz, de forma a não causar efeitos de carga nos
elétrodos e na monocamada celular, com uma escala de medição varia entre 1-9999 Ω [56].

Elétrodo Elétrodo

Monocamada celular

Membrana
Semipermeável

Figura 1.7. Medição TEER. Representação esquemática da medição de TEER na monocamada celular.
(adaptado de [56])

Para a obtenção de uma correta resistência da monocamada celular é necessário medir a

resistência do meio (RM) onde as células se encontram (medida retirada automaticamente pelo aparelho)
e realizar duas medições. A primeira corresponde à resistência do branco (RBranco) em que se mede
apenas a resistência da membrana semipermeável (sem presença da monocamada celular) e a segunda
corresponde à resistência da monocamada das células e membrana semipermeável (RTotal). A resistência
da monocamada celular (RCelular) é expressa em Ω e é obtida através da equação (1.1), sendo que a
resistência é inversamente proporcional à área da membrana semipermeável (MÁrea), em cm2 [56].

Equação (1.1) 𝑅!"#$#%& (Ω) = 𝑅'()%# − 𝑅*&%+,(

Os valores de TEER obtidos, são normalmente apresentados em Ω.cm2 (TEERReportado) sendo

calculados através da equação (1.2) [56].

Equação (1.2) 𝑇𝐸𝐸𝑅-".(&)%/( = 𝑅!"#$#%& (Ω) 𝑥 𝑀Á&"% (𝑐𝑚2 )

14
2. Objetivos

No presente estudo pretendeu-se aprofundar os conhecimentos sobre os efeitos da micotoxina AFB1

nas células intestinais, em particular na presença de muco, com vista a esclarecer a potencial ação desta
toxina e o papel protetor do muco intestinal, e, desta forma, contribuir para a proteção da saúde humana..

Neste âmbito, o objetivo geral deste trabalho consistiu na 1) implementação de um sistema de

culturas intestinais no Departamento de Alimentação e Nutrição (DAN), baseado em estudos
preliminares efetuados neste departamento sobre “Efeitos da co-administração de patulina e cisteína na
integridade da monocamada de células Caco-2” [32] e 2) realização de um estudo comparativo dos
efeitos nocivos da micotoxina AFB1 em culturas de células Caco-2 e co-culturas de células Caco-HT29-
MTX-E12 para avaliar a importância do muco na homeostase intestinal. Foram ainda recolhidas
amostras deste estudo para a realização de uma futura quantificação dos valores de AFB1 nas
componentes apical e basolateral obtidas antes e após exposição a AFB1, por HPLC-FD e quantificação
dos valores de AFB1 na ausência de culturas celulares, por forma a garantir a estabilidade do composto
estudado.

Estes ensaios incluíram-se no âmbito do projeto earlyMYCO (PTDC/DTP-MEDTOX/28762/2017),

na tarefa 3 dedicada aos estudos in vivo sobre o impacto da AFB1 na imunidade intestinal das fases
iniciais de vida (“Mycotoxins impact on intestinal immunity after early-life exposure”) e apresentaram
como objetivo contribuir para esclarecer os efeitos desta micotoxina nas células intestinais na presença
de muco, usando uma abordagem in vitro, dado que existe pouca informação disponível sobre esta
matéria.

Os objetivos específicos podem dividir-se em duas áreas, com as respetivas tarefas que se incluem de
seguida:

1. Implementação e caracterização de culturas de células intestinais

1.1. Estabelecer as condições de cultura e co-cultura celular e ensaios de transporte para as
micotoxinas.
1.2. Avaliação o desenvolvimento da monocamada das células de culturas e co-culturas (com
vista à observação de possíveis diferenças).
2. Realização de ensaios comparativos sobre o efeito da exposição de culturas intestinais a AFB1
2.1. Realização de ensaios preliminares de citotoxicidade celular (de forma a perceber a melhor
concentração a usar nos ensaios de transporte).
2.2. Avaliação da integridade da membrana na presença da micotoxina AFB1, testando diferentes
tempos de exposição e verificar o papel protetor do muco, no caso das co-culturas.
2.3. Avaliação das modificações morfológicas provocadas pela exposição à AFB1 das culturas e
co-culturas intestinais.
2.4. Recolha de amostras dos componentes apicais e basolaterais, antes e após exposição a AFB1,
para uma futura quantificação dos teores desta micotoxina por HPLC-FD.
2.5. Recolha de amostras da solução de AFB1 estudada, mantida em simultâneo durante os
ensaios in vitro de exposição, na ausência de culturas celulares, para uma futura determinação
da sua estabilidade química.

15
3. Materiais e Métodos

De forma a responder aos objetivos propostos, o trabalho experimental foi dividido em 6 tarefas
detalhadas em seguida.

3.1. Cultura das células Caco-2 e HT29-MTX-E12

As linhas celulares Caco-2 e HT29-MTX-E12, gentilmente cedidas pela Doutora Henriqueta Louro
do Departamento de Genética do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, foram adquiridas na
American Tissue Culture Collection (ATCC). Esta tarefa foi dividida em duas fases, sendo elas a
diferenciação das células e o desenvolvimento da monocamada.

3.1.1. Diferenciação das células

As duas linhas celulares (Caco-2 e HT29-MTX-E12) foram diferenciadas separadamente em

frascos com 75 cm2, numa atmosfera humidificada (5% CO2) a 37oC. Todo o manuseamento das culturas
de células foi efetuado numa câmara de segurança biológica. Foi utilizado um meio de cultura DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Gibco, Invitrogen, Paisley, UK) com 25 mM de tampão Hepes
(Gibco, Invitrogen, Paisley, UK), 4,5g/L de glicose, L-glutamina, vermelho de fenol e sem piruvato,
como meio de crescimento. Este meio de cultura foi suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal
(FBS) (Gibco, Invitrogen, Paisley, UK), 1% (v/v) de Aminoácidos Não Essenciais (NEEA) (Gibco,
Invitrogen, Paisley, UK) e 1% (v/v) de Penicilina-Estreptomicina (Pen/Strep) e 1% (v/v) de Anfotericina
B (Gibco, Invitrogen, Paisley, UK), sendo este aquecido em banho-maria a 37°C e mudado 3 vezes por
semana [32,57].

Após a cultura de células atingir uma confluência entre 70%-90% foi necessário efetuar uma
diluição das células. Para isso removeu-se o meio de cultura antigo, lavou-se as células com 5 mL de
tampão fosfato-salino (PBS) (Gibco, Invitrogen, Paisley, UK) aquecido a 37oC e acrescentou-se 2 mL
de tripsina (enzima que quebra as ligações entre as células), também a 37oC. Após a adição da tripsina,
os frascos foram mantidos na incubadora durante 5-10 minutos. De seguida confirmou-se ao
microscópio invertido (Leica DM IL LED) a separação das células e adicionou-se 8 mL de meio de
crescimento novo de forma a inativar a função da tripsina. A densidade das células foi medida usando
uma câmara de contagem Neubauer, sendo que a quantidade de células deve situar-se entre 30-100x104
células/mL (Anexo 1). De modo a proceder com a diferenciação celular, efetuaram-se novas diluições,
cerca de 2-3 vezes por semana e os frascos foram mantidos na incubadora (Heraeus, Heracell150) a
37oC [32,57].

3.1.2. Desenvolvimento da monocamada celular

3.1.2.1. Dia 1: Cultura de células

Após as células estarem diferenciadas e com o número de passagem adequado (30-40 para Caco-
2 e 20-30 para HT29-MTX-E12) [43], removeu-se o meio de cultura antigo, lavou-se com 5 mL de PBS

16
aquecido a 37°C e adicionou-se 2 mL de tripsina (Gibco, Invitrogen, Paisley, UK), também a 37°C,
mantendo os frascos durante 5-10 minutos na incubadora. De seguida verificou-se a separação das
células ao microscópio e após estas estarem separadas, adicionou-se 8 mL de meio de cultura novo e
mediu-se a densidade celular usando a câmara de contagem Neubauer (quantidade deve de ser 30 a
100x104 células/mL), sendo necessário adicionar mais meio de crescimento para se atingir uma
concentração de 2,24 x105 células/mL. Após se atingir o valor desejado, para a cultura de células Caco-
2, depositaram-se 1x105 células/cm2 (0,5 mL de 2,24 x105 células/mL) em cada poço no compartimento
apical da placa transwell de 12 poços, adicionou-se 1,5 mL de meio de crescimento novo em cada poço
no compartimento basolateral e colocou-se a placa na incubadora a 37oC. Para a co-cultura Caco-
2/HT29-MTX-E12, misturou-se num tubo falcon estéril a quantidade necessária das duas linhas
celulares Caco-2 e HT29-MTX-E12 de forma a ficar uma proporção de 9:1, respetivamente. De seguida,
depositou-se 1x105 células/cm2 (0,5 mL da mistura de células com concentração de 2,24 x105
células/mL) em cada poço no compartimento apical da placa transwell, adicionou-se 1,5 mL de meio de
crescimentos novo em cada poço no compartimento basolateral e colocou-se a placa na incubadora a
37oC [32,43].

Estas placas transwell de 12 poços (diâmetro das inserções de 12 mm, tamanho de poro da
membrana de inserção de 0,4 μm e área de crescimento de 1,12 cm2) são utilizadas como modelo da
membrana intestinal (Figura 3.1). Esta possui dois compartimentos: o apical (onde os compostos são
administrados) e o basolateral (onde se recolhem os produtos transportados através da membrana)
[32,43,49].

Insert Transwell

Figura 3.1 Poço da placa Transwell. Representação esquemática da monocamada celular num poço
das placas Transwell com 12 poços. Adaptado de [49].

3.1.2.2. Dia 2-21: Crescimento e polarização da monocamada celular

Durante os 18-21 dias seguintes procedeu-se ao crescimento da monocamada da cultura e co-cultura

de células, assim como à monotorização dos valores de TEER de cada cultura. As placas transwell foram
mantidas na incubadora a 37oC e o meio de cultura trocado três vezes por semana, removendo o meio
de cultura antigo do lado basolateral e, posteriormente, do lado apical, com a ajuda de uma agulha estéril
ligada a uma bomba. De seguida, adicionou-se um novo meio de cultura aquecido (0,5 mL em cada poço
no lado apical e 1,5 mL em cada poço no compartimento basolateral) [32,57].

17
 3.2. Ensaio da citotoxicidade por MTT

O ensaio de citotoxicidade por MTT (Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5 difenil tetrazólio) é

um ensaio colorimétrico que permite avaliar a atividade metabólica celular. Este ensaio foi usado para
avaliar os efeitos da AFB1 sobre a viabilidade das culturas de células Caco-2, HT29-MTX-E12 e co-
cultura Caco-2/HT29-MTX-E12 [58,59]. Estes ensaios de citotoxicidade foram efetuados com vista a
determinar a percentagem de células viáveis em culturas expostas a diferentes concentrações de AFB1
entre 0,8 μM e 25,6 μM. Servem para confirmar que os valores de TEER observados são devidos ao
efeito na membrana e não à morte celular devida a uma concentração excessiva da toxina. [58,59]

No primeiro dia, foi necessário remover o meio antigo de ambas as culturas celulares, lavar com
PBS e adicionar 2 mL de tripsina de forma a separar as células da parede do frasco. Após efetuada a
separação (incubação a 37ºC, durante 5-10 minutos) adicionou-se 8 mL de meio de cultura novo e foi
efetuada uma diluição de 1:2 em novos frascos de cultura, sendo estes mantidos na incubadora a 37ºC.
[58,59]

No segundo dia, foi feita uma nova separação das células e, após adicionar os 8 mL de meio de
cultura novo, foi medida a densidade e efetuada uma diluição de modo a obter a densidade celular de
0,5x105 células/mL. Para as culturas Caco-2 e HT29-MTX-E12, foram adicionados 100 μL (0.5x104
células/poço) das respetivas suspensões celulares a duas placas de 96 poços (Figura 3.2). Para a co-
cultura Caco-2/HT29-MTX-E12, adicionou-se num tubo falcon estéril, a quantidade necessária das duas
linhas celulares Caco-2 e HT29-MTX-E12, de forma a ficar uma proporção de 9:1, respetivamente. De
seguida depositou-se 100 μL (0.5x104 células/poço) da suspensão celular em cada poço (Figura 3.2),
ficando a incubar durante 24 h, a 37ºC [58,59]

Figura 3.2 Ensaio MTT. Representação esquemática da disposição das várias concentrações (C1= 0,8 μM, C2=1,6 μM,
C3= 3,2 μM, C4= 6,4 μM, C5= 12,8 μM e C6= 25,6 μM) de AFB1 e respetivos controlos (negativo e positivo). Os
controlos negativos, representados por “0” correspondem a uma concentração de AFB1 de 0 μM e os positivos,
representados por “+”, correspondem à exposição das células a Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) (Adaptado de [58,59]).

