BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO

MARIANA GONÇALVES DE OLIVEIRA TARANTO

ORIENTADOR: PROF. DR. EDSON ANTUNES

MEMBROS:

1. PROF. DR. EDSON ANTUNES

2. PROFª. DRª. SORAIA KÁTIA PEREIRA COSTA

3. PROF. DR. RICARDO MIYAOKA

4. PROFª.DRª. FERNANDA BRUSCHI MARINHO PRIVIERO

5.PROF.DR. CARLOS RENATO TIRAPELLI

Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca

examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 20 de fevereiro de 2017

 DEDICATÓRIA

Aos meus familiares

Meus pais, Doraci e Fátima, minha irmã Aline, Matheus e Sophia

Meus sogros Luiz e Cleuza, e ao Lucas

Que sempre estiveram presentes, apoiando minhas escolhas e

torcendo por meu sucesso e felicidade em todos os momentos.

Acima de tudo, e como sempre, meus agradecimentos mais profundos ao

meu querido, paciente e incomparável esposo, Leonardo.

 AGRADECIMENTOS

Ao meu querido orientador Professor Edson Antunes.

Agradeço imensamente por sua orientação, enorme paciência,

convivência diária e amizade, que certamente contribuiram muito para

minha formação pessoal e profissional.

 AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me permitido realizar mais esta etapa em minha vida profissional.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnólogico, CNPq, e à

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, pelo apoio

financeiro, sem o qual este trabalho não poderia ser realizado.

Agradeço aos queridos amigos de laboratório: Julio Alejandro, Fabiano, Eduardo,

Fábio Henrique, Sandra, Luiz Ricardo, Rafael, Marcy Lancia, Camila Mendes,

Camila Pereira, Alberto, Diana, Edith e Cristiano. Obrigada por toda amizade,

disposição constante, pelos muitos cafézinhos, discussões científicas e momentos de

descontração.

A Glaucia, por sua amizade e auxílio técnico.

Às Professoras Fabíola Z. Mónica, Sisi Marcondes, Elen T. Landucci e aos

Professores Gabriel F. Anhê e Stephen Hyslop, pela amizade, apoio científico, e por

cederem seus laboratórios para a realização deste trabalho.

Aos amigos e funcionários do Departamento de Farmacologia. A Maísa e Cidinha,

sempre tão prestativas. Ao Sr. Miguel, Toninho, Aguinaldo e Ivani, pelo trabalho e

cuidado diário com os animais de experimentação.

A todos aqueles que talvez possa ter esquecido neste momento, mas que estão

presentes em meu coração.

 RESUMO

A Cistite Intersticial/Síndrome da Dor Vesical (CI/SDV) é uma doença inflamatória

crônica caracterizada por dor suprapúbica, desconforto, urgência e excessiva freqüência

urinária, além de prejudicar profundamente a qualidade de vida dos pacientes. A cistite

induzida por ciclofosfamida (CYP) é um modelo experimental amplamente utilizado

para investigação da CI/SDV devido à sua similaridade com a doença humana. Estudos

mostram que o estresse oxidativo excessivo durante a inflamação pode comprometer a

função da bexiga ao prejudicar a sinalização óxido nítrico (NO)/ guanilato ciclase

solúvel (GCs)/GMPc. Os ativadores GCs, NO e heme-independentes, têm elevada

afinidade para a forma oxidada (insensível ao NO) desta enzima, sendo capazes de

elevar a produção de GMPc, restaurando a sinalização. Este estudo teve como objetivo a

padronização de um modelo de cistite induzida por CYP, com ênfase em determinar o

melhor modelo experimental para o estudo das disfunções miccionais observadas na

cistite induzida por CYP e avaliar as alterações na via de sinalização GCs/GMPc.

Avaliou-se ainda, os efeitos protetores do ativador da GCs, BAY 58-2667, na disfunção

miccional e processo inflamatório associado à cistite. Utilizaram-se camundongos

C57BL/6, fêmeas, com 8 a 10 semanas de idade (20-25 g). A cistite foi induzida por

injeção(ões) de CYP (75-300 mg/kg, i.p) e os animais avaliados após 4, 24 horas ou 10

dias. Para avaliação da prevenção da cistite por BAY 58-2667, os animais foram pré-

tratados com BAY 58-2667 (1 mg/kg) ou o seu veículo (transcutol/cremophor/água,

1:2:7, v:v), por gavagem, 1 hora antes da indução de cistite, e os estudos foram

realizados 24 horas após a administração de CYP. Os padrões de micção em animal

acordado (micção em papel filtro) e anestesiado (cistometria), assim como as contrações

in vitro da bexiga foram determinados. Em camundongos com movimento livre, a

injeção de CYP reduziu o volume da micção e aumentou o número de manchas de

micção. Os registros cistométricos de camundongos injetados com CYP revelaram

aumentos significativos da freqüência de micção e contrações não miccionais (CNMs),

juntamente com diminuições na capacidade da bexiga, intervalos de micção e

complacência. Além da disfunção miccional, observou-se o desenvolvimento de

processo inflamatório, evidenciado por aumento no peso vesical, na atividade de

mieloperoxidase (MPO) e na expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2), além de

alterações histológicas que indicaram infiltrado inflamatório, desorganização tecidual e

denudação do urotélio. O pré-tratamento dos animais com BAY 58-2667 preveniu

significativamente as alterações miccionais observadas tanto em animais com

movimento livre quanto na cistometria, e normalizou a redução da contração vesical

induzida por carbacol. No tecido vesical, a expressão das subunidades α1 e β1 da GCs e

os níveis de GMPc foram significativamente reduzidos no grupo CYP, alterações

prevenidas pelo tratamento com BAY 58-2667. A exposição à CYP aumentou a geração

de espécies reativas de oxigênio (ERO) tanto no detrusor quanto no urotélio, sendo esta

alteração normalizada pelo BAY 58-2667. Os parâmetros inflamatórios avaliados nas

bexigas do grupo CYP permaneceram inalteradas pelo pré-tratamento com BAY 58-

2667. Em conclusão, os ativadores da GCs podem constituir uma nova e promissora

abordagem terapêutica para o tratamento da cistite intersticial.

Palavras chave: bexiga urinária, cistometria, cistite, síndrome da dor vesical, GMP

cíclico
 ABSTRACT

Interstitial Cystitis/Bladder Pain Syndrome (IC/BPS) is a chronic inflammatory

disease characterized by suprapubic pain, discomfort, urgency, and excessive urinary

frequency, and profoundly impairs patient’s quality of life. Cyclophosphamide (CYP)-

induced cystitis is a widely used experimental model for IC/BPS research because of its

similarity with the human disease. Studies show that excessive oxidative stress during

inflammation affect the bladder function by impairing the nitric oxide (NO) / soluble

guanylate cyclase (sGC) / cGMP signaling pathway. NO- and heme-independent sGC

activators have high affinity for the oxidized, NO-insensitive, form of this enzyme, being

able to raise cGMP production, restoring the signaling. This study aimed to standardize

a CYP-induced cystitis animal model, with an emphasis on determining the better

experimental model for the study of voiding dysfunctions observed in CYP-induced

cystitis and also evaluate the changes in sGC/cGMP signaling pathway. The protective

effects of BAY 58-2667 (sGC activator) on voiding dysfunction and inflammatory

process associated with cystitis were also evaluated. Female C57BL/6 mice, 8-10 weeks

old (20-25g) were used. Cystitis was induced by an injection(s) of CYP (75-300 mg/kg,

i.p.) and the animals were evaluated after 4, 24 hours or 10 days. For evaluation of the

prevention of cystitis by BAY 58-2667, the animals were pretreated with BAY 58-2667

(1 mg/kg) or its vehicle (transcutol/cremophor/water, 1:2:7, v:v) by gavage 1 hour prior

cystitis induction and studies were performed 24 hours after CYP administration. The

patterns of micturition in both awake (micturition in filter paper; free movement) and

anesthetized (cystometry), as well as in vitro bladder contractions were determined. In

mice with free movement, CYP injection reduced the volume of micturition and

increased the number of micturition spots. Cystometric records of mice injected with
CYP revealed significant increases in urinary frequency and non-voiding contractions

(NVCs), along with decreases in bladder capacity, micturition intervals and

compliance. In addition to voiding dysfunction, the development of an inflammatory

process was evidenced by an increase in bladder weight, myeloperoxidase activity

(MPO) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression, as well as histological changes,

indicating inflammatory infiltrate, tissue disorganization and urothelium denudation.

Pretreatment of the animals with BAY 58-2667 significantly prevented the micturition

changes observed in both free-moving and cystometry, and normalized the reduction of

carbachol-induced bladder contraction. In the bladder tissue, the expression of α1 and

β1 subunits of GCs and the cGMP levels in the CYP group were marked reduced, which

were all prevented by BAY 58-2667 treatment. Exposure to CYP increased the

generation of reactive oxygen species (ROS) in both detrusor and urothelium, which

was normalized by BAY 58-2667. The inflammatory parameters evaluated in the

bladders of the CYP group remained unchanged by pre-treatment with BAY 58-2667. In

conclusion, GCs activators may constitute a new and promising therapeutic approach

for the treatment of interstitial cystitis.