No terceiro dia, verificou-se o crescimento celular ao microcópio e foi efetuada a exposição das
células à micotoxina AFB1 nas concentrações 0,8; 1,6; 3,2; 6,4; 12,8; 25,6 (com base no artigo Sobral,
M.M.C. et al. 2018), adicionado 100 μL da solução de exposição em cada um dos poços C1-C6 (Figura
3.2) ficando a incubar durante 24 h numa atmosfera humidificada (5% CO2) a 37ºC. No poço designado
por “0” apenas se colocou meio de crescimento para servir de controlo negativo [58,59].

18
 No último dia, uma hora antes das 24 h, foi retirado o meio de cultura dos poços positivos (Figura
3.2) e adicionou-se 100 μL de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) (Carl Roth GmbH + Co KG, Alemanha)
diluído em meio de transporte, ficando a incubar durante 1 h. De seguida, as células foram lavadas duas
vezes com PBS pré-aquecido e foi adicionado, a cada poço, 100 μL de MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA) reconstituído em PBS e diluído em meio de cultura (para se atingir uma concentração de 0,5
mg/mL) ficando a incubar durante 4 h numa atmosfera humidificada (5% CO2) a 37oC. Desta forma
garante-se que o MTT se incorpore e se formem os cristais de formazan nas células viáveis. Passadas 4
h de exposição à solução de MTT, esta foi removida e adicionou-se 100 μL de Dimetilsulfóxido (DMSO)
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a cada poço e agitou-se a placas durante 30 minutos (protegendo
da luz e mantendo à temperatura ambiente), garantindo assim a solubilização dos cristais. Por último,
foi medida a absorvância a 570 nm (filtro de referência: 690 nm) num espetrofotómetro e os resultados
foram expressos em percentagem de viabilidade, calculados através da equação (3.1)[10,34,59].

3é/5% /%6 %76(&8â+,5%6 /%6 %:(6)&%6

Equação (3.1) 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (%) = 3é/5% /%6 %76(&8â+,5%6 /(6 ,(+)&(#(6 𝑥 100

3.3. Ensaio de Exposição a AFB1 e Integridade da Membrana Celular

Este ensaio consiste em expor as células, cultivadas em membranas semipermeáveis durante 18-
21 dias, a uma concentração da micotoxina, que não causa morte celular. Foi usada a concentração de
1.6 μM porque é a concentração mais próxima do valor de IC10 (Concentração inibitória onde ocorre
10% de mortalidade celular) descrito (1,01 µM) ao longo de 24 h, incluindo 5 tempos de incubação (1,
2, 3, 6 e 24 h). Este ensaio permitiu assim 1) avaliar a integridade da monocamada das células, antes e
após a exposição a AFB1, através da leitura de TEER e 2) recolher amostras do compartimento apical
para o basolateral, antes e após exposição a AFB1, para serem quantificados os teores desta micotoxina
nestas amostras no futuro, por HPLC-FD [32,47,58].

Para este ensaio, após as células apresentarem uma monocamada polarizada, foi necessário retirar o
meio de crescimento antigo (primeiro do lado basolateral e depois do apical) e adicionar 0,5 mL no
compartimento apical e 1,5 mL no compartimento basolateral de meio de transporte novo a 37oC. Este
meio de transporte contem meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Gibco,
Invitrogen, Paisley, UK.) com 25 mM de tampão Hepes, 4,5g/L de glicose, L-glutamina, sem vermelho
de fenol e sem piruvato e foi suplementado com 1% (v/v) de Aminoácidos Não Essenciais (NEEA), 1%
(v/v) de Penicilina-Estreptomicina (Pen/Strep) e 1% (v/v) de Anfotericina B, Para se verificar a
integridade das células foi necessário medir a resistência elétrica transepitelial (TEER), sendo que os
valores devem de ser superiores a 500 Ω*cm2 (no caso de haver valores inferiores, esses devem de ser
descartados) Até ao início do ensaio, a placa foi mantida na incubadora a 37°C em atmosfera com 5%
de CO2 [32,47].

De seguida, foi necessário preparar o meio de exposição com uma concentração de 1,6 µM de AFB1
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) – valor escolhido para os ensaios de transporte. Foram preparados
e esterilizados por filtração, 10 μL da solução de micotoxina de 1,6 µM para cada compartimento apical.
A essa solução foi adicionado meio de transporte, posteriormente separado num tubo estéril e
homogeneizada no vortex, ficando assim pronto o meio de exposição. Seguidamente retirou-se o meio

19
de transporte das células e as inserções foram transferidas para uma nova placa com 12 poços estéril. O
compartimento apical das placas com 12 poços foi preenchido com 0,5 mL de meio de exposição e o
compartimento basolateral com 1,5 mL de meio de transporte novo, mantido a 37ºC. As amostras foram
recolhidas, retirando-se 400 μL do compartimento apical e todo o volume do compartimento basolateral
após 0 h (poços A1-A2), 1 h (poços A3-A4), 2 h (poços B1-B2), 3 h (poços B3-B4), 6 h (poços C1-C2)
e 24 h (poços C3-C4) de incubação a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 (Figura 3.3). As amostras forma
posteriormente congeladas a -80ºC num tubo Eppendorf, devidamente identificado [32,47].

Figura 3.3 Ensaio de Transporte. Representação esquemática da placa Transwell de 12 poços utilizada nos ensaios de
transporte com exposição a 1,6 µM de AFB1 - 0 h (A1-A2), 1 h (A3-A4), 2 h (B1-B2), 3 h (B3-B4), 6 h (C1-C2), 24 h (C3-
C4).

3.4. Microscopia de Imunofluorescência Confocal

Este ensaio foi realizado em colaboração com o departamento de Genética Humana do Instituto
Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, após os ensaios de transporte, de modo a confirmar visualmente
o efeito da AFB1 nas culturas de células Caco-2 e Caco-2/HT29-MTX-E12.

Após as células serem colocadas em placas transwell de 12 poços e expostas a 1,6 µM de AFB1,
retirou-se 4 filtros (dois controlos - Caco-2 e Caco-2/HT29-MTX-E12 e dois expostos a AFB1 durante
3 h). As células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas imediatamente com formaldeído a 4%
(v/v) em PBS por 20 min à temperatura ambiente, sendo depois permeabilizadas com Triton X-100 a
0,5% (v/v) em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. De seguida, as células foram incubadas,
durante 30 minutos, com faloidina-TRITC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e lavadas 3 vezes com
PBS. Após esta etapa foram coradas brevemente com 1,25 μg/mL DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol,
Dicloridrato) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), lavadas novamente e pós-fixadas com formaldeído
a 4% (v/v) em PBS por 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, foram montadas em lâminas e
lamelas de vidro em VectaShield e seladas com verniz [60].

Foram utilizadas linhas de laser de 405 nm e 532 nm de um microscópio confocal (Leica TCS-SPE),
de forma a ser possível obter imagens XY das monocamadas polarizadas dos 4 filtros das placas
transwell. As imagens gravadas foram processadas com o software embutido Leica e montadas em
figuras com o software Adobe Photoshop (CS4, versão 11.0) [60].

20
 3.5. Recolha de Amostras

A recolha de amostras foi feita durante a realização dos ensaios de transporte, sendo recolhidas
amostras da parte apical (400 μL) e basolateral (todo o volume) durante os tempos de exposição 0 h, 1
h, 2 h, 3 h, 6 h 24 h, sendo estas amostras congeladas a -80ºC para uma futura análise por HPLC-FD
com vista a quantificar os teores de AFB1 [32].

Foram ainda recolhidos, em tubos Eppendorf, 2 mL de amostra da micotoxina em meio de

transporte, na concentração de 1,6 μM para o ensaio de estabilidade da AFB1 ao longo do tempo das
condições experimentais do ensaio de transporte (0 h, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h 24 h), por forma a verificar a
estabilidade da micotoxina ao longo do tempo e uma eventual degradação da toxina [32].

Todas as amostras foram congeladas a -80ºC, para futura quantificação dos valores de AFB1 por
HPLC-FD, obtendo-se assim, no total, 199 amostras (187 obtidas dos ensaios de transporte e 12 do
ensaio de estabilidade) [32].

3.6. Análise estatística

No que diz respeito as análises estatísticas, os dados foram trabalhados em Excel (Microsoft ®) e
todos os testes estatísticos foram efetuados no programa R studio versão 3.6.1. Em primeiro lugar foi
necessário efetuar um teste de Shapiro aos dados obtidos durante a realização dos ensaios, de forma a
se poder confirmar ou não a normalidade dos dados. Quando os dados apresentavam uma distribuição
normal, foi aplicado um Teste t-student para a comparação entre dois grupos, mas nos casos em que os
dados não apresentavam uma distribuição normal foi então aplicado um teste de Mann-Whitney. Quando
foi necessário comparar mais do que dois grupos foi aplicada uma ANOVA one-way para ver se existem
diferenças significativas e, de seguida, foi aplicado um teste de Tukey para verificar quais os grupos que
apresentam diferenças entre si. Os resultados estatísticos significativos estão representados por p < 0.05
(*); p < 0.001 (**) e p < 0,0001 (***), tendo sido considerado um intervalo de confiança de 0,95.

21
4. Resultados

4.1. Desenvolvimento da monocamada celular e integridade da membrana

celular

Neste ensaio, pretendeu-se avaliar o desenvolvimento da monocamada das células intestinais

individuais (Caco-2) e da sua co-cultura com células HT29-MTX-E12 (Caco-2/HT29-MTX-E12),
através da monotorização dos valores de TEER (Anexo 2 - Tabelas 2.1 – 2.2). Desta forma, pode-se
confirmar a presença de uma monocamada celular polarizada, necessária para os ensaios de absorção,
com valores de TEER situados entre 500 e 1000 Ω*cm2.

Os resultados obtidos através da monitorização dos valores de TEER ao longo dos 21 dias
demonstraram que existe um aumento gradual dos valores de TEER à medida que os dias de cultura
aumentam (Figura 4.1). No primeiro dia, em que se realizou a medição (dia 4), verificou-se que os
valores de TEER estavam abaixo dos 100 Ω*cm2 tanto para as culturas (92,9 Ω*cm2) com co-culturas
(31,11 Ω*cm2). A partir do dia 15 de crescimento, os valores de TEER eram superiores a 500 Ω*cm2,
(585,6 Ω*cm2 para as células Caco-2, e 613, 32 Ω*cm2 para as Caco-2/HT29-MTX-E12), atingindo os
valores mais elevados no dia 20 (956,1 Ω*cm2 para as Caco-2 e 872,77 Ω*cm2 para Caco-2/HT29-MTX-
E12). No dia 21, já se observaram valores de TEER inferiores aos do dia 20 (596 Ω*cm2 para as Caco-
2 e 758,94 Ω*cm2 para as Caco-2/HT29-MTX-E12), o que confirma o número de dias ideal, entre 18 e
21 dias de crescimento para ensaios de transporte, referido na literatura.

Estes resultados revelam diferenças no crescimento e polarização da monocamada celular das

culturas Caco-2 e co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12, sendo estas significativamente diferentes
(Anexo 2 – Tabela 2.3) nos dias 4 (p-value = 0,0019), 6 (p-value = 0,000018), 13 (p-value = 0,000019)
e 21 (p-value = 0,000057).

22
 ***

***

** ***

Figura 4.1 Integridade da monocamada celular. Gráfico com a representação dos valores de TEER da cultura
celular Caco-2 e da co-cultura Caco-2/HT29-MTX-E12, ao longo dos 21 dias de crescimento da monocamada. Os
valores apresentados representam a média ± desvio padrão de pelo menos dois ensaios independentes (n=2, 2
réplicas). p < 0.05 (*); p < 0.001 (**) e p < 0,0001 (***) representa uma diferença significativa entre os valores de
TEER das culturas e co-culturas.

4.2. Ensaio da citotoxicidade por MTT

O gráfico da Figura 4.2 representa a viabilidade celular em função de diversas concentrações de

AFB1 que variam entre 0,8 μM e 25,6 μM, durante 24 h de exposição. Como se pode observar, ao expor
as células ao SDS (Figura 4.2 - controlo positivo), verifica-se que ocorre uma inviabilização total na
maioria das células. Por outro lado, na concentração 0 µM (Figura 4.2- controlo negativo), visto apenas
se utilizar o meio em que as células se encontravam, a viabilidade destas não sofreu nenhuma alteração,
apresentado assim uma viabilidade de 100%.

Em relação à gama de concentrações de AFB1 testadas, segundo o gráfico da Figura 4.2,

verifica-se que a viabilidade celular dos três tipos de culturas testadas, em função dos valores de
absorvância obtidos (Anexo 3 – Tabelas 3.1 – 3.3), reduz de 100% para cerca de 80-60% na presença
de 0,8 μM AFB1, sendo que as co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 apresentam a maior descida
(viabilidade de 65%) , seguidas das células Caco-2 (viabilidade de 70%) e por último as células HT29-
MTX-E12 (viabilidade de 80%). À medida que a concentração de AFB1 aumentou, observou-se uma
tendência para a viabilidade se manter constante nas co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 e para a
cultura de células HT29-MTX-E12, que se mantém a cerca de 60% e 80%, respetivamente. No caso das
células Caco-2, verifica-se um aumento da viabilidade celular à medida que a concentração de AFB1

23
aumenta, excedendo os 100% (quando comparado com os valores do controlo negativo) a partir da
concentração de 6,4 μM (Figura 4.2).

Detetaram-se diferenças significativas no caso das co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 entre a

viabilidade das células controlo e a viabilidade das células expostas à micotoxina, para todas as
concentrações de AFB1 testadas (Anexo 3 – Tabela 3.4), ou seja, 0,8 μM (p-value = 0,004); 1,6 μM (p-
value = 0,009); 3,2 μM (p-value = 0,004); 6,4 μM (p-value = 0,009); 12,8 μM (p-value = 0,005); 25,6
μM (p-value = 0,005). No caso das culturas Caco-2 apenas existe diferenças significativas
(relativamente ao controlo) na concentração de 0,8 μM (p-value = 0,002) (Anexo 3- Tabela 3.5) e nas
culturas HT29-MTX-E12 (Anexo 3- Tabela 3.6) apenas na concentração de 6,4 μM (p-value = 0,03).

No entanto, é importante mencionar que como apenas foi realizado um ensaio, são necessários
mais dados para se poder confirmar os resultados obtidos, visto que os ensaios de citotoxicidade por
MTT apresentam uma variação muito grande. Por esse motivo, apenas se pode considerar estes
resultados como preliminares, existindo assim a necessidade de serem confirmados através da realização
de mais ensaios de citotoxicidade. No entanto, de acordo com os resultados obtidos pode-se observar
que a concentração escolhida para os ensaios de transporte (1,6 μM) apresenta um baixa citotoxicidade
sendo por isso uma boa concentração para se utilizar nesses ensaios.

* *
* * *
* * *

**
*
**

Figura 4.2 Viabilidade celular. Gráfico comparativo da viabilidade das células Caco-2, HT29-MTX-E12 e Caco-
2/HT29-MTX-E12 ao longo das diferentes concentrações de AFB1 testadas (0,8-25,6 μM), durante 24 h de exposição e
respetivos controlos positivo (exposição a SDS) e negativo (ausência de AFB1). Os valores apresentados representam a
media ± desvio padrão de 1 ensaio independente por concentração testada (n=1, 6 réplicas).
p < 0.05 (*); p < 0.001 (**) e p < 0,0001 (***) representa uma diferença significativa em relação ao controlo negativo.

24
 4.3. Ensaio de Exposição a AFB1 e Integridade da Membrana Celular

Os resultados do ensaio de transporte foram obtidos ao longo de 24 h de exposição a AFB1, onde

se recolheu os valores de TEER (Anexo 4 – Figuras 4.1 e 4.2), para se observar os efeitos na integridade
das membranas celulares.

O gráfico da Figura 4.3 representa o estudo comparativo dos resultados de TEER obtidos nos
ensaios com células Caco-2 e sua co-cultura, ao longo de 24 h de exposição a AFB1.

Nos resultados obtidos para as células Caco-2 individuais, representadas na Figura 4.3 a),
registaram-se valores de TEER entre 900 e 1100 Ω*cm2 para os controlos (células não expostas a AFB1)
e valores entre 655 e 282 Ω*cm2 para as células expostas a AFB1 (1,6 µM). No último caso, registou-se
uma descida dos valores de TEER dependente do tempo, com o valor mais baixo de TEER (282,3
Ω*cm2) às 6 h de exposição, seguido de um aumento às 24 h (628, Ω*cm2). Ao comparar os valores de
TEER das células expostas e controlo, verificou-se que existem diferenças significativas em todos os
tempos de exposição (Anexo 4 – Tabela 4.3), ou seja, 0 h (p-value = 0,0144), 1 h (p-value = 0,0049), 2
h (p-value = 0,0055), 3 h (p-value = 0,0002), 6 h (p-value = 0,0019) e 24 h (p-value = 0,0013).

Nos resultados das co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12, representados na Figura 4.3 b),

verificaram-se valores de TEER constantes entre 730 e 790 Ω*cm2, inferiores aos registados para os
controlos das culturas Caco-2 (900-1100 Ω*cm2). Nas células expostas, verificou-se uma descida de
TEER em função do tempo de exposição, sendo o valor mais baixo obtido às 3 h de exposição (498,5
Ω*cm2), seguido de um aumento às 24 h (574,2 Ω*cm2). Também neste caso se verificaram diferenças
significativas entre células expostas e controlos (Anexo 4 – Tabela 4.4) nos tempos 1 h (p-value =
0,0060), 2 h (p-value = 0,0003), 3 h (p-value = 0,0022), 6 h (p-value = 0,0005) e 24 h (p-value = 0,0023).

25
 a)

*
**
*
* ***
**

b)

* *
** * **

Figura 4.3 Integridade da monocamada celular exposta a AFB1 (1,6 μM) durante 24 h. Representação dos valores de
TEER em função do tempo (0 h-24 h) das culturas e co-culturas expostas a 1,6 μM de AFB1. a) comparação dos valores
de TEER entre as células Caco-2 expostas a AFB1 e não expostas (controlo). b) comparação dos valores de TEER entre as
células Caco-2/HT29-MTX-E12 expostas a AFB1 e não expostas (controlo). Os valores apresentados representam a média
± desvio padrão de pelo menos 3 ensaio independente (n=3, 2 réplicas).
p < 0.05 (*); p < 0.001 (**) e p < 0,0001 (***) representa uma diferença significativa entre os valores do controlo e das
células expostas.

Ao comparar os valores de TEER das culturas Caco-2 com as co-culturas Caco-2/HT29-MTX-

E12 (Figura 4.4), verificou-se que as culturas individuais apresentam, para qualquer tempo de exposição,
valores de TEER inferiores aos das co-culturas, existindo diferenças significativas (Anexo 4- Tabela
4.5) às 0 h (p-value = 0,0038), 1 h (p-value = 0,0122) e 3 h (p-value = 0,0030). As culturas individuais
e co-culturas de células Caco-2 expostas a AFB1 apresentam um decréscimo dos valores de TEER à
medida que o tempo aumenta, para todos os tempos de exposição ensaiados, com a exceção do tempo
das 24 h.

26
 *

* *

Figura 4.4 Evolução da integridade da monocamada celular após exposição a 1,6 μM de AFB1. Gráfico comparativo
dos valores de TEER em função do tempo (0 h-24 h) das culturas Caco-2 e co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 expostas
a 1,6 μM de AFB1 e respetivos controlos. Os valores apresentados representam a média ± desvio padrão de pelo menos 3
ensaio independentes (n=3, 2 réplicas).
p < 0.05 (*); p < 0.001 (**) e p < 0,0001 (***) representa uma diferenças significativas entre os valores de TEER das
culturas e co-culturas de células expostas a AFB1.

4.4. Microscopia de Imunofluorescência Confocal

Os resultados do ensaio de microscopia de imunofluorescência confocal permitem visualizar os

efeitos da exposição a AFB1 na morfologia das culturas e co-culturas de células Caco-2 e Caco-2/HT29-
MTX-E12, recolhidas em filtros de membrana transwell usados nos ensaios de transporte. Todas as
imagens da Figura 4.5 representam duas perspetivas: 1) vista de cima (presente no centro da imagem) e
2) vista lateral (presente no lado direito e em baixo de cada imagem). O tracejado branco representa o
local onde foi retirada a vista lateral. Para se interpretar os resultados foram ainda analisadas mais
imagens do mesmo plano e ainda outros planos das culturas e co-culturas celulares.

As Figuras 4.5 a) e c), correspondentes a células não expostas a AFB1, revelam paredes celulares
com filamentos de actina bem definidas, marcadas a vermelho com a faloidina, podendo-se ainda
observar os núcleos marcados a azul, com DAPI. A Figura 4.5 a), apresenta uma só população de
culturas Caco-2 e a Figura 4.5 c), apresenta a co-cultura de células Caco-2/HT29-MTX-E12. Em ambos
os casos, verifica-se que estão presentes células bem polarizadas e sem diferença significativa na sua
morfologia. No caso das co-culturas, estão presentes as duas populações de células Caco-2 e HT29-
MTX-E12, sendo que estas últimas apresentam uma espessura mais elevada que as Caco-2 (evidenciado
pela vista lateral) e caracterizam-se pela formação de um aglomerado no meio das células Caco-2 com
a presença de muco.

27
 Após a exposição, durante um período de 3 h à AFB1, verificou-se que tanto as células Caco-2
(Figura 4.5 b)) como as Caco-2/HT29-MTX-E12 (Figura 4.5 d)) apresentam diferenças na morfologia
das paredes celulares, sendo estas diferenças mais evidentes no caso das culturas Caco-2. A principal
diferença que se observa entre células controlo e células expostas em ambos os casos (Caco-2 e Caco-
2/HT29-MTX-E12) consiste nas falhas nos filamentos de actina que induzem alterações na parede
celular prejudicando a sua definição. Para além disso, observou-se ainda ocorrência de interferências ao
longo da parede celular de ambas as populações celulares (representado pelas setas brancas).

a) b)

c) d)

Figura 4.5 Efeitos da AFB1 na morfologia das culturas e co-culturas celulares. Fotografias obtidas através de
microscopia de imunofluorescência confocal antes e após 3 h das células serem expostas a AFB1. a) células Caco-2 não
expostas a AFB1 (controlo). b) células Caco-2 após 3 h de exposição a AFB1. c) células Caco-2/HT29-MTX-E12 não
expostas a AFB1 (controlo). d) células Caco-2/HT29-MTX-E12 após 3 h de exposição a AFB1.
Setas indicam as mudanças na morfologia das células expostas a 1,6 μM de AFB1.
- Filamentos de actina marcados a vermelho (Faloidinia); - Núcleos das células marcados a azul (DAPI)

28
5. Discussão

5.1. Desenvolvimento da monocamada celular e integridade da membrana

celular

As linhas celulares Caco-2 e Caco-2/HT29-MTX-E12 (proporção de 9:1 - Caco-2:HT29-MTX-E12)

foram cultivadas com sucesso, permitindo assim a monotorização do crescimento e polarização da
monocamada de células, que foi atingida entre os dias 15 e 21 (Figura 4.1). A linha celular HT29-MTX-
E12 não foi monitorizada individualmente pois sabe-se que esta linha celular não forma camadas
polarizadas [42]. Os resultados obtidos estão de acordo com os resultados descritos na bibliografia sobre
o crescimento e desenvolvimento da monocamada celular e respetiva integridade membranar destas
células, pois na grande maioria dos trabalhos que envolvem células Caco-2 é referido que estas são
utilizadas em ensaios de estudos de absorção após 14-21 dias de crescimento [43,47,61,62].

Pan, F. et al. (2015) realizaram um estudo comparativo entre as culturas de células Caco-2 e a
sua co-cultura (Caco-2/HT29-MTX-E12), por forma a identificar a melhor proporção a utilizar em
ensaios de permeabilidade e transporte e demonstraram a vantagem do uso das co-culturas [42,43].
Segundo estes autores, a proporção ideal entre as células Caco-2 e HT29-MTX-E12 foi de 9:1 (Caco-
2:HT29-MTX-E12). Uma vez que esta foi a proporção em que se obtiveram os valores mais elevados
de integridade da membrana (confirmados através da monitorização dos valores de TEER). Segundo
esta publicação, a polarização da monocamada foi atingida entre os 18-21 dias de cultura [43].