Key words: urinary bladder, cystometry, cystitis, bladder pain syndrome, cyclic GMP
 LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Anatomia e histologia do trato urinário inferior............................... 22

Figura 2. Desenho esquemático sobre o ciclo de micção................................. 23

Figura 3. Controle neural do trato urinário inferior........................................ 24

Figura 4. Possíveis mecanismos envolvidos na etiologia da Cistite

Intersticial/Síndrome da Dor Vesical............................................... 29

Figura 5. Estimuladores e ativadores da enzima guanilato ciclase solúvel.... 33

Figura 6. Peso corporal, alterações macroscópicas, razão peso da

bexiga/peso corporal e atividade da MPO..................................... 47

Figura 7. Perfil histológico de animais controles............................................. 48

Figura 8. Alterações histológicas induzidas pela ciclofosfamida (CYP)......... 49

Figura 9. Registro do perfil de micção de animais controle e com cistite....... 51

Figura 10. Traçados cistométricos representativos de um animal por grupo.... 52

Figura 11. Resposta contrátil ao carbacol em detrusor isolado de animais

controles e com cistite...................................................................... 53

Figura 12. Resposta contrátil ao cloreto de potássio (KCl, 80mM) em

detrusor isolado de animais controles e com cistite......................... 54

Figura 13. Resposta contrátil à estimulação elétrica em detrusor isolado de

animais controles e com cistite......................................................... 55

Figura 14. Alterações induzidas pela injeção de ciclofosfamida (CYP, 300

mg/kg) sobre expressão protéica e gênica das subunidades da

enzima guanilato ciclase solúvel (GCs).......................................... 56

Figura 15. Níveis de GMPc em bexigas de animais com cistite induzida pela

injeção de CYP (300 mg/kg) ao longo de 24 horas................. 57

 Pág.
Figura 16. Registro do perfil de micção de animais controle e com cistite,

pré-tratados ou não com BAY 58-2667 (1 mg/kg)........................... 59

Figura 17. Análise cistométrica de animais controle e com cistite pré-tratados

ou não com BAY 58-2667 (1 mg /kg)......................................... 60

Figura 18. Estudo funcional in vitro com detrusor isolado de animais controle

e com cistite, pré-tratados ou não com BAY 58-2667(1 mg/kg)...... 61

Figura 19. Efeito do tratamento com BAY 58-2667 na expressão das

subunidades α1 (A) e β1 (B) da enzima guanilato ciclase solúvel

(GCs) em animais submetidos à cistite por ciclofosfamida

(CYP)............................................................................................... 62

Figura 20. Efeito do tratamento com BAY 58-2667 (1 mg/kg) sobre os níveis

de GMPc...................................................................................... 63

Figura 21. Determinação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO)

no detrusor e urotélio em bexigas de animais controle e com

cistite, tratados ou não com BAY 58-2667 (1 mg/kg)...................... 64

Figura 22. Efeitos do pré-tratamento com BAY 58-2667 (1 mg/kg) sobre os

parâmetros inflamatórios vesicais..................................................... 65

 LISTA DE TABELAS

Pág.

Tabela 1. Alterações nos parâmetros cistométricos dos animais controles e

com cistite......................................................................................... 52
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACh, acetilcolina

A.U., unidades arbitrárias

ANOVA, análise de variância

ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATP, adenosina trifosfato

AMPc, monofosfato cíclico de adenosina

cDNA, ácido desoxirribonucléico complementar

CI/SDV, Cistite Intersticial/Síndrome da Dor Vesical

CNMs, contrações não miccionais

COX-2, ciclooxigenase 2

CTRL, controle

CYP, ciclofosfamida

DAG, diacilglicerol

DHE, diidroetídio

D.O., densidade óptica

Emax, resposta máxima

eNOS, sintase de óxido nítrico endotelial

ELISA, Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

ERO, espécies reativas de óxigênio

ESSIC, Sociedade Européia para o Estudo da Cistite Intersticial

GCs, guanilato ciclase solúvel

GMPc, monofosfato cíclico de guanosina

GTP, trifosfato de guanosina

HTAB, brometo de hexadecil-trimetil ammonium

ICS, Sociedade Internacional de Continência

i.p., intraperitoneal

iNOS, sintase de óxido nítrico induzível

L-NAME, N-nitro L-arginina metil éster

MPO, mieloperoxidase

NANC, não-adrenérgico/não colinérgico

nNOS, sintase de óxido nítrico neuronal

NO, óxido nítrico

NOS, sintase de óxido nítrico

ODQ, 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one

PDE-5, fosfodiesterase-5

pEC50, potência

PLC, fosfolipase C

PKA, proteína quinase dependente de AMPc

PKC, proteína quinase dependente de cálcio

PKG, proteína quinase dependente de GMPc

RNA, ácido riboxinucléico

RT-PCR, reação em cadeia da polimerase em tempo real

SDS, dodecil sulfato de sódio

 LISTA DE REAGENTES E FORNECEDORES

Anticorpo primário Anti-GCsα: Novus Biologicals, Colorado, EUA

Anticorpo primário Anti-GCsβ: Novus Biologicals, Colorado, EUA

Anticorpo primário Anti-COX2: Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA

Anticorpo primário Anti-β-actin: Sigma Aldrich, Missouri, EUA

Anticorpo secundário Anti-rabbit: Cell Signaling, Massachusetts, EUA

Anticorpo secundário Anti-goat: Cell Signaling, Massachusetts, EUA

BAY 58-2667: i.e.,[4-[((4-carboxybutyl2-[(4-phenethylbenzyl)oxy]phenetyl]amino)

methyl[benzoic]-acid] : AdipoGen, Liestal, Suiça

Bradford: Biorad, Califórnia, EUA

Brometo de hexadecil-trimetil ammonium (HTAB): Sigma Aldrich, Missouri, EUA

Carbacol: Sigma Aldrich, Missouri, EUA

Cremophor: Sigma Aldrich, Missouri, EUA

Ciclofosfamida (CYP): Sigma Aldrich, Missouri, EUA

Diidroetídio (DHE): Sigma Aldrich, Missouri, EUA

Kit para dosagem de GMP cíclico: Cayman Chemical, Michigan, EUA

Laemmli buffer: Biorad, Califórnia, EUA

Primers para -actina de camundongo: IDT DNA, Iowa, EUA

Primers para subunidade β da GCs de camundongo: IDT DNA, Iowa, EUA

SuperScript III transcriptase reversa: Invitrogen, Califórnia, EUA

Tetrametilbenzidina: Sigma Aldrich, Missouri, EUA

TRIzol: Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, EUA

 SUMÁRIO

Pág.
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 21
1.1. Fisiologia da micção................................................................................... 21
1.1.1 Anatomia do trato urinário inferior..................................................... 21
1.1.2 Ciclo miccional, inervação e mecanismos contráteis e relaxantes......... 23
1.2. Disfunções do trato urinário inferior........................................................... 26
1.2.1 Cistite Intersticial e Síndrome da Dor Vesical (CI/SDV)..................... 27
1.2.2 Cistite induzida por ciclofosfamida (CYP)........................................... 30
1.3. Sinalização NO/GCs/GMPc........................................................................ 30
1.3.1 Estimuladores e ativadores de GCs........................................................ 32
1.4 Justificativa e relevância............................................................................. 35
2. OBJETIVOS......................................................................................................... 37
2.1. Objetivo geral............................................................................................ 37
2.2. Objetivos específicos............................................................................... 37
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 38
3.1. Animais de experimentação...................................................................... 38
3.2. Desenho experimental................................................................................ 38
3.2.1 Padronização do modelo de cistite induzida por CYP.......................... 38
3.2.2 Avaliação do potencial preventivo do BAY 58-2667........................... 39
3.3. Avaliação do perfil miccional....................................................................... 39
3.3.1 Técnica de mancha de micção em papel de filtro.................................. 39
3.3.2 Análise cistométrica............................................................................. 40
3.4. Ensaio funcional in vitro............................................................................... 40
3.4.1 Isolamento e montagem dos tecidos...................................................... 41
3.4.2 Respostas contráteis ao agonista muscarínico, carbacol, e ao KCl........ 41
3.4.3 Respostas contráteis à estimulação elétrica de campo (EFS)................ 42
3.5. Avaliação de edema e análise histológica..................................................... 42
3.6. Determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO)............................... 42
3.7. Western blotting............................................................................................ 43
3.8. Determinação dos níveis de GMPc.............................................................. 43
3.9. Real time PCR............................................................................................... 44
3.10. Determinação dos níveis de espécies reativas de oxigênio.......................... 44
3.11. Análise estatística................................................................................... 45
 Pág.
4. RESULTADOS...................................................................................................... 46
4.1. Caracterização da cistite induzida por CYP........................................... 46
4.1.1 Alterações macroscópicas, razão peso vesical/corporal e atividade da
MPO....................................................................................................... 46
4.1.2 Análise histológica................................................................................. 48
4.1.3 Caracterização do perfil de micção dos animais com cistite.................. 50
4.1.3.1 Mancha de micção em papel filtro................................................ 50
4.1.3.2 Análise cistométrica...................................................................... 51
4.1.4 Avaliação funcional in vitro de animais controle e com cistite............. 53
4.1.4.1 Curva concentração-resposta ao carbacol..................................... 53
4.1.4.2 Contração induzida por KCl......................................................... 54
4.1.4.3 Curva frequência-resposta............................................................. 54
4.1.5 Avaliação das alterações na sinalização GCs/GMPc na cistite
induzida por CYP.................................................................................. 55

4.2. Potencial preventivo do BAY 58-2667 na cistite induzida por CYP....... 58

4.2.1 Efeito do pré-tratamento com BAY 58-2667 sobre as as alterações

miccionais............................................................................................. 58
4.2.2 Efeito do pré-tratamento com BAY 58-2667 na hipocontratilidade
vesical induzida por CYP....................................................................... 61
4.2.3 Expressão protéica e atividade da enzima GCs em bexigas isoladas de
animais tratados com BAY 58-2667...................................................... 62
4.2.4 Níveis de EROS no detrusor e urotélio em animais com cistite e
prevenção pelo BAY 58-2667.......................................................... 63
4.2.5 Efeito do pré-tratamento com BAY 58-2667 na atividade de MPO e
expressão de COX-2............................................................................ 64

5. DISCUSSÃO.......................................................................................................... 66
6. CONCLUSÃO...................................................................................................... 74
7. REFERÊNCIAS.................................................................................................... 75
8. ANEXO............................................................................................................... 90
 21

1. INTRODUÇÃO

1.1 Fisiologia da Micção

O armazenamento e eliminação periódica da urina, denominada micção, requer um

controle neural complexo para coordernar as atividades da bexiga urinária, uretra e

esfíncteres uretrais1. A seguir, descrevemos a anatomia do trato urinário inferior,

inervação autonômica e somática, e sinalização intracelular.

1.1.1 Anatomia do trato urinário inferior

O trato urinário inferior é constituído por bexiga urinária, uretra e esfíncteres

uretrais (Figura 1). A bexiga urinária apresenta duas regiões distintas, uma ampla região

localizada acima dos orifícios uretrais, denominada corpo da bexiga, e formada pelo

músculo liso detrusor; e uma região menor, abaixo dos orifícios uretrais, denominada

base da bexiga, e formada pelo músculo liso trígono e junção uretrovesical. A uretra,

por sua vez, estende-se do orifício uretral interno ao externo, sendo formada por três

camadas musculares, duas mais internas de músculo liso, de disposição longitudinal e

circular, e uma camada mais externa de músculo estriado, também chamada de

rabdoesfíncter2.

Histologicamente, o corpo da bexiga pode ser dividido em quatro camadas distintas:

1) a túnica adventícia, também denominada serosa, que reveste externamente a bexiga;

2) a túnica muscular, constituída pelo detrusor; 3) a lâmina própria, ou suburotélio, onde

se encontram células intersticiais e 4) o urotélio, que reveste internamente a bexiga3

(Figura 1). O músculo detrusor é formado por três camadas de fibras musculares,
 22

dispostas em orientação longitudinal nas camadas externa e interna, e circular na

camada intermediária.

O urotélio é um epitélio transicional composto por ao menos três camadas: uma

camada basal de células, aderidas à lâmina própria, uma camada intermediária e uma

superficial (ou apical) composta por células largas e hexagonais, conhecidas como

células guarda-chuva (“umbrella cells”). A superfície dessas células expressa múltiplas

proteínas, como ocludinas, claudinas e uroplaquinas, que contribuem para a formação

da barreira urotelial. Uma camada de glicosaminoglicanos recobre as células guarda-

chuva, sugerindo que a mesma contribui para barreira urotelial3. O urotélio não é

somente uma barreira impermeável à íons, solutos e patógenos, mas parte integral de

um sistema sensorial que recebe, amplifica e transmite sinais sobre o ambiente,

interagindo com fibras nervosas, músculo liso, células intersticiais e vasos sanguíneos.

O urotélio é hábil em responder à uma gama de estímulos mecânicos, químicos,

térmicos, entre outros; liberando e sendo alvo de diversos neurotransmissores4.

Figura 1. Anatomia e histologia do trato urinário inferior. Adaptado de Birder &

Anderson (2013).3
 23

1.1.2 Ciclo miccional, inervação e mecanismos contráteis e relaxantes

A dinâmica da micção depende de complexas interações entre a bexiga, uretra e

esfíncteres, assim como da inervação autonômica e somática e da liberação

neurotransmissores, os quais no conjunto determinarão a continência urinária1. Na fase

de enchimento vesical, as fibras musculares do detrusor são capazes de relaxar ao

mesmo tempo em que uretra e a base da bexiga se contraem, permitindo o aumento do

volume da bexiga, sem elevação da pressão intravesical1,5. Na fase de esvaziamento

vesical, o detrusor se contrai de modo coordenado ao relaxamento da uretra, gerando

pressão suficiente para ejetar a urina1,5. O esfíncter uretral externo acompanha a

atividade da uretra, permanecendo contraído durante o enchimento, mas relaxando

durante o esvaziamento vesical, permitindo assim o fluxo de urina1. A saída de urina

pela uretra facilita o esvaziamento, pois também estimula a contração do detrusor5

(Figura 2).

Figura 2. Desenho esquemático sobre o ciclo de micção. Adaptado de Fowler et al

(2008).1
 24

O trato urinário inferior é inervado pelos nervos pélvico, hipogástrico e pudendo. Os

nervos pélvico e hipogástrico originam-se nas regiões sacral (S2-S4) e lombar (T10-

L2), respectivamente, e o nervo pudendo tem sua origem no núcleo de Onuf, no corno

ventral do segmento sacral da medula (S2-S4)1 (Figura 3).

Figura 3. Controle neural do trato urinário inferior. Fowler et al (2008).1 Ach,

acetilcolina; NA, noradrenalina; IMP, plexo mesentérico inferior; SHP, plexo
hipogástrico superior; SN, nervo ciático; HGN, nervo hipogástrico; PEL, nervo pélvico;
PP, plexo pélvico; L1, primeiro segmento lombar; S1, primeiro segmento sacral; T9,
nono segmento torácico.

O nervo pélvico conduz fibras parassimpáticas para o detrusor, sendo sua atividade

relacionada, sobretudo, à fase de esvaziamento. A ativação dessas fibras leva à liberação

de acetilcolina (ACh), a qual interage com receptores muscarínicos, dos subtipos M2

(70-80% do total) e M3 (20-30% do total), promovendo a contração da musculatura lisa

detrusora6,7. Apesar de se apresentarem em menor densidade, estudos mostram que o

muscarínico M3 é o principal subtipo responsável por mediar as respostas contráteis do

detrusor6,7. Em relação ao muscarínico M2, no detrusor este receptor acarreta a inibição

do relaxamento mediado por nervos simpáticos, aumentando assim a contração e

 25

eficácia do esvaziamento vesical8,9. O mecanismo intracelular clássico de contração do

detrusor decorrente da ativação de receptores M3 envolve o acoplamento à proteína Gq,

a qual ativa a fosfolipase C (PLC) com consequente geração de inositol 1,4,5-trifosfato

(IP3) e diacilglicerol (DAG), resultando na liberação de cálcio do retículo

sarcoplasmático e na ativação da proteína quinase C (PKC). O cálcio liberado liga-se à

calmodulina, que ativa a miosina quinase de cadeia leve, induzindo a contração da

bexiga através da fosforilação da miosina de cadeia leve. A PKC ativada, por sua vez,

inibe a miosina fosfatase de cadeia leve, aumentando a contração do músculo liso, e

permitindo assim a abertura de canais de cálcio do tipo L da membrana celular10,11.

O nervo pélvico também conduz fibras não adrenérgicas-não colinérgicas (NANC),

e libera neurotransmissores como o adenosina trifosfato (ATP) e óxido nítrico (NO) . O

ATP leva à contração da musculatura lisa pela capacidade de interagir com duas

famílias de receptores purinérgicos: P2X, ligado canal iônico e que promove o influxo

de cálcio extracelular; e P2Y, receptor acoplado à proteína-G e que atua via PLC/IP3 e

liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático12. Entretanto, em situações fisiológicas,

a via purigérgica é menos importante para a contração do detrusor que a colinérgica13. O

NO, por sua vez, promove o relaxamento desta musculatura lisa, mediado pela

estimulação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), elevando os níveis de

monofosfato cíclico de guanosina (GMPc)14. Detalhes desta via de sinalização serão

dados no item 1.3.

O nervo hipogástrico conduz fibras simpáticas para parte do detrusor e para a base

da bexiga e uretra. A atividade deste nervo está relacionada à fase de armazenamento,

mediada pela liberação de noradrenalina. Este neurotrasmissor interage com receptores

β-adrenérgicos, predominantemente do subtipo β3, promovendo o relaxamento deste

tecido no detrusor. Interage ainda com receptores α-adrenérgicos do subtipo α1A no

 26

trígono e uretra, promovendo a contração da musculatura lisa15-17. O mecanismo

intracelular clássico de relaxamento do detrusor mediado pela ativação de receptores

β3-adrenérgicos envolve a ativação da enzima adenilato ciclase, induzindo acúmulo de

monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), que ativa a proteína quinase A (PKA). Esta,

por sua vez, promove a fosforilação da miosina quinase de cadeia leve, inativando-a,

processo este que resulta na recaptação de cálcio pelo retículo sarcoplasmático18,19.

Outros mecanismos independentes de AMPc, resultantes da ativação do receptor β3-

adrenérgico, envolvem a ativação de canais de potássio20. Com relação à sinalização do

receptor α1A no trígono e uretra, de forma similar à ativação de receptores muscarínicos,

envolve a ativação da PLC via proteína-G, e formação de IP3 e DAG, resultando na

liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático e na ativação da PKC.

Por fim, o nervo pudendo conduz fibras somáticas ao esfíncter uretral externo e

contribui para a contenção urinária através da liberação de ACh resultando na contração

dessa musculatura estriada. Este mecanismo envolve a ativação de receptores

nicotínicos, que são receptores ionotrópicos e cuja ativação resulta na despolarização e

consequente contração das células musculares1.

1.2. Disfunções do trato urinário inferior

Os sintomas do trato urinário inferior, também referidos pela sigla inglesa LUTS

(“Lower Urinary Tract Symptoms”), são condições de alta prevalência, comuns tanto

em homens quanto mulheres, em todas as faixas etárias, mas principamente entre 40 e

60 anos. Os LUTS prejudicam profundamente a qualidade de vida dos pacientes, não

deixando de mencionar os elevados custos para tratamento dessas doenças21,22.

De acordo com as definições da Sociedade Internacional de Continência (ICS), os

LUTS podem ser divididos três tipos de sintomas, a saber: sintomas de armazenamento
 27

(aumento da freqüência urinária, noctúria, urgência e incontinência urinária), de micção

(fluxo lento ou intermitente durante a micção, esforço ou hesitação) e pós-miccionais

(sensação de esvaziamento incompleto ou gotejamento pós-micção)21.

A dor, desconforto ou pressão são parte de um espectro de sensações anormais,

normalmente sentida na região suprapúbica ou retropúbica, aumentando com o

enchimento vesical, mas pode persistir mesmo após a micção21.

Dentre o amplo espectro dos LUTS, o foco deste trabalho é direcionado à Cistite

Instersticial/Síndrome da Dor Vesical (CI/SDV), uma doença inflamatória crônica da

bexiga, não infecciosa, aonde observa-se um quadro de hipersensibilidade vesical, no

qual um pequeno acúmulo de urina na bexiga proporciona sensação exagerada de dor ou

pressão, que resulta em urgência, aumento da frequência miccional e noctúria23-25.

1.2.1 Cistite intersticial e Síndrome da Dor Vesical (CI/SDV)

A CI/SDV foi originalmente descrita na literatura científica por Alexander Skene,

em 1887, como uma condição inflamatória, caracterizada por lesões da mucosa da

bexiga, atingindo também a camada muscular23. Desde então, esta doença tem sido

descrita por seus sintomas, que inclui a dor pélvica, constante necessidade de micção

(frequência), além da resistência a terapias convencionais24,25. Atualmente, a Sociedade

Européia para o Estudo da Cistite Intersticial (ESSIC), em concordância com a ICS,

define a CI/SDV como “dor pélvica crônica, com duração superior a 6 meses, pressão

ou desconforto associado à bexiga urinária, acompanhada de outro sintoma urinário,

como urgência ou excessiva frequência, na ausência de infecção urinária ou outra

patologia óbvia”21,26-28.
 28

Síndrome da dor vesical (SDV) é a nomenclatura proposta para substituir o antigo

termo “cistite intersticial” (CI), já que a dor é o sintoma primordial desta doença. Hoje,

reserva-se o termo cistite intersticial apenas para pacientes com diagnóstico confirmado

por achados típicos em exame citoscópicos e histológicos; entretanto, ambos os termos

são cambiáveis, já que não há uma definição que claramente separe a CI da SDV28,29.