No presente estudo, ao comparar os valores de TEER entre a cultura de células Caco-2 e a co-cultura
Caco-2/HT29- MTX-E12, verifica-se que existe um aumento gradual dos valores de TEER em função
do tempo (4-21 dias) para ambas e que existem diferenças entre os valores de culturas e co-culturas,
sendo os valores de TEER, de um modo geral, mais baixos para as co-culturas. Os resultados obtidos
por Pan, F. et al. (2015) e Béduneau, A. et al. (2014) corroboram os resultados obtidos no presente
estudo, visto que também nestes dois estudos se verificou valores mais baixos de TEER para as co-
culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 do que para as culturas Caco-2 [43,61].

Com estes resultados retira-se que no geral as co-culturas Caco-2/HT29- MTX-E12 apresentam
valores de TEER mais baixos que as culturas de células Caco-2 o que torna este modelo mais indicado
para estudos de exposição a micotoxinas, uma vez que os valores obtidos pelas co-culturas corresponde
a valores mais próximos dos que se encontram no intestino humano [43,44]. Para além dos valores de
TEER mais baixos, as co-culturas aqui utilizadas apresentam ainda a vantagem das células HT29-MTX-
E12 terem a capacidade de produzirem muco e de permitirem a interação entre diferentes tipos de células
intestinais [43], imitando o sistema de co-cultura enterócito-célula caliciforme. Obtém-se ainda uma
monocamada mais permeável e com juncões oclusivas mais próximas das encontradas no intestino
humano [44].

5.2. Ensaio da citotoxicidade por MTT

No presente estudo, foram testadas concentrações entre 0,8 μM e 25,6 μM, sendo que os valores de
viabilidade obtidos após exposição a AFB1 (Figura 4.2) refletem os seus efeitos citotóxicos para as linhas
celulares testadas. Para as linhas celulares HT29-MTX-E12 e Caco-2/HT29-MTX-E12 obteve-se

29
valores de viabilidade de 80% e 60%, respetivamente. Enquanto que para a linha celular Caco-2 os
valores de viabilidade são superiores a 100% a partir da concentração de 6,4 μM.

Zhang, J. et al (2015) verificaram que uma exposição durante 24 h a AFB1 (concentrações entre
0,032- 3,2 μM) provoca um decréscimo de viabilidade para 60% em células Caco-2, dependente do
aumento da concentração de AFB1 [63]. No entanto, os resultados obtidos por Clarke, R. et al. (2014)
demonstraram que as células Caco-2 expostas durante 48 h a concentrações de AFB1 entre 0,00016 e 32
μM, não demonstram efeitos citotóxicos significativos [30], aproximando-se os resultados obtidos por
Clarke, R. et al. (2014) dos resultados obtidos no presente estudo.

O trabalho de Sobral, M.M.C. et al. (2018) demonstrou que uma exposição durante 72 h a AFB1 em
concentrações que variam entre 0 e 20 μM, provocou efeitos citotóxicos evidentes nas células Caco-2,
com um valor de IC50 de 19,4 μM e IC10 de 1,01 μM [58]. No presente estudo, a concentração mais
próxima do IC50 testada foi de 25,6 μM, onde se obteve uma viabilidade superior a 100%, após 24 h de
exposição e do IC10 a concentração mais próxima testada foi 1,6 μM, sendo esta a concentração
escolhida para se utilizar nos estudos de transporte, pois ao apresentar um índice de citotoxicidade na
casa dos 10% está-se a garantir que não irá ocorrer de imediato um excesso de morte celular devido a
uma concentração elevada de AFB1.

Para as culturas HT29-MTX-E12 e co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 não existe bibliografia

disponível sobre a viabilidade celular ao longo do tempo para a exposição a AFB1. No entanto, os
resultados obtidos por Zhang, J. et al. (2015) sobre a citotoxicidade da AFB1 e AFM1 em células Caco-
2 diferenciadas e não diferenciadas revelam viabilidades próximas de 60% durante 24 h, 48 h e 72 h de
exposição para concentrações entre os 0,032 e 3,2 μM de AFB1 [63], estando estes resultados de acordo
com os resultados obtidos no presente estudo para as co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12.

Por último, as diferenças detetadas entre os resultados obtidos neste estudo e na bibliografia,
como é o caso de existir uma viabilidade superior a 100% a partir da concertação de 6,4 μM e de não
existir uma diminuição da viabilidade celular em função do aumento da concentração de AFB1 clara
pode ser atribuídas a fatores como 1) Estar a ocorrer uma degradação da micotoxina (pouco provável
pois a micotoxina é bastante estável) ao longo das 24 h de exposição e por isso não se está a conseguir
obter o resultado esperado (necessário confirmar através de HPLC); 2) Poderá ter ocorrido alguma
variabilidade experimental durante a realização do ensaio e o número de células poderia não ser
exatamente igual em cada um dos poços das placas poço, podendo assim explicar-se a viabilidade
superior a 100%. Será então necessário realizar novos ensaios, de forma a se poder retirar conclusões
concretas sobre os resultados de MTT para as concentrações de exposição entre 0 e 25 μM AFB1, visto
que para cada concentração foram utilizados 6 poços, mas apenas uma placa em vez de 3 placas
(triplicado) ou 3) Poderão estar presentes agentes que provocam a proliferação celular, devido à presença
da AFB1.

5.3. Ensaio de Exposição a AFB1 e Integridade da Membrana Celular

Os resultados obtidos para as células Caco-2 sobre a integridade da monocamada celular após ser
exposta a 1,6 μM de AFB1 durante 24 h (Figura 4.3), demonstraram que existe uma diminuição dos
valores de TEER dependente do tempo de exposição a AFB1. Estes resultados estão de acordo com os
resultados descritos na bibliografia, visto que também se verifica uma diminuição dos valores de TEER
nos trabalhos consultados [46,47,62].

30
 Gratz, S. et al. (2007) e Romero, A. et al. (2016) demonstraram que ao expor as células Caco-2 a
concentrações entre 100 e 150 μM de AFB1 ocorria uma descida significativa dos valores de TEER,
situada entre os 9% e 31,1%, durante 24 h de exposição. Os mesmos autores verificaram que, quando
células eram expostas a outras micotoxinas como FB1, OTA e T2, a maior redução de TEER ocorria
para a AFB1, indicando assim que a AFB1 provoca efeitos citotóxicos nas células Caco-2, diminuindo a
TEER em função do tempo de exposição. Esta diminuição dos valores de TEER traduz-se num
comprometimento da integridade da barreira epitelial intestinal que poderá levar a num aumento da
permeabilidade paracelular das junções oclusivas [46,62].

Sobral, M.M.C. et al. (2019) também realizaram estudos de transporte com células Caco-2 e AFB1,
usando a mesma concentração deste estudo (1,6 μM), visto ser uma concentração abaixo do IC50 (19,4
μM) e próxima do IC10 (1,01 μM) para AFB1. No entanto, no ensaio efetuado por Sobral, M.M.C. et al.
(2019) não foram encontradas diferenças significativas nos valores de TEER após 3 h de exposição para
esta concentração de AFB1. [47]

No presente estudo, verifica-se que, para a linha celular Caco-2, passado 3 h de exposição a AFB1
os valores de TEER passaram de 1000 Ω*cm2 para 400 Ω*cm2, sendo o valor mais baixo obtido após 6
h de exposição com uma TEER de 282,3 Ω*cm2. Estes resultados vão ao encontro dos resultados obtidos
por Gratz, S. et al. (2007) e Romero, A. et al. (2016) [46,62], embora com uma concentração de AFB1
utilizada muito mais baixa de apenas 1,6 μM.

Embora não exista bibliografia disponível sobre o efeito de AFB1 em co-culturas de células Caco-
2/HT29-MTX, existem dois estudos sobre os efeitos do seu metabolito AFM1 nestas co-culturas [54,55].
Huang, X. et al. (2019) e Gao, Y. et al (2019) verificaram que, ao expor culturas de células Caco-2 e
co-culturas de células Caco-2/HT29-MTX-E12 a AFM1 (0,16-12 μM), ocorria uma diminuição
significativa dos valores de TEER, após 48 h de exposição, para as células Caco-2 enquanto que para a
co-cultura não se verificou diminuição significativa, embora se tenha registado na mesma uma redução.
Esta redução menos significativa sugere que o muco estará a interferir, atuando como uma barreira
protetora, não permitindo que a AFB1 exerça completamente o seu efeito [54].

Tendo em conta que a micotoxina AFM1 é menos citotóxica que a AFB1 [54], os resultados obtidos
por Huang, X, et al. (2019) e Gao, Y. et al (2018) corroboram os resultados que foram obtidos no
presente estudo no que diz respeito às células Caco-2 e às co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12, onde se
verifica uma diminuição de TEER maior para as células Caco-2 em comparação com os valores obtidos
para as co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12. Para além disso, sabe-se que o muco representa uma das
barreiras protetoras das células epiteliais intestinais [54,55], por isso era esperado que os efeitos para a
mesma concentração de AFB1 não fossem tão significativos para as co-culturas Caco-2/HT29-MTX-
E12 quanto os da cultura Caco-2 que não apresenta produção de muco. No entanto é relevante mencionar
que mesmo assim ocorre uma diminuição de TEER significativa ao longo das 24 h de exposição para
ambas as linhas celulares.

Por último, no presente estudo, verifica-se que para ambas as culturas e co-culturas ocorreu um
aumento dos valores de TEER às 24 h de exposição a AFB1 (628 Ω*cm2para as Caco-2 e 574 Ω*cm2
para as Caco-2/HT29-MTX-E12), em comparação com os valores das horas anteriores (282 Ω*cm2 para
as Caco-2 e 512 Ω*cm2 para as Caco-2/HT29-MTX-E12). Nos estudos de Sobral, M.M.C. et al. (2019),
Gratz, S. et al. (2007) e Romero, A. et al. (2016) não se verifica esta subida de TEER às 24 h de
exposição [46,47,62]. Tendo em conta estes resultados, a explicação do que poderá estar na origem da
subida dos valores de TEER passadas 24 h de exposição a AFB1 será 1) ter ocorrido uma degradação da

31
micotoxina para um metabolito menos tóxico ao longo das 24 h de exposição (resultado a confirmar por
HPLC) e por isso verifica-se uma recuperação da integridade (subida dos valores de TEER) por parte
das células nesse tempo ou 2) poderá ocorrer uma rápida absorção intestinal deixando a micotoxina de
estar presente no compartimento apical e parando assim o seu efeito nas células (resultado a confirmar
por HPLC).

5.4. Microscopia de Imunofluorescência Confocal

Ao comparar os resultados das células expostas durante 3 h a AFB1 (1,6 μM), com os respetivos
controlos (Figura 4.5), verificou-se que, para as células Caco-2, se registaram falhas nos filamentos de
actina, componente importante das junções oclusivas, na parede celular (marcada a vermelho pela
faloidina) enquanto que no controlo se observaram paredes celulares bem distintas, correspondentes a
uma monocamada de células polarizadas. No caso das co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 também se
registaram falhas no filamento de actina, mas não tão evidentes (tal como se verificou na medição de
TEER no ensaio de transporte onde as co-culturas apresentaram uma resposta menos significativa na
diminuição de TEER do que as células Caco-2), evidenciando novamente o papel importante do muco
na proteção contra agentes externos.

As falhas nas junções oclusivas da parede celular das células expostas evidenciadas no presente
estudo pela microscopia de imunofluorescência confocal, irão provocar um aumento da permeabilidade
epitelial que, por sua vez, irá permitir que ocorra uma maior translocação de agentes patogénicos
promovendo uma resposta inflamatória não especifica e uma estimulação do sistema imunitário
intestinal [4].

Não se identificaram estudos sobre as diferenças morfológicas entre culturas de células Caco-2 e
co-culturas de células Caco-2/HT29-MTX-E12, antes e após a exposição a AFB1, na bibliografia, no
entanto, comparando com os efeitos de outras micotoxinas na parede da monocamada celular verifica-
se que estes resultados, obtidos no presente estudo, estão de acordo com o que é descrito [41,54,62].
Gao, Y. et al. (2018) verificaram que alguns dos componentes das junções oclusivas (claudina-3,
claudina-4 e ZO-1) foram identificados com dificuldade pela microscopia de imunofluorescência
confocal, demonstrando assim que a síntese destas proteínas foi severamente afetada nas células
expostas a concentrações citotóxicas de AFM1 e OTA [41]. Já Pinton, P. et al. (2009) demonstraram que
a micotoxina DON tem a capacidade de reduzir a intensidade da coloração para a claudina-4 nas células
Caco-2, sugerindo que estas foram removidas do complexo das junções oclusivas das células expostas
[1].