O diagnóstico de CI/SDV é normalmente por exclusão de outras patologias, como,

por exemplo, bexiga hiperativa e infecção urinária. Além da dor e excessiva frequência

urinária, sintomas secundários incluem sensação de esvaziamento vesical incompleto,

hesitação, perda urinária insensível, urge-incontinência, incapacidade de interromper o

fluxo urinário e micção em dois tempos. Ulcerações na mucosa, conhecidas como lesões

de Hunner, hematúria, glomerulações (pequenas, porém múltiplas, rupturas da mucosa

com hemorragia sub-urotelial), intenso infiltrado inflamatório e mastocitose são

também observados nesta doença29.

A prevalência de CI/SDV na população geral tem sido difícil de estimar, em

particular, devido aos critérios de diagnóstico inconsistentes e pela falta de

biomarcadores específicos para a doença. Apesar das limitações de diagnóstico, estudos

epidemiológicos demonstram que a prevalência de SDV clinicamente confirmada é

aproximadamente de 300 para cada 100.000 mulheres29-31. No Brasil, ainda não existem

dados oficiais disponíveis sobre a incidência da SDV.

Apesar dos esforços direcionados ao entendimento da etiologia da CI/SDV, os

mecanismos que levam à esta condição ainda não estão bem esclarecidos, sendo a

doença considerada de origem multifatorial. Mecanismos subjacentes comumente

mencionados são dano do epitélio vesical e consequente aumento da permeabilidade

vesical, inflamação neurogênica, ativação de mastócitos e alterações na função neuronal

 29

e imune, que podem contribuir para a progressão da doença e ao desenvolvimento de

dor crônica29 (Figura 4).

Figura 4. Possíveis mecanismos envolvidos na etiologia da Cistite

Intersticial/Síndrome da Dor Vesical. Adaptado de Rodrigues et al (2011).32

Como consequência, nenhum tratamento plenamente eficaz foi desenvolvido até o

momento, ainda que um grande número de alternativas tenham sido avaliadas.

Tratamentos farmacológicos incluem medicação oral para controle da dor, como

analgésicos, antidepressivos tricíclicos, anti-histamínicos, imunossupressores e

pentosan-polissulfato de sódio. Injeções intra-detrusoras de toxina botulínica e

tratamentos intravesicais com dimetil sulfóxido (DMSO), heparina ou ácido hialurônico

são também utilizadas. A maioria dos pacientes com CI/SDV necessita de mais de uma

abordagem terapêutica, a fim de se encontrar a mais eficiente e que ofereça maior

 30

alívio33. Entre os tratamentos não-farmacológicos, incluem-se alterações na dieta,

fisioterapia e modificação de comportamento, visando principalmente a redução de

estresse e ansiedade33.

1.2.2 Cistite induzida por ciclofosfamida

A ciclofosfamida (CYP) é um agente antineoplásico, da classe dos agentes

alquilantes de DNA, utilizado no tratamento de certas formas de câncer, entretanto, um

de seus principais efeitos adversos é o de causar cistite nos pacientes. Estima-se que

entre 10 a 40% dos pacientes tratados com altas doses de CYP (> 20 mg/kg) ou por

períodos prolongados desenvolvem a cistite asséptica34,35. Diante disso, pesquisadores

têm utilizado a CYP como um agente para induzir cistite experimental, um modelo

animal plenamente estabelecido e amplamente utilizado para esta doença36-38. O exato

mecanismo pelo qual a CYP induz cistite ainda não está claro, mas usualmente é

atribuído ao contato de um de seus metabólito secundários, a acroleína, com o

urotélio39,40.

Modelos animais alternativos para a cistite incluem a cistite espontânea felina,

cistite neurogênica (pela estimulação de nervos aferentes), além do uso de agentes

químicos irritantes, como lipopolissacarídeo e o ácido acético41.

1.3. Sinalização NO/GCs/GMPc

O NO é um dos mais importantes neurotrasmissores do organismo. É formado pela

catálise do aminoácido L-arginina com o oxigênio molecular por uma família de

enzimas denominadas sintases de óxido nítrico (NOS), um processo que resulta na

formação de outro aminoácido, a L-citrulina, e no próprio NO42. Existem três isoformas

 31

de NOS, denominadas endotelial (eNOS), neuronal (nNOS), e induzível (iNOS), sendo

a eNOS e nNOS denominadas NOS constitutivas, pois são normalmente expressas nas

células. A iNOS é expressa em macrófagos, hepatócitos e músculo liso vascular, sendo

estimulada em condições inflamatórias e capaz de produzir elevadas concentrações de

NO por longos períodos de tempo42.

De modo geral, em situações fisiológicas, o mecanismo de ação do NO envolve a

ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), uma proteína heterodimérica que

consiste de duas subunidades, α e β, sendo que na porção N-terminal de ambas as

subunidades encontra-se o domínio catalítico responsável pela conversão de trifosfato

de guanosina (GTP) em GMPc43,44. Na subunidade β, ligado a um resíduo de histidina,

encontra-se um grupamento heme prostético formado por um átomo de ferro, em estado

reduzido (Fe2+), o qual é coordenado a quatro átomos de nitrogênio, sendo este essencial

para a atividade da enzima43. A ligação do NO permite uma mudança conformacional

na enzima induzindo a formação de GMPc e posterior ativação da proteína quinase

dependente de GMPc (PKG), capaz de regular diversos processos fisiológicos,

incluindo o relaxamento do músculo liso43,44. Estudos anteriores demonstraram que

fármacos atuantes nessa via de sinalização, como inibidores de PDE-5 e estimuladores

da GCs causam relaxamento do detrusor e da uretra45-47. A inativação do GMPc ocorre

pela ação da enzima fosfodiesterase-5 (PDE5)44.

A estimulação inapropriada ou a insensibilidade da GCs ao NO tem sido relacionada

a patogênese de doenças vasculares associadas a aumento de estados oxidativos, o que

pode ser melhorado por ativadores da GCs48-51. O estado oxidativo do íon ferro do

grupamento heme implica à enzima uma regulação redox-dependente, tendo em vista

que quando o íon ferro encontra-se oxidado (Fe3+) a enzima torna-se insensível ao NO43.
 32

1.3. 1 Estimuladores e Ativadores da GCs

Nas últimas duas décadas, iniciou-se o desenvolvimento de agentes farmacológicos

capazes de ativar diretamente a GCs e aumentar a síntese de GMPc, de forma

independente do NO. O protótipo do grupo foi um composto benzil indazol, chamado

YC-1,52,53 que posteriormente deu origem a vários compostos sintéticos com estrutura

similar. Atualmente, esta classe de drogas compreende dois grandes grupos, chamados

“estimuladores” e “ativadores” de GCs54,55 (Figura 5). Estes compostos, além de

oferecer um grande potencial clínico, têm permitido uma melhor compreensão da via de

sinalização NO/GCs/GMPc em condições fisiológicas e patológicas54,56.

Similarmente ao ligante endógeno NO, os estimuladores da GCs, como o BAY 41-

2272, BAY 63-2521 e o A-350619, aumentam a atividade da GCs somente quando o

íon ferro do grupamento heme encontra-se no estado reduzido (Fe2+); assim, são

classificados como NO-independentes, porém heme-dependentes. Estudos mostram um

forte sinergismo quando estas drogas são combinadas ao NO54. Por outro lado, os

ativadores da GCs, como o BAY 58-2667, BAY 60-2770 e HMR-1766, são

classificados como NO- e heme-independentes, e ativam a enzima preferencialmente

quando o íon ferro do grupamento heme encontra-se no estado oxidado (Fe3+) ou

mesmo ausente57-59.
 34

incluindo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), aprovam o BAY 62-

2521 (riociguat) para o tratamento de pacientes com hipertensão pulmonar.62

Nosso grupo foi o primeiro a caracterizar os efeitos dos estimuladores e ativadores

de GCs no trato urinário inferior.63-65 Em condições fisiológicas, mostrou-se que o BAY

41-2272 produz relaxamento dependente da concentração em uretra de coelho66,

bexigas de rato, camundongo e coelho47, ureter humano67, e corpo cavernoso de coelho

e humano.68-69 O relaxamento induzido por este composto é significativamente reduzido

quando há oxidação da GCs pela presença de ODQ. Recentemente, mostramos que

tanto o estimulador (BAY 41-2272) quanto o ativador de GCs (BAY 60-2770) reduzem

a contração in vitro de próstata de coelho e humano65. Em corpo cavernoso de humano,

coelho e camundongo in vitro, demonstrou-se que tanto o estimulador da GCs, BAY 41-

2272, quanto o ativador, BAY 60-2770, induzem relaxamento dependente da

concentração e de maneira sinérgica ao NO endógeno68,70, sendo, portanto, capazes de

aumentar a amplitude e duração da resposta erétil.69,71,72

A oxidação da GCs e prejuízo na sinalização NO/GCs/GMPc são características

comuns a condições patológicas como hipertensão, a obesidade e o diabetes50. Dessa

forma, o desenvolvimento de drogas direcionadas à esta via representa uma abordagem

interessante para o tratamento de doenças relacionadas ao estresse oxidativo50. Como

todos os componentes da sinalização do NO são encontrados em bexiga, uretra, próstata

e corpo cavernoso73, têm se investigado o potencial dos estimuladores e ativadores de

GCs para o tratamento de complicações do trato geniturinário. Por exemplo, no modelo

murino de obesidade, que classicamente é associado a estresse oxidativo elevado74,

estudos prévios de nosso grupo de pesquisa mostraram que os ativadores de GCs são

capazes de normalizar a função vesical63,64. Demonstrou-se que o tratamento com BAY

60-2770 restaurou as alterações cistométricas em animais anestesiados (aumento da

 35

frequência de micções e de CNMs), normalizou a hipercontratilidade da bexiga e a

redução do relaxamento uretral63,64. Em termos moleculares, a expressão das subunidade

α1e β1 da GCs, bem como a produção de GMPc apresentavam-se diminuídas na bexiga

e na uretra do animal obeso, alterações totalmente restauradas pelo tratamento com

BAY 60-2770, confirmando a eficácia dos ativadores de GCs em restaurar a sinalização

da via GCs/GMPc63,64. Outro estudo mostrou que o tratamento com BAY 41-2272 é

eficaz em reduzir a hiperatividade do detrusor em modelo animal de hipertensão

arterial75. Em modelo de obstrução da bexiga em ratos, o BAY 41-2272 e o BAY 60-

2770 aumentaram o intervalos entre micções e reduziram a pressão máxima de

micção.76

1.4. Justificativa e relevância

A despeito dos esforços para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos

envolvidos na CI/SDV, estes permanecem pouco compreendidos, implicando em

dificuldades para o diagnóstico e tratamento da doença. Nas últimas décadas, o NO

destacou-se como um importante neurotransmissor no âmbito das disfunções do trato

urinário inferior, seja por sua ação direta como neurotransmissor, seja pela ação

inibitória na neurotransmissão eferente77. Sendo a enzima GCs o principal alvo

biológico do NO, a compreensão da via GCs/GMPc em condições patológicas parece-

nos fundamental. Até o momento, nenhum estudo descreveu alterações nesta via de

sinalização na cistite induzida por CYP. Além disso, ativadores da GCs, como o BAY

58-2667, supostamente restauram a sinalização desta enzima, preferencialmente em

condições oxidativas50,78. Por isso, estes agentes têm se mostrado promissores na

terapêutica de diferentes disfunções, e podem ser uma nova alternativa para o

tratamento da CI/SDV. Acreditamos que o modelo proposto de cistite induzida por CYP
 36

em camundongos submetidos ao tratamento prévio com o ativador da GCs (BAY 58-

2667) nos possibilitará avançar na compreensão da fisiopatologia da CI/SDV bem como

contribuir para a melhora da terapêutica e prevenção da doença.

 37

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Este estudo teve como objetivo geral investigar o papel da via de sinalização

GCs/GMPc na disfunção miccional induzida por CYP em camundongos, assim como os

efeitos protetores do BAY 58-2667 na prevenção da cistite.

2.2 Objetivos específicos

1. Padronização da disfunção miccional induzida pela CYP;

2. Avaliação da expressão das subunidades α1 e β1 da enzima GCs e os níveis de

GMPc no tecido vesical;

3. Avaliação dos efeitos do BAY 58-2667 na prevenção da disfunção miccional

induzida por CYP, bem como das alterações funcionais in vitro do músculo

detrusor;

4. Avaliação dos efeitos do pré-tratamento com BAY 58-2667 sobre marcadores

inflamatórios, como atividade da mieloperoxidase (MPO) e expressão protéica

da ciclooxigenase-2 (COX-2), e estresse oxidativo local, por determinação dos

níveis de ERO.
 38

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais de experimentação

Todos os procedimentos e protocolos experimentais estão de acordo com os

princípios éticos de experimentação animal adotados pelo Conselho Nacional de

Experimentação Animal (CONCEA) e previamente aprovados pelo Comitê de Ética em

Pesquisa com Animais da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), sob

protocolo número 3508-1. Foram utilizados camundongos fêmeas, isogênicas, da

linhagem C57BL/6/JUnib, fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação

Biológica (CEMIB/UNICAMP), com idade entre 8 a 10 semanas e peso médio 20 a 25

gramas. Os animais foram acondicionados no Biotério do Departamento de

Farmacologia, em gaiolas apropriadas, com maravalha, máximo cinco animais por

gaiola, ração padrão Nuvilab e água filtrada ad libitum, em ambiente com temperatura

controlada (24 ºC) e iluminação diária de 12 horas.

3.2 Desenho experimental

3.2.1 Padronização do modelo de cistite induzida por CYP

A cistite foi induzida por injeção intraperitoneal de CYP dissolvida em solução

salina, e as doses determinadas em concordância com estudos anteriores36-38,79. Os

seguintes grupos experimentais foram constituídos:

1) Controle: animais que receberam injeção i.p. de salina (10 mL/kg);

2) Cistite aguda: animais que receberam injeção i.p. de CYP (300 mg/kg) e

avaliados após 4 horas de indução;

3) Cistite intermediária: animais que receberam injeção i.p. de CYP (300 mg/kg) e

avaliados após 24 horas de indução;

 39

4) Cistite crônica: animais que receberam injeções i.p. de CYP (75 mg/kg), durante

10 dias, em intervalos de 72 horas, e avaliados após 24 horas da última injeção.

3.2.2 Avaliação do potencial preventivo do BAY 58-2667

Após a padronização do modelo e após avaliação dos resultados obtidos, o grupo

cistite intermediária (24 h) foi designado como modelo para avaliação do BAY 58-2667

na prevenção da cistite induzida por CYP. Os animais foram pré-tratados por gavagem

com BAY 58-2667, na dose 1 mg/kg,63 ou com seu respectivo veículo

(transcutol/cremophor/água, 1:2:7, vol/vol, 5 ml/kg). Após 1 hora os animais foram

injetados via i.p. com CYP (300 mg/kg) ou salina. Desta forma, os animais foram

distribuídos entre os quatro grupos abaixo:

1) pré-tratamento com veículo + injeção de salina;

2) pré-tratamento com BAY 58-2667 + injeção de salina;

3) pré-tratamento com veículo + injeção de CYP;

4) pré-tratamento com BAY 58-2667 + injeção de CYP.

3.3 Avaliação do perfil miccional

3.3.1 Técnica de mancha de micção em papel de filtro

Os animais foram acondicionados individualmente em gaiolas forradas com papel

filtro (26 x 16 cm; 80 g/m2) durante 3 horas, com água ad libitum, para a coleta da

urina79. Após este período, os papéis foram secos naturalmente por 24 horas. As

imagens foram obtidas em fotodocumentador (Chemi-Doc, Bio Rad, Califórnia, EUA)

através da exposição do papel à luz ultravioleta. O número de micções foi avaliado e a

área de micção foi quantificada utilizando-se o programa ImageJ (ImageJ Software,

 40

NIH, Maryland, EUA). Para determinação do volume de micção, realizou-se curva de

calibração com volumes conhecidos de urina aplicados no papel filtro e relativizados

com a área obtida.

3.3.2 Análise cistométrica

Os animais foram anestesiados com uretana (1,8 g/kg, i.p.). A bexiga urinária foi

exposta e cateterizada utilizando um scalp nº 25. Este scalp era acoplado à uma torneira

de 3 vias, que permitia simultaneamente a conexão a uma bomba de infusão de salina,

uma seringa para esvaziamento da bexiga, e um transdutor de pressão acoplado à um

sistema PowerLab 4/30 de aquisição de dados (ADInstruments, Sidney, AU). Após

canulação, a bexiga foi esvaziada, estabilizada por cinco minutos, iniciando-se a infusão

de salina a temperatura ambiente, velocidade constante de 0,6 mL/h, por 45 minutos63.

Os parâmetros cistométricos avaliados foram: pressão basal, pressão limiar (pressão

intravesical imediatamente antes da primeira micção), capacidade (volume intravesical

até a primeira micção), complacência (razão entre a capacidade e a pressão durante o

enchimento vesical), pressão de micção (pressão máxima atingida durante a micção),

pressão pós-miccional (pressão imediatamente após os fim do esvaziamento vesical),

frequência de micções, intervalo de micções (média dos intervalos de tempo entre as

micções durante 45 minutos) e frequência de contrações não miccionais (contrações

involuntárias da bexiga, de amplitude maior que 4 mmHg, e que não resultaram em

micção)63.

3.4 Ensaio funcional in vitro

Os protocolos funcionais in vitro foram realizados em concordância com estudo

anterior do grupo63.
 41

3.4.1 Isolamento e montagem dos tecidos

As bexigas foram removidas imediatamente após a eutanásia dos animais. Duas tiras

longitudinais de músculo detrusor com o urotélio íntegro foram obtidas de cada bexiga.

Os tecidos foram montados em banho para órgãos isolados (cuba 10 mL), preenchido de

solução de Krebs-Henseilet (117 mM NaCl; 4,7 mM KCl; 2,5 mM CaCl2; 1,2 mM

MgSO4; 1,2 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 e 11 mM Glicose, pH 7,4), gaseificadas

continuamente com mistura carbogênica (5% CO2 e 95% de O2) e com temperatura

controlada à 37 ºC. Cada tira de tecido foi acoplada a um transdutor de força, sob tensão

inicial de 5 mN, e a um sistema PowerLab 4/30 de aquisição de dados. Foram realizados

os protocolos experimentais descritos abaixo.

3.4.2 Respostas contráteis ao agonista muscarínico carbacol e ao KCl

Após o período de estabilização de 1 hora, realizamos curvas concentração-resposta

ao agonista muscarínico pleno carbacol (0,001 – 30 µM). Após lavagem do tecido,

realizamos a contração induzida por KCl (80 mM).

As respostas contráteis foram determinadas em mN e expressas pela razão mN/peso

da respectiva tira de tecido (mg). Os valores de potência (pEC50) e respostas máximas

(Emáx) foram calculados pela seguinte equação: E = Emax/[(1+(10c/10x)N + Ф], onde

E é elevação do tônus basal, Emax é a máxima resposta que o agonista pode produzir,

“c” é o logarítimo da EC50, que é a contração do agonista que produz 50% da resposta

máxima; “x” é o logaritmo da concentração do agonista, o expoente, “N”, significa a

inclinação da curva concentração-resposta e Ф é a resposta observada na ausência do

agonista. As análises de regressões não lineares para determinar os parâmetros Emax,

logEC50 e o “n” foram feitas utilizando-se o software GraphPad Prism (GraphPad

Software Inc., Califórnia, EUA), considerando o parâmetro Ф como zero.