No caso das co-culturas, Huang, X. et al. (2019) verificou que ao expor as células a uma mistura de
AFM1+OTA de 0,013 μM, as junções oclusivas ficaram significativamente danificadas e o número de
células viáveis diminuiu bastante, o que faz com que o número de células que tem a capacidade de
produzir muco diminua também causando alterações na produção de mucinas, afetando assim mais do
que um nível da barreira intestinal (epitélio e muco). [54,55]

32
6. Conclusões

Os estudos in vitro com diferentes linhagens celulares são uma ótima opção para prever a resposta
in vivo. A linhagem celular Caco-2 tem sido o modelo celular mais utilizado nos últimos 20 anos. No
entanto, para melhor imitar as condições do intestino (valores de resistência e interação de diferentes
tipos de células), co-culturas de células Caco-2 com outros tipos de células têm sido utilizadas, como as
células HT29 secretoras de muco, visto que a barreira intestinal também inclui a presença e produção
de muco.

Até ao momento, e segundo o conhecimento da autora, este é o primeiro estudo que aborda os efeitos
celulares da AFB1 em co-culturas de células Caco-2/HT29-MTX-E12. Neste âmbito, foi efetuada uma
comparação dos dois modelos de culturas individuais e co-culturas, Caco-2 e Caco-2/HT29-MTX-E12,
respetivamente, pretendendo-se evidenciar o papel do muco enquanto barreira protetora do intestino e
demonstrar a importância da utilização de co-culturas em estudos in vitro, de forma a simular as
interações entre diferentes populações celulares que ocorrem no intestino humano in vivo. Com este
estudo confirma-se a ação lesiva da micotoxina AFB1 na barreira intestinal, simulada através de culturas
e co-culturas de células Caco-2 e Caco-2/HT29-MTX-E12 tanto a nível da integridade da membrana
como a nível morfológico, mesmo em baixas concentrações (1,6 μM).

A monitorização do desenvolvimento/polarização da monocamada celular e integridade da

membrana, permitiu concluir que após 21 dias ambas as culturas Caco-2 e co-culturas Caco-2/HT29-
MTX-E12 apresentam uma monocamada de células bem polarizada, necessária para a realização dos
ensaios de transporte. Para além disso evidenciou-se também as diferenças entre as células Caco-2 e as
Caco-2/HT29-MTX-E12, em que as co-culturas apresentam valores de TEER mais baixos que as
culturas Caco-2, proporcionando assim um valor mais próximo do que se encontra no intestino humano.

Com o ensaio de transporte, verificou-se que ao expor a células a uma concentração baixa de AFB1
existe uma clara diminuição de TEER, para ambas as culturas, ao longo de 24 h de exposição, existindo
perturbações na integridade da membrana intestinal. Esta diminuição é maior para o caso das culturas
Caco-2, quando se compara com as co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12. Por isso, conclui-se que a
presença do muco influência a eficácia com que a AFB1 afeta as células expostas, demonstrando assim
o seu papel fundamental enquanto barreira protetora.

A visualização da morfologia das células através da microscopia de imunofluorescência confocal

para além de confirmar os resultados obtidos nos ensaios de transporte, permitiu ainda visualizar as
diferenças morfológicas que existem entre as culturas Caco-2 e as co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12.
Foram evidenciadas as modificações na morfologia das células após estas serem expostas a AFB1,
incluindo as falhas nos filamentos de actina ao longo da parede celular. Também neste caso, esta
diferença evidenciada na morfologia demonstrou danos maiores para as células Caco-2, demonstrando
mais uma vez o papel do muco e a sua função protetora contra a exposição a AFB1.

Em estudos futuros, seria importante confirmar os resultados preliminares dos ensaios de

citotoxicidade obtidos neste estudo, dado a diferença que se verificou entre resultados obtidos e o que
se encontra descrito na bibliografia. De seguida, efetuar a determinação quantitativa da AFB1 das 199
amostras recolhidas nos ensaios de estabilidade e transporte, através de uma análise de HPLC-FD de
forma a determinar as taxas de permeabilidade desta micotoxina nas culturas de células ensaiadas, nos
ensaios de citotoxicidade e de transporte. Por último, avaliar a interação da micotoxina com o muco
(tendo em consideração outros indicadores), pois apesar de existir muita informação sobre o efeito da

33
micotoxina em ensaios in vivo e em órgãos específicos como o fígado e no sistema imunitário, a
bibliografia disponível relacionada com os efeitos das micotoxinas no trato intestinal é ainda limitada e
existem falhas nesta área, nomeadamente sobre os efeitos no muco e quais a consequências que esses
efeitos podem trazer para a saúde do indivíduo.

34
7. Bibliografia 1

1. Pinton, P.; Nougayrède, J.P.; del Rio, J.C.; Moreno, C.; Marin, D.E.; Ferrier, L.; Bracarense,
A.P.; Kolf-Clauw, M.; Oswald, I.P. The Food Contaminant Deoxynivalenol, Decreases Intestinal
Barrier Permeability and Reduces Claudin Expression. Toxicol Appl Pharmacol 2009, 237, 41–
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40
8. Anexos

Anexo 1 – Protocolo de contagem das células

Para a contagem de células utilizou-se 100 µL de células, sendo necessário ressuspender as

células no frasco de cultura antes de ser retirada a amostra. De seguida, os d 100 µL de meio de cultura
com a amostra de células foi colocada em ambas as câmaras centrais da câmara de contagem Neubauer
e o líquido foi coberto com uma lamela. A câmara de contagem foi colocada no microscópio e foram
escolhidas 3 grades (duas diagonalmente numa câmara e uma da outra câmara). Na contagem das células
considera-se os quadrantes numerados de 1-4 (Figura 8.1), sendo que quando as células tocam nos
limites das linhas desses quadrantes, a regra é que se conta as que tocam nas linhas de cima e à esquerda
e não se conta as que tocam nas linhas de baixo e à direita.

Por último é feita a média através da Equação (8.1), sendo que os valores devem de estar entre
30-100 x 104.
;<2<=<>
Equação (8.1) 𝑚 = >
∗ 10>

1 2

3 4

Figura 8.1 Contagem de células. Representação esquemática dos quatro quadrantes, utilizados pata a contagem de
células, da câmara de contagem Neubauer. (Adaptado de [32])

41
Anexo 2 – Monitorização dos valores de TEER ao longo dos 18-21 dias de desenvolvimento da
monocamada celular das culturas Caco-2 e co-culturas Caco-2/HT29-MTX-E12 e respetiva
estatística

Tabela 2.1. Valores de TEER Células Caco-2. Evolução dos valores de TEER das culturas de células Caco-2 de todas as
placas ao longo dos 21 dias de desenvolvimento da monocamada e respetivos parâmetros estatísticos.

42
 Tabela 2.2. Valores de TEER Células Caco-2/HT29-MTX-E12. Evolução dos valores de TEER das co-culturas de
células Caco-2 de todas as placas ao longo dos 21 dias de desenvolvimento da monocamada e respetivos parâmetros
estatísticos.

Tabela 2.3. Testes estatísticos entre cultura e co-cultura. Valores do p-value entre o desenvolvimento da monocamada
celular da cultura de células Caco-2 e co-cultura de células Caco-2/HT29-MTX-E12. Foi utilizado um intervalo de confiança
de 0,95.

43
Anexo 3 – Tabelas dos ensaios MTT e respetiva estatística

Tabela 3.1. Ensaio de citotoxicidade por MTT das células Caco-2. Valores de absorvância obtidos no espetrofotómetro
após as células Caco-2 serem expostas a diversas concentrações de AFB1 e respetivos parâmetros estatísticos

Tabela 3.2. Ensaio de citotoxicidade das células HT29-MTX-E12. Valores de absorvância obtidos no espetrofotómetro
após as células HT29-MTX-E12 serem expostas a diversas concentrações de AFB1 e respetivos parâmetros estatísticos

Tabela 3.3. Ensaio de citotoxicidade por MTT das células Caco-2/HT29-MTX-E12. Valores de absorvância obtidos
no espetrofotómetro após as células Caco-2/HT29-MTX-E12 serem expostas a diversas concentrações de AFB1 e
respetivos parâmetros estatísticos

44
Tabela 3.4. Testes estatísticos dos ensaios de citotoxicidade para as células Caco-2/HT29-MTX-E12. Valores do p-
value entre os valores de viabilidade das células Caco-2/HT29-MTX-E12 expostas a concentrações de AFB1 (0,8 μM –
25,6 μM) e respetivos controlos positivo (SDS) e negativo (meio de cultura). Foi utilizado um intervalo de confiança de
0,95.

Tabela 3.5. Testes estatísticos dos ensaios de citotoxicidade para as células Caco-2. Valores do p-value entre os valores
de viabilidade das células Caco-2 expostas a concentrações de AFB1 (0,8 μM – 25,6 μM) e respetivos controlos positivo
(SDS) e negativo (meio de cultura). Foi utilizado um intervalo de confiança de 0,95.

Tabela 3.6. Testes estatísticos dos ensaios de citotoxicidade para as células HT29-MTX-E12. Valores do p-value
entre os valores de viabilidade das células HT29-MTX-E12 expostas a concentrações de AFB1 (0,8 μM – 25,6 μM) e
respetivos controlos positivo (SDS) e negativo (meio de cultura). Foi utilizado um intervalo de confiança de 0,95.

45
Anexo 4 – Ensaio de Transporte: Valores de TEER após exposição a AFB1 (comparação entre
placas) e respetiva estatística

Figura 4.1. Valores de TEER nas células Caco-2. Representação dos valores de TEER das células Caco-2 expostas a 1,6
μM de AFB1 e respetivos controlos nas diversas passagens utilizadas. Os valores apresentados representam a média ± desvio
padrão de 5 ensaios independentes (2 réplicas).

Figura 4.2. Valores de TEER nas células Caco-2/HT29-MTX-E12. Representação dos valores de TEER das células
Caco-2/HT29-MTX-E12 expostas a 1,6 μM de AFB1 e respetivos controlos nas diversas passagens utilizadas. Os valores
apresentados representam a média ± desvio padrão de pelo menos 3 ensaios independentes (2 réplicas).

46
Tabela 4.1. Testes estatísticos dos ensaios de transporte para as células Caco-2. Valores do p-value entre os valores
de TEER das células Caco-2 não expostas a AFB1(controlo) e expostas. Foi utilizado um intervalo de confiança de 0,95.

Tabela 4.2. Testes estatísticos dos ensaios de transporte para as células Caco-2/HT29-MTX-E12. Valores do p-value
entre os valores de TEER das células Caco-2/HT29-MTX-E12 não expostas (controlo) a AFB1 e expostas. Foi utilizado
um intervalo de confiança de 0,95.

Tabela 4.3. Testes estatísticos dos ensaios de transporte para as células Caco-2 e Caco-2/HT29-MTX-E12. Valores
do p-value entre os valores de TEER após a exposição a AFB1 da cultura de células Caco-2 e co-cultura de células Caco-
2/HT29-MTX-E12. Foi utilizado um intervalo de confiança de 0,95.

47
Anexo 5 – Publicações/Comunicações realizadas no âmbito do projeto earlyMYCO

Artigos Científicos:

1. Serrenho, I.; Assunção, R.; Alvito, P. Exposição do Trato Gastrointestinal à Aflatoxina B1:
Um Impacto Negligenciado? Boletim Epidemiológico Observações 2021, 30, 37–42.

Conferências Internacionais com apresentação de posters:

1. Serrenho, I.; Assunção, R.; Alvito, P. Exposure of the gastrointestinal tract to Aflatoxin B1: an
overlooked impact?. 4th Virtual Conference on Food Contaminants ICFC2021.

2. Serrenho, I.; Vital, N.; Rolo, D.; Louro, H.; Pereira, J.; Matos, P.; Jordan, P.; Alvito, P. Effect
of Aflatoxin B1 in both Caco-2 and Caco-2/HT29-MTX models. Final UNGAP meeting titled
“Intestinal absorption assessment and enabling formulations’’.

3. Alvito, P.; Assunção, R; Bastos-Amador, P.; Boevre, M.; Duarte, E; Martins, C.; Serrenho, I.;
Silva, I.; Visintin, L.; Ferreira, M. Early-life exposure to MYCOtoxins and its impact on
health – a case study. World Mycotoxin Forum 2022.

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 Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP

Instituto_Nacional de Saúde Observações_ Boletim Epidemiológico 2021

Doutor Ricardo Jorge número

30
www.insa.pt

artigos breves_ n. 7 _ Alimentação e nutrição

_ Exposição do trato gastrointestinal à aflatoxina B 1 : um impacto negligenciado?