 42

3.4.3 Respostas contráteis à estimulação elétrica de campo (EFS)

Para a EFS, os tecidos foram montados entre dois eletrodos de platina dispostos de

forma paralela e conectados à um estimulador S88 (Grass Telefactor; Rodhe Island,

EUA). Os tecidos foram estimulados eletricamente a uma voltagem de 80V, com

duração dos pulsos de 1 milisegundo (ms), intervalo entre os pulsos de 0,2 ms, duração

de estimulação de 10 segundos, nas frequências de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 Hz, com intervalo

de 2 minutos entre os estímulos.

3.5 Avaliação de edema e análise histológica

Ao fim do período de indução da cistite, os animais foram pesados, eutanasiados em

câmara de gás carbônico, seguido de deslocamento cervical. As bexigas urinárias foram

então removidas e pesadas. Para a avaliação de edema, determinou-se a razão entre

peso úmido da bexiga e peso total do animal. Para a análise histológica, os tecidos

foram fixados em solução de paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina, cortados

em secções de 5 µm e corados com hematoxilina e eosina. As imagens foram obtidas

em microscópio óptico equipado com câmera digital (Leica DM2000, Leica

Microsystems, Wetzlar, DE), sob objetivas de 10 à 100x.

3.6 Determinação da atividade da MPO

Como descrito anteriormente80, para avaliação da atividade de MPO as bexigas

foram removidas, congeladas em nitrogênio líquido, pulverizadas e homogeneizadas em

tampão de brometo de hexadecil-trimetil ammonium (HTAB). Após centrifugação por 2

minutos a 8000 g, o sobrenadante foi utilizado para determinação da atividade de MPO

através da reação com 1,6 mM de tetrametilbenzidina, 80 mM NaPO4 e 0,3 mM de

peróxido de hidrogênio. A concentração protéica de cada amostra foi determinada por

 43

ensaio de Bradford81. A absorbância da reação foi determinada a 460 nm e os resultados

expressos como densidade óptica (D.O.) por mg de proteína.

3.7 Western blotting

Avaliamos a expressão da enzima GCs em períodos de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas após

a exposição à CYP ou veículo. Após cada intervalo de tempo, os animais foram

eutanaziadas e as bexigas foram removidas. Seguindo protocolo descrito

anteriormente64, os tecidos foram congelados em nitrogênio líquido e imediatamente

pulverizadas e homogeneizadas em tampão de extração de SDS por 30 minutos à 4 ºC.

Após centrifugação para obtenção do sobrenadante, foi realizada a dosagem de proteína

pelo método de Bradford, e as amostras foram tratadas com tampão Laemmli contendo

10% de β–mercaptoetanol. As proteínas foram separadas em gel de 10% de

poliacrilamida e eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose. Após bloqueio de

marcações inespecíficas, a detecção foi realizada pela incubação de anticorpos

específicos para Anti-GCsα1, anti-GCsβ1, COX-2 e anti-β-actina, anticorpos

secundários HRP-conjugados e solução de luminol. As imagens foram obtidas em

fotodocumentador (Chemi-Doc, Bio Rad, Califórnia, EUA) e a intensidade das bandas,

como uma medida da expressão da proteína, foi determinada por análise densitométrica

mediante uso do software Image Lab (Biorad, Califórnia, EUA).

3.8 Determinação dos níveis de GMPc

Avaliamos alterações na atividade da enzima GCs induzidas pela CYP também

através de um time course ao longo de 24 horas de exposição. Neste caso, os animais

foram tratados com CYP (300 mg/kg) e eutanasiados após 1, 2, 4, 6, 12 ou 24 horas. As

bexigas foram removidas, congeladas em nitrogênio líquido e imediatamente

pulverizadas e então processadas para determinação dos níveis de GMPc, de acordo

 44

com as instruções do fabricante do kit (Cayman Chemicals, Michigan, EUA) e

experiência prévia do grupo63,64. Os experimentos foram realizados em duplicata e

normalizados pelo peso úmido da respectiva bexiga. Os resultados foram expressos

como picomol/mg de tecido.

3.9 Real time PCR

Após 24 horas da indução de cistite por CYP, os animais foram eutanaziados e as

bexigas removidas. De acordo com protocolo descrito anteriormente82, o RNA total foi

extraído de bexigas inteiras em TRIzol de acordo com as instruções do fabricante

(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA). Para a transcrição do RNA à cDNA,

utilizou-se kit com a enzima transcriptase reversa SuperScript III (Thermo Fisher

Scientific), e a quantificação e pureza do cDNA obtida em espectrofotômetro NanoDrop

(Thermo Fisher Scientific). Foram utilizados iniciadores (primers) construídos

especificamente para os genes da subunidade β1 da GCs e -actina, o controle

endógeno. As respectivas sequências foram: GCs β-F 5’-

CATACAGGTGTCTCATGTCTCCA-3’; GCs β-R 5’-

GAACCCAACCGACGTTCTCT-3’; -actina-F 5’-ACTGCCGCATCCTCTTCCT-3’;

-actina-R 5’-GAACCGCTCGTTGCCAATA-3’, e a concentração utilizada foi 150

nM. A detecção de amplificação em tempo real utilizou o equipamento StepOnePlus

PCR System (Applied Biosystems, Califórnia, EUA).

3.10 Determinação dos níveis de espécies reativas de oxigênio

O corante fluorescente diidroetidio (DHE) foi utilizado para avaliação da geração de

ERO in situ. As bexigas foram removidas e embebidas em meio de congelamento

(Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek, Califórnia, EUA). Secções transversas

 45

de 12 µm foram obtidas em criostato, coletadas em lâminas, equilibradas por 10

minutos em solução de Hank’s (17,1 mM NaCl; 0,7 mM KCl; 0,05 mM KH2PO4; 0,04

mM NaH2PO4; 0,7 mM Glicose; pH 7,4). Em seguida, solução de DHE (2 µM) foi

aplicada a cada amostra e as lâminas foram incubadas à 37 ºC por 30 minutos em

câmara úmida. As imagens foram obtidas em microscópio equipado para

imunofluorescência e com câmera digital (Eclipse80i/DS-U3, Nikon Instruments Inc.,

Tóquio, JPN), sob magnificação de 200 x. A fluorescência foi detectada a 585 nm e o

número de núcleos marcados com DHE no músculo detrusor e no urotélio foram

detectados usando o software ImageJ, como descrito anteriormente64. Os resultados

foram expressos como núcleos marcados/mm2.

3.11 Análise estatística

Os resultados foram apresentados com médias ± erro padrão das médias (EPM) de

um número experimental (n). Para comparações múltiplas foi utilizado o teste de análise

de variância (ANOVA) de duas vias, seguido pelo pós-teste de Bonferroni. O teste t de

Student foi utilizado para análises de um mesmo parâmetro entre dois grupos

experimentais. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos. O software

GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., California, EUA) foi utilizado para as

análises.
 46

4. RESULTADOS

4.1 Caracterização da cistite induzida por CYP

4.1.1 Alterações macroscópicas, razão peso vesical/corporal e atividade da MPO.

A injeção intraperitoneal de CYP induziu alterações macroscópicas na bexiga

urinária em 4 h, 24 h e 10 dias, sendo visível o aumento de tamanho do órgão, além de

sinais de hemorragia (Figura 6B). Quando analisamos a razão entre peso da bexiga e

peso corporal (mg/g), notamos um aumento significativo dos três grupos cistite em

relação ao grupo controle (P < 0,05; Figura 6C). No grupo cistite intermediário (24 h),

esta proporção foi maior em relação ao controle a todos os grupos, notando-se um

aumento de mais de três vezes em relação ao grupo controle. No grupo cistite crônico

(10 dias) observamos um aumento visível no tamanho das bexigas em relação ao grupo

intermediário, entretanto, tais bexigas não apresentavam maior peso e o aumento do

tamanho sugere remodelamento tecidual. Destacamos que a injeção de CYP não induziu

alterações significativas no peso corporal dos animais expostos em relação aos controles

(Figura 6A).

Com relação a MPO, sua atividade intracelular correlaciona-se ao conteúdo de

neutrófilos no tecido sendo, portanto, utilizada como marcador para infiltração

neutrofílica na cistite83. A atividade desta enzima se mostrou marcantemente elevada

nos grupos cistite (P < 0,05), especialmente no grupo cistite intermediário (24 h) (Figura

6D).
 47

A) B)

CTRL 4h 24h 10 dias

C) D)

Figura 6. Peso corporal, alterações macroscópicas, razão peso da bexiga/peso

corporal e atividade de mieloperoxidase (MPO). (A) Peso corporal dos animais
controles e injetados com ciclofosfamida (CYP; 300 mg/kg para 4 h e 24 h; e 75 mg/kg
para 10 dias) ou salina. (B) Imagem representativa das bexigas isoladas (C) Proporção
entre o peso da bexiga e corpo dos animais e (D) atividade da MPO em bexigas isoladas
de animais controles e com cistite. ANOVA de duas vias, pós-teste de Bonferroni, n =
5-8 animais/grupo, *P < 0,05 vs controle (CTRL); P< 0,05 vs 4 horas; #P < 0,05 vs 10
dias. CTRL, controle; O.D., densidade óptica.
 50

4.1.3 Caracterização do perfil de micção de animais com cistite

4.1.3.1.Mancha de micção em papel filtro

Através da técnica de mancha de micção em papel filtro avaliamos in vivo, sem a

necessidade de anestesia ou contenção do animal, a função miccional de animais

controles e com cistite. Observamos que o número de micções nos grupos cistite foi

significativamente maior comparado ao grupo controle (P < 0,05; Figura 9A,B).

Enquanto os animais controles produziam em média de 3-4 manchas de micção no

período de três horas, os animais do grupo cistite intermediária produziam mais de 100

manchas de micção no mesmo período, sendo esta diferença significativa em relação

aos demais grupos (P < 0,05). Nos grupos cistite de 4 horas e 10 dias observamos uma

média de 70 e 20 micções, respectivamente, sendo também significativos em relação ao

controle (P < 0,05). Também verificamos uma redução significativa no volume de

micção nos grupos cistite em relação ao controle (P < 0,05). Não notamos diferenças

significativas entre os grupos 4 h, 24 h e 10 dias para este parâmetro (Figura 9C).

 52

cistite, observamos que a frequência de CNMs entre os grupos cistite 4 horas e 10 dias

foi menor em relação ao grupo 24 horas (Tabela 1).