Exposure to aflatoxin B1 in the gastrointestinal tract: an overlooked impact ?
Inês Serrenho 1, 2 , Ricardo Assunção 1,3,4 , Paula Alvito 1,3
paula.alvito@insa.min-saude.pt

(1) Depar tamento de Alimentação e Nutrição, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, Lisboa, Por tugal
(2) Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, Lisboa, Por tugal
(3) Centro de Estudos do Ambiente e do Mar, Universidade de Aveiro, Aveiro, Por tugal
(4) Centro de Investigação em Saúde Pública. Escola Nacional de Saúde Pública, Universidade NOVA de Lisboa, Lisboa, Por tugal

_Resumo
A exposição humana a aflatoxina B 1 (AFB 1 ) através da ingestão de ali-
mentos contaminados e o seu impacto no trato gastrointestinal ( TGI)
constitui um domínio de crescente interesse científico. Para além do
conhecido potencial carcinogénico, os estudos experimentais em linhas
celulares, em animais e em populações humanas têm evidenciado um
relevante impacto desta micotoxina no TGI, incluindo no sistema imu-
nitário do intestino, órgão responsável por cerca de 70% das defesas
do organismo. A AFB 1 tem a capacidade de provocar alterações na bar-
reira intestinal afetando o seu equilíbrio e dinâmica, o que pode induzir
o aparecimento de inflamações intestinais crónicas, entre outras pato-
logias. Estas alterações podem afetar a população em geral, contudo
podem constituir uma preocupação acrescida para populações vulne-
ráveis como grávidas e crianças, em vir tude da transferência de AFB 1
através da placenta. Assim, o presente trabalho tem como objetivo sen-
sibilizar a comunidade científica para o potencial impacto da micotoxina
AFB 1 no intestino e contribuir para aler tar e capacitar os profissionais
de saúde com conhecimento científico, por forma a atuarem, da forma
mais adequada, face ao eventual aumento das patologias associadas
ao TGI, que poderão ocorrer em vir tude do maior número de ocorrên-
cias de contaminação alimentar por AFB 1, expectável como consequên-
cia das alterações climáticas.
_Abstract
Hu man exp osu re to af latox in B1 (AFB 1) throug h contaminate d food
ing e stion and i ts impact on the gastrointe stinal tract (GIT ) is a f ie ld of
sc ie nti f ic g rowing inte re st. In add ition to the re cog nize d c arc inoge nic
p ote ntial, exp e r ime ntal stud ie s on ce ll line s, animals and hu man p opu-
lations have shown a re levant impact of this mycotox in on GIT, includ-
ing on the innate immu ni t y of the inte stine, the organ re sp onsible for
about 70% of the body's defe nse s. AFB 1 has the abilit y to d isr upt the
inte stinal bar r ie r af fe cting its balance and dynamics, and cou ld pro -
mote the deve lopme nt of chronic inte stinal inf lammation, among othe r
patholog ie s. T he se cond i tions may af fe ct the ge ne ral p opu lation and
cou ld consti tute a mat te r of inc re ase d conce r n for vu lne rable p opu la-
tions, such as pre g nant wome n and child re n, due to the AFB 1 transfe r
ac ross the place nta. T he refore, this study aims to se nsitize the sc ie n-
ti f ic commu ni t y for the p ote ntial impact of the mycotox in AFB 1 in the
GIT and to contr ibute to ale r t and e mp owe r the he al th profe ssionals to
act base d on a de e p e r sc ie nti f ic k nowle dge, whe n face d wi th a p ossi-
ble increase in the number of pathologies associated to the GIT, which
could occur as a result of the expected increase of food contamination
by AFB 1 as a consequence of climate change.
_Introdução
O intestino é um dos primeiros órgãos a contactar com os
alimentos, após a sua ingestão. A absorção de contaminan-
tes presentes nos alimentos, como as micotoxinas (metaboli-
tos tóxicos produzidos por fungos) ocorre principalmente no
intestino delgado (onde se efetua 90% da absorção total do
que se ingere). É ainda neste órgão que ocorrem os níveis de
exposição de contaminantes mais elevados (1-6). O intestino
representa também a primeira linha de defesa contra possí-
veis infeções intestinais formando uma barreira entre o lúmen
(meio externo) e a corrente sanguínea (meio interno) (4-11).
A barreira intestinal está dividida em quatro níveis de prote-
ção conforme se representa na figura 1: 1 ) microbiota (bar-
reira biológica), constituída por bactérias comensais pre-
sentes no lúmen intestinal, com um papel fundamental na
homeostase da saúde intestinal, 2) muco (barreira química)
constituído por mucinas (MUC) e peptídeos antimicrobianos
(AMPs), produzidos pelas células caliciformes e pelas célu-
las de Paneth, respetivamente, impedindo que as bactérias
luminais estabeleçam um contacto direto com o epitélio,
3) epitélio (barreira física) constituído por uma monocama-
da de células epiteliais semipermeáveis (enterócitos) que se
encontram ligadas por junções de oclusão (tight junctions)
constituídas por proteínas transmembranares, moléculas de
adesão juncional (JAMs), claudinas e ocludinas, que regulam
seletivamente a passagem de nutrientes e água e impedem
a passagem de moléculas nocivas, através da via paracelu-

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Instituto_Nacional de Saúde Observações_ Boletim Epidemiológico

Doutor Ricardo Jorge

artigos breves_ n. 7

Figura 1: Representação esquemática da barreira intestinal numa situação de homeostase (normal) e

numa situação de exposição à micotoxina AFB 1 (adaptado de Gao, et al., 2020) (12) .

Equilíbrio da Barreira Intestinal Exposição a AFB1

Microbiota AFB1
1º Nível
Barreira Biológica
Microbiota

2º Nível sIgA
Barreira Química
Muco Mucinas
AMPs

Tight
3º Nível Junctions
Barreira Física
Epitélio

Enterócito Célula de Paneth Célula caliciforme

4º Nível
Barreira Imunológica Célula B
Célula
Sistema Imunitário Dendrítica
Intestinal
Célula T Macrófago

sIgA = imunoglobulina A secretora; AMPs = peptídeos antimicrobianos

lar e transcelular no intestino, e 4) sistema imunitário intesti-
nal (barreira imunológica) constituído por células imunes (cé-
lulas dendríticas, macrófagos, linfócitos B e T) e mediadores
imunológicos (citocinas e imunoglobulina A secretora (sIgA) ),
que regulam as respostas inflamatória e imune (4,7-10,12-16).
Uma barreira intestinal equilibrada e dinâmica é essencial
para que exista uma proteção eficiente. Ao afetar a barreira
intestinal, a AFB 1 vai perturbar este equilíbrio fazendo com
que haja uma disrupção da barreira e tornando o organismo
mais suscetível a inflamações intestinais crónicas, alterações
imunológicas e metabólicas que levam ao aparecimento de
doenças inflamatórias, principalmente em indivíduos geneti-
camente predispostos, como é o caso da doença celíaca e
de Crohn ou da colite ulcerosa (1,3,14,17-23).
Em virtude dos efeitos adversos para a saúde, o grupo
das aflatoxinas (AFs) foi incluído no Regulamento (CE) n.º
1881/2006 que estabelece valores máximos de AFs em ali-
mentos, destinados a crianças e adultos (1- 3, 24) . Estas são
produzidas por diversas espécies de fungos do género
Aspergillus e incluem as aflatoxinas B 1 ( AFB 1 ), B2 ( AFB 2 ),
G1 ( AFG 1 ), G2 ( AFG 2 ) e M1 (AFM 1 ), metabolito de AFB 1
que pode ser encontrado no leite de mamíferos. A AFB 1 é o
mais potente carcinogéneo hepático conhecido em mamí-
feros, estando por isso incluída no grupo 1 (carcinogénico
para humanos), segundo a Agência Internacional de Pes-
quisa sobre o Cancro (IARC, na sigla em inglês), para além
disso, apresenta ainda propriedades mutagénicas, terato-
génicas e imunossupressoras (11,13,16, 25) . Esta micotoxina
está presente numa grande variedade de alimentos como é
o caso dos amendoins, frutos de casca rija, frutos secos,
cereais e ainda especiarias (25) . Em Portugal a exposição a
AFB 1 através do consumo de cereais foi considerada uma
potencial preocupação para a saúde das crianças até aos
3 anos, em particular, as que consumiam elevadas quanti-
dades deste grupo de alimentos (26, 27) . Face à evidência
de que a AFB 1 tem a capacidade de atravessar a placenta
e de ser transferida para o feto durante a gestação, tornan-
do-o suscetível aos potenciais efeitos decorrentes desta
exposição, será importante conhecer o impacto da exposi-
ção precoce a esta micotoxina. Este objetivo integra-se no
âmbito do projeto earlyMYCO, que visa avaliar a exposição

40

Instituto_Nacional de Saúde Observações_ Boletim Epidemiológico
Doutor Ricardo Jorge
artigos breves_ n. 7
a micotoxinas de pares mãe-filho(s) através da biomonitori-
zação, avaliar o impacto das micotoxinas no sistema imuni-
tário intestinal e na microbiota intestinal através de estudos
in vivo e caracterizar o risco desta exposição (28) .
Os principais efeitos agudos decorrentes da ingestão de afla-
toxinas são as aflatoxicoses, que correspondem a hepatites
agudas associadas a vómitos, dores abdominais e edemas,
podendo, nos casos mais graves, levar à morte. Contudo
um dos maiores problemas associados a esta micotoxina,
é a exposição crónica podendo contribuir para o apareci-
mento de cancro hepático (13). Na Europa, e em particular
nos países da região mediterrânica como Portugal, prevê-se
um aumento de contaminação dos cereais (particularmente
no milho) por AFB 1 em virtude da subida de temperatura
decorrente das alterações climáticas, permitindo o desenvol-
vimento de espécies fúngicas toxigénicas em temperaturas
próximas dos 33 ºC, como é o caso da espécie Aspergillus
flavus, produtor de AFB 1 (29,30).
É por isso importante contribuir para disseminar o conheci-
mento científico relativo aos efeitos adversos da exposição
a AFB 1 , em especial para o intestino, visto a principal via de
exposição a esta micotoxina ser a ingestão de alimentos,
por forma a contribuir para a proteção da saúde humana e,
em especial, das populações mais vulneráveis.
_Objetivo
Este trabalho tem como objetivo sensibilizar a comunidade
para o potencial impacto da micotoxina AFB 1 no intestino,
contribuindo para alertar e capacitar os profissionais de
saúde com conhecimento científico neste domínio, por forma
a gerir, da forma mais adequada, um eventual aumento das
patologias associadas ao TGI. Estas poderão afetar, num fu-
turo próximo, a população em geral, mas, em particular, as
populações vulneráveis como grávidas e crianças, em virtu-
de das alterações climáticas e do aumento da contaminação
dos alimentos por AFB 1 , previstos para a Europa.
_Materiais e métodos
A pesquisa bibliográfica para este estudo foi realizada em
2021, através das bases bibliográficas Web of Science e
PubMed, tendo sido efetuadas sete pesquisas individuais
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incluindo os termos “Aflatoxin B 1” (comum a todas as buscas)
e “Caco-2 cells”, “Intestinal integrity”, “Transport”, “Intestinal
immunity”, “Microbiota”, “Antimicrobial response”, “Proteins
expression and tight junctions”, para o período 2000-2020.
De um total de 265 referências encontradas, foram excluídas
208 (correspondendo a duplicados e estudos fora do con-
texto pretendido) e analisadas 57.
_Resultados e discussão
Face à importância das potenciais consequências nefastas
para a saúde humana, decorrentes da exposição a AFB 1 ,
em particular do impacto no trato gastrointestinal ( TGI ), têm
sido realizados diversos estudos sobre a absorção e trans-
porte desta micotoxina no intestino, nomeadamente ao nível
do muco e epitélio intestinal, aplicando metodologias in
vitro, como a cultura e cocultura de células epiteliais intesti-
nais humanas (5,16,31,32). Neste âmbito são descritos dois
modelos de culturas celulares maioritariamente utilizados:
1 ) Células Caco-2, originalmente isoladas de um adenocar-
cinoma de cólon humano e 2 ) coculturas de células Caco-2
e HT29-MT X, também isoladas de um carcinoma colorre-
tal. As células Caco-2 são reconhecidas como modelo de
referência pela Food and Drug Administration (FDA) mime-
tizando a camada epitelial do intestino delgado (enteróci-
tos) (4,6,10) . As coculturas de células Caco-2/HT29-MT X,
representam um aperfeiçoamento do modelo de células
Caco-2 visto que as células HT29 são capazes de produzir
muco através das células caliciformes simulando de forma
mais eficiente o intestino delgado nos estudos de absor-
ção, inflamação e toxicidade (5,6) .
Ao nível dos estudos da microbiota e do sistema imuni-
tário intestinal, realizaram-se na sua maioria, estudos in
vivo (19, 20,34 - 36) usando ratos, mas também outras espé-
cies, como os porcos, devido à semelhança anatómica do
TGI com o dos humanos (6, 23,33) .
No quadro 1 encontra-se uma descrição sumarizada dos
principais efeitos decorrentes da exposição a AFB 1 , nos
quatro níveis da barreira intestinal, obser vados em estudos
in vitro e in vivo, efetuados nas últimas duas décadas.

Instituto_Nacional de Saúde Observações_ Boletim Epidemiológico
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artigos breves_ n. 7
Quadro 1: Resumo dos principais efeitos da micotoxina AFB 1 na barreira intestinal (microbiota, muco, epitélio e
sistema imunitário intestinal) obtidos através de estudos in vitro e in vivo efetuados entre 2000-2020.
Nível da barreira
Tipo de estudo/ espécie
intestinal
In vivo – Ratos
(Rat tus e Mus musculus)
In vivo – G alinhas
Microbiota
(Gallus gallus domesticus)
In vivo – Le itõe s
(Sus scrofa domesticus)
In vitro – cocultura
Caco-2 / HT29 -MT X
Muco
(feito em AFM 1 )
In vitro – cocultura
Caco-2 / HT29 -MT X
In vitro – cé lulas Caco-2
Epitélio In vitro – cé lulas Caco-2
In vitro – cé lulas Caco-2
In vivo – G alinhas
(Gallus gallus domesticus)
In vivo – Humanos
(Homo sapie ns)
In vitro – Monocitos
humanos
Sistema
In vivo – Pe r u domé stico
imunitário
(Me le ag ris gallopavo)
intestinal
In vivo – Ave s de c apoe ira
(Gallus gallus domesticus)
In vivo – c amarão
(L. vanname i )
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Principais efeitos Referências
Re duç ão da di ve rsidade microbia na no cólon
Efe itos adve rsos na populaç ão de bacté r ias ácido-láctic as (21, 22)
Proporç ão de Firmicutes e Bacte roidetes inalte rada
Aume nto no núme ro total de bacté r ias gram-ne gati vas
(33)
A lte raçõe s nos padrõe s de fe r me ntaç ão de Saccharomyces ce revisiae
Aume nto da abundância re lati va dos f ilos Bacte roidetes e Prote obacte ria
(23)
D iminuiç ão da abundância do f ilo Firmicutes
Modulaç ão do mRNA e da produç ão das prote inas MUC2, MUC5AC e MUC5B
(38)
Re duç ão dos ní ve is de tra nscr iç ão de MUC5B e MUC5AC
A lte raç ão signif ic ativa da ex pre s s ão e produç ão das mucinas e da abundância
de proteínas
(39)
Aume nto signif ic ati vo de proteínas MUC2 e MUCB5 se guido de uma re gulaç ão
ne gativa das mucinas
Comprometime nto da pe r me abilidade da bar re ira das cé lulas e pite liais inte stinais
D iminuiç ão da áre a de absorç ão (13, 25)
Ocor rê ncia de inf lamaçõe s e le sõe s inte stinais
D iminuiç ão dos valore s de re sistê ncia transe pite lial ( TEER)
(13, 25)
Aume nto da pe r me abilidade parace lular
Mor te ce lular
(13,15, 25,
Danos no DNA de cé lulas dife re nciadas e não dife re nciadas
31,40 - 42)
D iminuiç ão da ex pre s s ão do mRNA de claudina-3 e ocludina
Aume nto da suscetibilidade de galinhas a infe çõe s inte stinais por S. t yphimurium
e Salmone lla spp.
(19)
Aume nto, no je juno e no í le o, do núme ro de macrófagos e cé lulas CD8+ e
diminuiç ão das cé lulas CD4+
Aume nto da suscetibilidade a infe çõe s bacte r ianas e parasitár ias
(37 )
A lte raç ão da imunidade adquir ida
D iminuiç ão da fagocitose e ati v idade microbicida dos monócitos da se cre ç ão
(37 )
de IL-1, IL- 6 e do fator de ne crose tumoral
Re spostas inf lamatór ias levam a inf iltraç ão de monócitos
(35)
A lte raçõe s na ex pre s s ão de citocinas pro-inf lamatór ias
Re gulaç ão signif ic ati va dos tra nscr itos de di ve rsos ge ne s de re sposta à IL-2
Inibição da atividade dos linfócitos T e B e da produção de anticorpos e de macrófagos
A lte raçõe s nos fe nótipos das cé lulas T (20,36)
D iminuiç ão da pe rce ntage m de cé lulas B
Inibi o do fator de ne crose tumoral- ( TNF- ), IFN-y e das inte r leucinas IL-1, IL-2,
IL-4, IL- 6, IL-10 e IL-17
Aume nto da ex pre s s ão re lati va de Toll, proPO, Rab, GST e IMD (ge ne s imune s
(34)
re pre se ntativos impor tante s no inte stino), se guindo-se uma diminuiç ão total da
ex pre s s ão dos me smos
42

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artigos breves_ n. 7
1. Microbiota
A maioria dos estudos sobre o efeito da AFB 1 na microbiota
(barreira biológica) foi efetuada usando animais tendo sido re-
ferido, de uma forma geral, que existem diferenças significati-
vas entre a composição da microbiota intestinal dos grupos
controlo em comparação com as dos grupos experimentais,
existindo uma maior abundância do número de espécies de
bactérias e de bactérias em cada espécie, nos grupos contro-
lo, tanto a nível do filo como do género (14,21-23,33).
2. Muco
A literatura disponível neste domínio foi escassa tendo sido
identificados só dois estudos sobre os efeitos da micoto-
xina AFM 1 no muco (barreira química). Os resultados evi-
denciaram uma modulação significativa dos níveis de ácido
ribonucleico mensageiro (mRNA) e produção de proteínas
das mucinas MUC 2 , MUC5A e MUC5B, pela AFM 1 (metabo-
lito da AFB 1 ) refletindo a influência direta das AFs na com-
posição (proteínas) e função (proteção) do muco, podendo
levar a inflamações gastrointestinais e até mesmo ao apa-
recimento de cancros (38,39) .
3. Epitélio
Na figura 1 representa-se esquematicamente o efeito da
AFB 1 nas células epiteliais intestinais Caco-2 evidenciando
um aumento da permeabilidade paracelular (entre duas
células adjacentes) traduzida na alteração da resistência
transepitelial (TEER), diminuição da área de absorção, e
desencadeando processos inflamatórios e lesões intesti-
nais (13, 25) . Verificou-se ainda que após a exposição, ocor-
ria morte celular (em função do tempo e concentração),
danos do ácido desoxirribonucleico (DNA) de células dife-
renciadas e não diferenciadas e diminuição da expressão
do mRNA de claudina-3 e ocludina, nas proteínas de junção
oclusiva (13,15, 25,31,40 - 42) .
4. Sistema imunitário intestinal
No que diz respeito aos efeitos da AFB 1 no sistema imunitá-
rio intestinal, verifica-se que estes são bastante complexos
e a bibliografia escassa. Os seis estudos publicados revela-
ram, de um modo geral, um aumento da suscetibilidade dos
animais e humanos (crianças) a infeções bacterianas e para-
43
Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP
sitárias (19,37), alteração da população de macrófagos e cé-
lulas imunitárias, alteração na expressão de citocinas pré-in-
flamatórias, inibição da atividade dos linfócitos B e T e dimi-
nuição total dos genes imunes, no intestino (20,34-37).
_Conclusões
Com os resultados descritos neste trabalho, evidencia-se o
forte impacto que a micotoxina AFB 1 poderá provocar nos
quatro níveis da barreira intestinal, comprometendo a imuni-
dade do intestino e consequentemente, de todo o organismo.
A manutenção do equilíbrio intestinal é de extrema impor-
tância visto que contribui para a saúde do organismo e, por
isso, per turbações, como a disfunção da barreira intesti-
nal, podem originar efeitos adversos para a saúde humana,
como é o caso das doenças inflamatórias intestinais.
Dado que se torna cada vez mais evidente que a exposição
precoce a contaminantes químicos pode levar ao apareci-
mento de doenças no adulto, tais como infeções, cancro,
diabetes e doenças autoimunes, torna-se, pois, importante
desenvolver estudos que visem avaliar a importância do am-
biente intrauterino e dos primeiros anos de vida na saúde da
criança e do futuro adulto.
Financiamento:
Os autores agradecem à FCT/MCTES pelo financiamento com
fundos nacionais relativos ao projeto earlyMYCO (PTDC/MEDTOX
/28762/2017) e ao CESAM (UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020).
R.A. agradece pelo FCT Individual CEEC 2018 Assistant Resear-
cher Grant CEECIND/01570/2018.
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 Exposure of the gastrointestinal tract to Aflatoxin B1 : an
overlooked impact?
Inês Serrenho 1,2 , Ricardo Assunção 1,3,4 and Paula Alvito 1,3
1Departamento de Alimentação e Nutrição, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, Lisboa, Portugal
2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal
3Centro de Estudos do Ambiente e do Mar, Universidade de Aveiro, Aveiro, Portugal
4 NOVA, National School of Public Health, Public Health Research Centre, Universidade NOVA de Lisboa, Lisboa, Portugal

Intruducti
on
The intest
ine repres
intestinal ents the
infections, first line
forming a of defens
bloodstream barrier be e against
. This barri tween the possible
balance is er is divided lumen an
essential fo into 4 leve d the
r efficient ls of protectio
protection n and its
to occur (F
Aflatoxin ig.1)(1,2).
B1 (AFB1 ) is
mammals the most
and it is pr potent he
esent in a patic carc
food is pred wide varie inogen kn
icted to in ty of foods. own in
years due cr ease in ce Its occurre
to climatic re als in Euro nce in
balance, ca ch anges (1,3 pe within the
using a di ). The ingest ne xt 100
susceptible sruption of ion of AFB
to chronic th e barrier, 1 di stur bs this
metabolic intestinal making th
changes. inflammat e body m
ion, immun ore
ological an
d
In Portuga
l, exposure
considered to AFB1 th
a potentia ro ug h consum
(1,4). Give l health co ption of ce
n the eviden ncern for reals was
ce that AF children up
and be tra B ha to 3 years
nsferred to 1 s an ability old
to know th th e fetus du to cross the pl
e impact of ring pregna acenta
objective of early expo ncy, it will
the earlyM su re to this myc be im po rtant
YCO projec otoxin whi
t (1,5). ch is the Figure 1: Schematic representation of the intestinal barrier in a situation of homeostasis (normal)
and in a situation of exposure to mycotoxin AFB1 . (adapted from 2) . sIgA: secretory immunoglobulin
A. AMPs: antimicrobial peptides.

Microbiot
a: Mucus:
Objective of AFs
on
rences in fluence
Direct in
This work aims to sensitize the scientific community to the
ant diffe p osition
potential impact of mycotoxin AFB 1 in the intestine, contributing Signific n of the the c o m n
p os it io functio
to alert and empower health professionals with scientific the com s) and
ic ro b io ta (protein ) of mu
cus.
knowledge in this field, in order to manage a possible increase in gut m c tio n
the gastrointestinal tract associated pathologies that may occur (prote
in Europe due to climatic change, in particular, the exposure of
vulnerable populations to AFB1 .

Results
:
Methodology e System
al Immun
Intestin d
Epitheliu imals an
The bibliographic search for this study was carried out in 2021, m: ility of an
using the Web of Science and PubMed search engines, including Changes
ea se d susceptib ct er ia l and
in the tr Incr to ba
resistan a n sepithel (children)
the terms “Aflatoxin B 1” (common to all searches) and “Caco-2 ce (TEE
R) that
ial humans infections
cells” “Intestinal integrity”, “Transport”, “Intestinal immunity”, the incr
ease of result in parasitic
“Microbiota”, “Antimicrobial response”, “Proteins expression the para of
permea cellular pulation
and tight junctions”, for the period 2000-2020. A total of 57 bility in the po e cells,
Change d immun
references were analysed. ag es an
Triggerin macroph of pre-
g inflam pression
process matory in the ex hibition
of
es and in change to kines, in
testinal
fl am m ator y cy
m ph oc ytes and
lesions in d T ly e
ity of B an nes in th
the activ mune ge
ta l de cr ease in im
to intestin e
Table 1. Summary of the main effects of mycotoxin AFB 1 on the intestinal barrier (microbiota, mucus, epithelium and
intestinal immune system) obtained through in vitro and in vivo studies carried out between 2000-2020.