Controle CYP 4h
10mmHg

5min CYP 24 h CYP 10 dias

Figura 10. Traçados cistométricos representativos de um animal por grupo. Setas

indicam micções. CYP, ciclofosfamida.

Tabela 1. Alterações nos parâmetros cistométricos dos animais controles e com

cistite
CYP
CTRL 4h 24 h 10 dias
Capacidade (mL) 0,09 ± 0,01 0,05 ± 0,01* 0,02 ± 0,012* 0,06 ± 0,01*

Complacência (mL/mmHg) 0,02 ± 0,03 0,01 ± 0,003* 0,01 ± 0,01* 0,01 ± 0,01*

Pressão de micção (mmHg) 27,60 ± 1,7 22,33 ± 2,0 20,03 ± 2,5* 21,23 ± 2,2

Frequência de micção (nº/min) 0,27 ± 0,05 0,77 ± 0,12* 0,64 ± 0,07* 0,49 ± 0,08*

Frequência de CNMs (nº/min) 0,23 ± 0,07 1,02 ± 0,17* 2,39 ± 0,32*# 0,82 ± 0,27*

Valores expressos como médias ± E.P.M, n = 5-8 animais por grupo. *P < 0,05 vs CTRL; #P < 0,05 vs 4 h;

P < 0,05 vs 10 dias. CTRL, controle; CYP, ciclofosfamida.
 53

4.1.4 Avaliação funcional in vitro do detrusor isolado de animais controle e com

cistite

4.1.4.1 Curva concentração-resposta ao carbacol

O carbacol causou resposta contrátil dependente da concentração em todos os

grupos (Figura 11A). Entretanto, a resposta máxima ao carbacol foi significativamente

menor nos grupos cistite de 4 e 24 horas comparada ao controle (P < 0,05; Figura 11B).

Não observamos diferenças significativas na potência (pEC50) ao carbacol em nenhum

dos grupos avaliados (5,97 ± 0,09 para grupo controle; 6,28 ± 0,03; 5,80 ± 0,11 e 6,06

± 0,09 para os grupos cistite de 4 h, 24 h e 10 dias, respectivamente).

A) B)

Figura 11. Resposta contrátil ao carbacol em detrusor isolado de animais controles

e com cistite. (A) Curva concentração-resposta e (B) resposta máxima ao agonista
muscarínico carbacol. Valores expressos como média ± E.P.M. ANOVA de duas vias,
pós-teste de Bonferroni, n = 5-8 animais/grupo, *P < 0,05 vs CTRL. CTRL, controle;
CYP, ciclofosfamida.
 54

4.1.4.2 Contração induzida por KCl

Avaliamos também a resposta contrátil independente da ativação de receptores. A

adição do agente despolarizante, KCl (80 mM), produziu resposta contrátil em todos os

grupos (Figura 12), porém apenas no grupo cistite de 4 horas houve um aumento

significativo desta resposta em relação ao controle (P < 0,05).

Figura 12. Resposta contrátil ao cloreto de potássio (KCl, 80 mM) em detrusor

isolado de animais controles e com cistite. Valores expressos como média ± E.P.M.
ANOVA de duas vias, pós-teste de Bonferroni, n = 5-8 animais/grupo, *P < 0,05 vs
CTRL. CTRL, controle; CYP, ciclofosfamida.

4.1.4.3 Curva frequência-resposta

A estimulação elétrica dos tecidos (1 a 32 Hz) produziu resposta contrátil

dependente da frequência em todos os grupos, sendo a resposta máxima obtida em 32

Hz (Figura 13). Novamente, apenas no grupo cistite de 4 horas houve alteração

significativa em relação ao controle (P < 0,05), com redução da resposta em todas as

frequências analisadas. Os demais grupos (24 h e 10 dias) não apresentaram diferença

em relação ao controle em nenhuma frequência analisada.

 55

Figura 13. Resposta contrátil a estimulação elétrica em detrusor isolado de animais

controles e com cistite. Valores expressos como média ± E.P.M. ANOVA de duas vias,
pós-teste de Bonferroni, n = 5-8 animais/grupo, *P < 0,05 vs controle (CTRL). CYP,
ciclofosfamida.

4.1.5 Avaliação das alterações na sinalização GCs/GMPc na cistite induzida por

CYP

Quantificamos a expressão protéica das subunidades α1 e β1 e a atividade da enzima

GCs nos períodos de 1 a 24 horas após a exposição à CYP (300 mg/kg). A exposição à

CYP produziu redução de aproximadamente 50% na expressão protéica de ambas as

subunidades, em relação ao grupo controle, sendo esta redução detectada entre 2 e 24

horas (Figura 14A). Em 24 horas de exposição à CYP também observamos redução

significativa na expressão do RNAm da subunidade β1 da GCs (P < 0,05; Figura 14B).

 56

A) B)

Figura 14. Alterações induzidas pela injeção de ciclofosfamida (CYP, 300 mg/kg)
sobre expressão protéica e gênica das subunidades da enzima guanilato ciclase
solúvel (GCs). (A) Imagens representativas de western blot para as subunidades α1 e β1
da GCs e respectivos níveis protéicos em bexiga isolada de animais controle e injetados
com CYP (300 mg/kg) ao longo de 24 horas. (B) Expressão gênica da subunidade β da
GCs, avaliada por RT-PCR, após 24 horas de exposição à CYP. Valores expressos
como média ± E.P.M. ANOVA de duas vias, pós-teste de Bonferroni e teste t de
Student não pareado para comparações entre controle (CTRL) x CYP 24 h, n = 6-10
animais/grupo, *P < 0,05 vs CTRL.

Os níveis de GMPc também se mostraram marcantemente reduzidos no grupo CYP

em relação ao controle (P < 0,05; Figura 15). Em concordância ao experimento anterior,

observamos que a redução dos níveis de GMPc acompanha a redução na expressão de

subunidades α1 e β1 da GCs, sendo significativamente menor logo após 2 horas de

indução, mantendo-se por menor 24 horas.

 57

Figura 15. Produção de GMPc em bexigas de animais com cistite induzida pela
injeção de ciclofosfamida (CYP, 300 mg/kg) ao longo de 24 horas. Valores expressos
como média ± E.P.M. ANOVA de duas vias, pós-teste de Bonferroni, n = 5-8
animais/grupo, *P < 0,05 vs controle (CTRL).
 58

4.2 Potencial preventivo do BAY 58-2667 na cistite induzida por CYP

4.2.1 Efeito do pré-tratamento com BAY 58-2667 sobre as as alterações miccionais

Conforme demonstrado anteriormente (Figura 9), verificamos que o perfil de

micção dos animais com cistite em 24 horas foi claramente irregular em relação ao

controle. Na análise de manchas de micção no papel filtro observamos marcante

aumento no número de micções, em quase 30 vezes, além de redução dos volumes de

micção no período avaliado (Figura 16 A e B). Entretanto, estas alterações foram

prevenidas pelo tratamento dos animais com o BAY 58-2667 (1 mg/kg), que reduziu o

número de micções e ampliou significativamente o volume (P < 0,05; Figura 16 A e B).

Nos animais controles, o tratamento com BAY 58-2667 não modificou de modo

significativo este padrão de micção.

 59

A)
veículo + veículo BAY58-2667 + salina veículo + CYP BAY58-2667 + CYP

B) C)

Figura 16. Registro do perfil de micção de animais controle e com cistite, pré-
tratados ou não com BAY 58-2667 (1 mg/kg). (A) Papel filtro representativo do perfil
de micção de um único animal de cada grupo. (B) Número de micções e (C) volume de
micção obtidos durante 3 horas de marcação no papel filtro. ANOVA de duas vias, pós-
teste de Bonferroni, n = 5 animais/grupo, *P < 0,05 vs controle (CTRL), #P < 0,05 vs
Veículo + CYP.. CTRL, controle (veículos); CYP, ciclofosfamida.

Na análise cistométrica observamos o mesmo perfil irregular nos animais com

cistite. Observamos redução na capacidade vesical, complacência e no intervalo entre

micções, enquanto houve elevação na pressão basal e nas frequências de micção e de

CNMs (Figura 17). O tratamento com BAY 58-2667 preveniu de modo significativo as

alterações em todos esses parâmetros (Figura 17). Nos animais controle tratados com

BAY 58-2667 observou-se redução significativa na pressão basal; contudo, os demais

parâmetros não foram alterados. Os parâmetros pressão limiar e pressão de micção não

foram alterados em nenhum grupo avaliado.

 60

10mmHg A) veículo + veículo veículo + CYP

5min
BAY 58-2667 + salina BAY 58-2667 + CYP

B) C) D)
8 Veículo 10 0.20
Pressão limiar (mmHg)

BAY 58-2667
Pressão basal (mmHg)

*
8

Capacidade (mL)
6 0.15
6
4 # 0.10
#
4
2 * 0.05
2
*
0 0 0.00

CTRL CYP CTRL CYP CTRL CYP

E) F) G)
40 0.03 400
Intervalo entre micções (s)
Pressão de micção

30 300
Complacência
(mmHg/mL)

0.02
(mmHg)

# #
20 200

0.01
10 100 *
*
0 0.00 0

CTRL CYP CTRL CYP CTRL CYP

H) I)
1.5 5
Frequência de micção

Frequência de CNMs

4 *
*
1.0
(nº / min)
(nº / min)

3
#
2
0.5
#
1

0.0 0

CTRL CYP CTRL CYP

Figura 17. Análise cistométrica de animais controle e com cistite, tratados ou não
com BAY 58-2667 (1 mg/kg). Traçados cistométricos representativos de um animal por
grupo (A) e parâmetros cistométricos pressão basal (B), pressão limiar (C), capacidade
(D), pressão de micção (E), complacência (F), intervalo entre micções (G), frequência
de micções (H) e frequência de CNMs (I). ANOVA de duas vias, pós-teste de
Bonferroni, n = 5-8 animais/grupo, *P < 0,05 vs Veículo + Salina; #P < 0,05 vs Veículo
+ CYP. Setas indicam micções. CNMs, contrações não-miccionais; CTRL, controle
(veículos); CYP, ciclofosfamida.
 61

4.2.2 Efeito do pré-tratamento com BAY 58-2667 na hipocontratilidade vesical

induzida por CYP

O carbacol causou resposta contrátil dependente da concentração em todos os

grupos (Figura 18A), e, novamente, notamos redução significativa da resposta máxima

no grupo cistite em relação ao controle (Figura 18B). Contudo, essa alteração foi

significativamente prevenida pelo BAY 58-2667 (P < 0,05; Figura 18A e B). Não

observamos diferenças significativas na pEC50 ao carbacol em nenhum dos grupos

avaliados (Figura 18 C). A adição de KCl produziu resposta contrátil similar em todos

os grupos (Figura 18 D). Em ambos, carbacol e KCl, o tratamento dos animais controles

com BAY 58-2667 não produziu alterações significativas.