Conclusion

With the results described in this work, the strong impact

that the mycotoxin AFB1 can provoke in the four levels of
the intestinal barrier is evidenced, compromising the
immunity of the intestine and, consequently, of the
whole organism.

As it becomes increasingly evident that early exposure to

chemical contaminants can lead to the onset of diseases
in adults it is therefore important to develop studies
aimed at assessing the importance of the environment
intrauterine and first years of life in the health of the
child and the future adult.

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 EFFECT OF AFLATOXIN B 1 IN BOTH CACO-2 AND
CACO-2/HT29-MTX MODELS
1,2 3,4 3,4 3,4 3,5 3,5 3,5 1,6
Inês Serrenho , Nádia Vital , Dora Rolo , Henriqueta Louro , Joana Pereira , Paulo Matos , Peter Jordan and Paula Alvito
1 Department of Food and Nutrition, National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge (INSA) , Lisbon, Portugal
2 Faculty of Science of the University of Lisbon, Lisboa, Portugal
3 Department of Human Genetics, National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge (INSA) , Lisbon, Portugal
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Introduction methodology
Aflatoxins contaminate a variety of staple foods and cause an array of acute and chronic
Cell line and culture conditions: The human colon cancer cell line Caco-2 (ATCC HTB-37) and
disorders. Aflatoxin B1 (AFB1) is the most potent hepatic carcinogen known in mammals and is
HT29-MTX-E12 (ATCC 12040401) , kindly provided by the Genetic Department of the National
classified by IARC in Group I (carcinogenic to humans). Exposure to AFB1 may affect the general
Institute of Health Dr. Ricardo Jorge, were cultivated separately in DMEM supplemented with 10%
population and could constitute a matter of increased concern for vulnerable populations
fetal bovine serum (FBS), 1% non-essential amino acids, 1% Amphotericin B and 1% Pen/Strep
(pregnant women and children) due to the AFB1 transfer across the placenta [1,2].
(10000U de penicillin/10 µg de streptomycin) and kept at 37°C at 5% CO2 [6].

There is an increasing awareness of the deleterious effects of mycotoxins within the

Cell barrier integrity: Cultures of Caco-2 cells and co-cultures of Caco-2/HT29-MTX-E12 cells
gastrointestinal tract (GIT). Evidence indicates that disruption of the epithelial barrier is well
were seeded in the proportions 1:0 and 9:1, respectively, in a 12-well Transwell with a final
established. However, intestinal barrier function on its luminal side also involves mucus,
concentration of 1x10^5 cell/cm2 in each insert. Cells with TEER (transepithelial electrical
providing a chemical line of defense for the host, which has rarely been considered in the
resistance) values > 500Ω were used in integrity assays. TEER values were monitored as a function
context of mycotoxin exposure [3]. To the best of our knowledge, there are no apparent data
of time during the 18-21 days of cell growth and after 1h, 2h, 3h, 6h and 24h of exposure to 1.6 µM
available on the effect of AFB1 in intestinal mucus.
of AFB1 [3], in duplicate. All TEER values were the mean values.

In vitro studies with different cell lines are a great option to predict the in vivo response. Caco-2
Confocal Immunofluorescence Microscopy: Cells were washed twice in PBS, immediately fixed
cell line have been the most widely use cell model over the last 20 years [4]. However, to better
with 4% (v/v) formaldehyde in PBS and permeabilized with 0.5% (v/v) Triton X-100 in PBS for 30 min.
mimic the conditions of the intestine (resistance values and different cell types interaction), co-
After, a 30 min incubation step with phalloidin-TRITC was performed and cells were washed 3× in
cultures of Caco-2 cells with other cell types have been used, such as the mucus-secreting
PBS. Cells were briefly stained with 1.25 μg/mL DAPI, washed again, post-fixed with 4% (v/v)
HT29 cells [5].
formaldehyde in PBS for 10 min. Then cover slips were mounted on glass slides in VectaShield and
sealed with nail polish. The 405 nm and 532 nm laser lines of a Leica TCS-SPE confocal
Objective microscope were used to acquire one Airy thick XZ, and Z-stacks of XY images from polarized
monolayers in transwell filters. Recorded images were processed with Leica in-built software and
Evaluate the effects of AFB1, in healthy population, on cell barrier integrity and mucus, in both
assembled in figures with Adobe Photoshop software [7].
Caco-2 and Caco-2/HT29-MTX models exposed to the mycotoxin during 24h, in a tentative to
contribute to determine the deleterious effects of ingested mycotoxins, particularly AFB1, on
mucus.

Results
A
Monolayer growth: TEER values of both cultures
increased as a function of time and reaches
values > 500Ω, between 13-15 days of growth
(Fig.1A). At 20 days of growth, the co-cultures
presented lower TEER values (873Ω) than the
Caco-2 alone (965Ω) (Fig.1A), approaching the in
vivo values of intestinal resistance.

Cell barrier integrity: Cells exposed to 1.6 µM of A B

AFB1 (18-21 days) showed a decrease in TEER
values in a time-dependent manner (Fig.1B) B
which confirms its effect on the membrane
integrity (Fig.2). The lowest TEER value was
obtained after 6h of exposure for Caco-2 cells
(282Ω) and after 3h for co-cultures (498Ω)
(Fig.1B). This could suggest that the mucus
could protect the epithelium integrity against the
toxic effects of AFB1 . After 24h of exposure to C D
AFB1 , an increase in TEER values was
Figure 2. Confocal Immunofluorescence Microscopy of: A) Caco-2; B) Caco-2 after 3h of
registered in both Caco-2 (628Ω) and Caco- exposure to 1.6 µM AFB1 ; C) Caco-2/HT29-MTX-E12; D) Caco-2/HT29-MTX-E12 after 3h of
2/HT29-MTX (574Ω) cultures (Fig.1B). This could exposure 1.6 µM AFB1.
Arrows indicate a change of morphology in cells exposed to 1.6 µM AFB1 .
be attributed to the recovering of membrane - Actin filament marker in red (Phaloidin); - Cell nuclei in blue (DAPI)
integrity due to mycotoxin degradation to other
less toxic metabolites or to a rapid intestinal
uptake [3].
Figure. 1. TEER value : A) for monolayer growth in Caco-2 (n=4) and Caco-2/HT29-MTX-E12 (n=3) ; B)
before and after (0h, 1h, 2h, 3h, 6h and 24h) exposure of Caco-2 (n=4) and Caco-2/HT29-MTX-E12 (n=3)
and the respective controls (not exposed) to 1.6 µM of AFB1 . Data expressed as mean values.

conclusion
As far as the authors know, this is the first study addressing the toxic effect of AFB1 in mucus showing that even at low concentrations AFB1 affected the
intestinal integrity, although mucus evidenced its protective role.

Evaluation of the mycotoxins/mucus interplay considering other indicators such as composition, thickness, and penetrability of mucus, mucin O-glycosylation
thus warrants further attention [3].

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 Early-life exposure to MYCOtoxins and its impact on
health - a case study
Paula Alvito1,2,*, Ricardo Assunção1,2,3, Patricia Bastos-Amador4, Marthe de Boevre5, Elsa L. Duarte6,7, Carla Martins1,2,8,9, Inês Serrenho1, Inês Silva6, Lia Visintin5, Manuela Ferreira4,10

1Food and Nutrition Department, National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge, Lisbon, Portugal; 2 CESAM, Centre for Environmental and Marine Studies, University of Aveiro, Aveiro, Portugal; 3 Egas Moniz – Cooperativa de Ensino Superior, CRL, 2829-511 Caparica,
Portugal; 4 Champalimaud Centre for the Unknown, Champalimaud Foundation, 1400-038 Lisboa, Portugal; 5 Centre of Excellence in Mycotoxicology and Public Health, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Ghent University, Ghent, Belgium; 6 School of Science and
Technology, Universidade de Évora, Évora, Portugal, 7 MED-Mediterranean Institute for Agriculture, Environment and Development, Évora, Portugal; 8 NOVA National School of Public Health, Public Health Research Centre, Universidade NOVA de Lisboa, Lisbon,
Portugal; 9 Comprehensive Health Research Center (CHRC), Lisbon, Portugal; 10 Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, UC Biotech, Biocant Park, 3060-197 Cantanhede, Portugal
* corresponding author: paula.alvito@insa.min-saude.pt

Introduction
Early-life exposure to hazardous compounds is an emerging research field that urgently needs to be investigated, as an attempt to contribute to exposome research. Recent human biomonitoring data
revealed that the Portuguese population is exposed to mycotoxins. Considering this, a project designated by earlyMYCO (Early-life exposure to MYCOtoxins and its impact on health) was developed to
assess the risk of early-life exposure to mycotoxins in biological samples.
To accomplish this task, a pilot cohort study was developed to assess the exposure of pregnant women and infants to mycotoxins, including the collection of biological samples, sociodemographic and food
consumption data, as well as in vivo experimental assays to determine the intestinal immune consequences and microbiota modifications upon early-life exposure to mycotoxins. A final integrative overview,
to gather epidemiological and toxicological data aimed to characterize the risk and the health impact associated with early-life exposure to mycotoxins was performed. Considering the potential impact on
health and the scarce data available regarding early-life exposure to mycotoxins, earlyMYCO project proposed to answer key questions, reported below as well as associated answers.

Is this exposure a health

threat?
Are pregnant women and infants until six
Considering the exposure levels, a low risk of months exposed to mycotoxins?
mothers’ exposure to the main mycotoxins analyzed is
expected, since urine samples did not reveal
detectable levels of these compounds; however, Yes, the mycotoxins’ biomarkers detected were AFB1, OTA, DON and bZEL in
infants’ urine samples presented a DON mean value urine samples (mother and children), and AFB1, aZEL, FB1, FB2 and FB3 in breast
of 14.8 ng/mL (corresponding to 148.0 µg/kg bw/day milk samples.
through reverse dosimetry), which could represent a The earlyMYCO pilot study enrolled 19 pairs of mother and children, with a loss
risk for this population group. to follow-up ranging between 11% and 47% for different moments of
observation. Food consumption data revealed that foods consumed more
frequently during the week were bread, dairy products, non-alcoholic drinks (tea
and coffee), animal products (meat and fish) and pasta. Regarding infants, 22%
were fed with infant formula and 78% were exclusively breastfed.

Does this early-life exposure influence the Which is the burden derived from
intestinal immune system development? the exposure to mycotoxins?

Yes, results indicate that maternal exposure to mycotoxins impacts

the development of offspring intestinal immune system. Notably, Metagenomics analysis of faeces from litters of AFB1
maternal exposure to AFB1 promoted an increase of overall T cell treated female mice and controls revealed that, although
population, while it also resulted in a selective reduction of the overall diversity (Shannon diversity index) of the
cytokine-producing innate lymphoid cells group 2 (ILC2) population microbiome wasn’t affected between groups, the
in intestine of the progeny. These alterations were associated with microbiome composition varied between AFB1 and control
decreased expression of Reg3b and Reg3g by the intestinal faecal samples (Bray–Curtis dissimilarity index).
mucosa of progeny. In particular, some beneficial species were diminished in
As happened in in vivo assays, in vitro approach using intestinal cell the litters from AFB1 treated females.
lines Caco-2 and Caco-2/HT29-MTX models exposed to AFB1
during 24h, confirmed the deleterious effects of AFB1 on intestinal
membrane integrity and its effect on mucus layer.

Conclusion
This study aims for the first time in Portugal to assess the early-life exposure to mycotoxins through a mother & child cohort. It is expected that results obtained within earlyMYCO will contribute to have a
deeper knowledge on exposure of vulnerable population groups (pregnant women and infants) and to understand the impact of early-life exposure to mycotoxins. Unfortunately, due to covid-19 the number
of samples was restricted. Results are expected to contribute to reach an accurate risk assessment framework and to establish and prioritize preventive measures to reduce exposure to chemicals and risk,
especially for vulnerable population groups as pregnant women and infants.
These preliminary results open an extensive field to further investigate the association between mycotoxins and microbiome, as the latest is increasingly recognized as a major player in a wide spectrum of
diseases.

Acknowledgments
This work was funded by FCT/MCTES through national funds, to earlyMYCO
(PTDC/MED-TOX/28762/2017), and CESAM (UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020).