A) B)

C) D)

Figura 18. Estudo funcional in vitro em detrusor isolado de animais controle e com cistite,
tratados ou não com BAY 58-2667 (1 mg/kg). (A) Curva concentração-resposta, (B)
resposta máxima e (C) potência ao carbacol. (D) Resposta contrátil a adição de 80 mM
de KCl. Valores expressos como média ± E.P.M. ANOVA de duas vias, pós-teste de
Bonferroni, n = 5-8 animais/grupo, *P < 0,05 vs Veículo + Salina; #P < 0,05 vs Veículo
+ CYP. CTRL, controle (veículos); CYP, ciclofosfamida.
 62

4.2.3 Expressão protéica e atividade da enzima GCs em bexigas isoladas de animais

tratados com BAY 58-2667

Como mencionado anteriormente (Figura 14), a exposição à CYP promove

degradação das subunidades α1 e β1. O tratamento do animais com BAY 58-2667

preservou a expressão de ambas as subunidades nos animais com cistite (Figura 19 A e

B). O tratamento com BAY 58-2667 não alterou a expressão das subunidades nos

animais controles.

A) B)

Figura 19. Efeito do tratamento com BAY 58-2667 na expressão das subunidades
α1 (A) e β1 (B) da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs) em bexigas de animais
submetidos a cistite por ciclofosfamida (CYP). Imagens representativas de western
blot para as subunidades α1 (A) e β1 (B) da GCs e respectivos níveis protéicos em
bexiga isolada de animais controle e com cistite, pré-tratados ou não com BAY 58-
2667. Valores expressos como média ± E.P.M. ANOVA de duas vias, pós-teste de
Bonferroni, n = 7-10 animais/grupo, *P < 0,05 vs Veículo+Salina; #P < 0,05 vs
Veículo+CYP. CTRL, controle (veículos).
 63

Da mesma forma, o tratamento com BAY 58-2667 também foi capaz de prevenir

significativamente a redução dos níveis de GMPc nas bexigas dos animais com cistite

(P < 0,05; Figura 20), mantendo os níveis deste nucleotídeo cíclico similar ao grupo

controle. O tratamento com BAY 58-2667 não alterou os níveis de GMPc nos animais

controles.

Figura 20. Efeito do tratamento com BAY 58-2667 nos níveis de GMPc.
Determinação dos níveis de GMPc em bexigas de animais controle e com cistite,
tratados ou não com BAY 58-2667. Valores expressos como média ± E.P.M. ANOVA
de duas vias, pós-teste de Bonferroni, n = 7-10 animais/grupo, *P < 0,05 vs Veículo +
Salina; #P < 0,05 vs Veículo + CYP. CTRL, controle (veículos).

4.2.4 Níveis de ERO no detrusor e urotélio em animais com cistite e prevenção pelo

BAY 58-2667

A geração de ERO foi avaliada pelo método do DHE, utilizando-se microscópio de

fluorescência. Observamos que a intensidade da fluorescência nas bexigas dos animais

com cistite foi marcantemente maior em comparação ao controle, sendo de

aproximadamente 54% no detrusor (P < 0,05; Figura 21 A e B) e 40% no urotélio (P <

0,05; Figura 21 C e D). O pré-tratamento com BAY 58-2667 foi capaz de normalizar a

produção de ERO induzida pela CYP, mantendo os níveis similares ao dos animais

controles (Figura 21). Não observamos alterações significativas nos animais controles

tratados com BAY 58-2667.

 65

22C). Contudo, o tratamento dos animais com BAY 58-2667 não foi capaz de prevenir

nenhuma destas alterações (Figura 22 A, B e C). O tratamento com BAY 58-2667 não

provocou alterações significativas destes parâmetros nos animais controles.

A) B)

C)

Figura 22. Efeitos do pré-tratamento com BAY 58-2667 sobre os parâmetros

inflamatórios vesicais. Determinação do edema vesical (A), atividade da enzima
mieloperoxidase (MPO) (B) e expressão protéica da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2)
em bexigas de animais controles e com cistite, tratados ou não com BAY 58-2667.
Valores expressos como média ± E.P.M. ANOVA de duas vias, pós-teste de Bonferroni,
n = 5 animais/grupo, *P < 0,05 vs Veículo + Salina. CTRL, controle (veículos); CYP,
ciclofosfamida.
 66

5. DISCUSSÃO

No presente estudo, demonstramos que a disfunção miccional e processo

inflamatório vesical induzidos pela administração de CYP é acompanhada por

alterações marcantes na via de sinalização GCs/GMPc, evidenciada pela redução na

expressão protéica das subunidades desta enzima e nos nívis de GMPc. Demonstramos

também que o pré-tratamento com o ativador de GCs, BAY 58-2667, foi capaz de

prevenir ambas as alterações e melhorar a disfunção miccional.

A CI/SDV é uma síndrome há muito tempo reconhecida, mas o exato mecanismo

patogênico desta doença ainda não foi completamente esclarecido, e os regimes de

tratamentos são, na maioria das vezes, apenas sintomáticos83. A inflamação na bexiga

induzida pela CYP em roedores é um modelo experimental bem estabelecido para

CI/SDV37. Após administração sistêmica, a CYP é metabolizada, produzindo, dentre

outros metabólitos, a acroleína, que se acumula na bexiga urinária, causando irritação

local, que resulta em inflamação grave e hiperatividade vesical36. Por haver muitas

similaridades entre a CI/SDV e a cistite induzida por CYP, este modelo tem sido

amplamente utilizado para se caracterizar vias inflamatórias e alterações funcionais,

assim como para identificação de novos e potenciais alvos terapêuticos para esta

doença83.

Após uma única administração de CYP em ratos e camundongos, observa-se

inflamação aguda na bexiga, caracterizada por perda da integridade da barreira urotelial

e aumento da permeabilidade, edema suburotelial, apoptose de células uroteliais, além

de infiltração de células inflamatórias, como neutrófilos, monócitos e mastócitos37,42,84-

86
. Baseando-nos em estudos já publicados36-38, realizamos a padronização de três

modelos de cistite – agudo, intermediário e crônico – a fim de caracterizar as alterações

 67

morfo-funcionais. Em concordância a esses estudos, induzimos com sucesso a cistite em

camundongos após injeção de CYP, e observamos as alterações histológicas, como

denudação do urotélio e desorganização tecidual; edema inflamatório, ruptura urotelial e

disfunção miccional.

Constatamos ainda que a exposição à CYP induziu alterações funcionais marcantes,

favorecendo um fenótipo disfuncional hiperativo, confirmado em estudo recente79. O

perfil de micção nos animais conscientes foi caracterizado por elevado número de

manchas de micção e de pequeno volume, que foi consistente com os registros

cistométricos nos animais anestesiados, os quais apresentaram elevação marcante na

frequência de micção, CNMs e pressão basal.

A bexiga urinária é densamente inervada por fibras nervosas parassimpáticas cuja

ativação resulta na liberação de ACh que produz contração do músculo liso detrusor

detrusor via ativação de receptores muscarínicos5. A predominância de receptores

muscarínicos do subtipo M2 e de uma população menor do subtipo M3 já foram

reportadas na bexiga urinária; entretanto, sabe-se que o subtipo M3 tem maior

importância nas repostas contráteis mediadas por mecanismos colinérgicos5. Alguns

estudos mostram que a expressão e importância funcional dos receptores muscarínicos

na bexiga podem ser alterados no curso da cistite87-90. Assim, experimentos de

imunoblotting e imunohistoquímica revelaram que alterações no sistema colinérgico

induzidas pela exposição à CYP envolvem up-regulation de receptores muscarínicos

M2, M4 e, predominantemente, M5 no urotélio91. Um estudo mostrou que a expressão

do RNAm de receptores muscarínicos M2 e M3 aumenta no urotélio e reduz no

detrusor73. Em nosso estudo, e em concordância com estudos anteriores91-94, as

contrações in vitro da bexiga induzidas pela adição do agonista muscarínico, carbacol,

foram significativamente menores nos animais com cistite após 4 e 24 horas. Ademais,
 68

a redução da força de contração do detrusor em resposta a ativação de receptores

muscarínicos nos animais expostos à CYP pode se relacionar aos reduzidos volumes de

micção, o que resulta em urina resídual, estando também associado ao aumento da

frequência de micções (papel filtro). Apesar da aparente discrepância entre o perfil

hiperativo da bexiga (observado nos ensaios de papel filtro e estudos urodinâmicos) e a

hipocontratilidade do detrusor in vitro, alguns estudos sugerem que uma excessiva

sensibilidade de vias aferentes e intensa liberação de fatores derivados do urotélio91,95

contribuem para este perfil hiperativo. Também tem sido proposto que condições de

inflamação grave de estresse oxidativo podem causar hipoatividade do detrusor devido a

danos no músculo liso96. Entretanto, observamos que a contração da bexiga induzida

pela adição do agente despolarizante KCl (80 mM) não foi diferente entre os grupos

cistite de 24 horas e crônico em relação ao grupo controle, indicando que a capacidade

contrátil da bexiga não foi afetada pela CYP. Dessa forma, é provável que o prejuízo na

contração ao carbacol do detrusor no grupo cistite 24 horas deva-se, majoritariamente, a

um prejuízo no sistema/receptores colinérgicos. Vale ressaltar que no grupo cistite 4

horas notamos uma maior resposta contrátil ao KCl em relação aos demais grupos, que

é indicativo de maior sensibilidade de canais iônicos, principalmente canais de Ca2+ do

tipo L, que contribuiria para a hiperatividade da bexiga97. Em relação a contração

induzida por estimulação elétrica, esta resultou em respostas contráteis dependentes das

frequências aplicadas em todos os grupos, entretanto, observamos redução significativa

no grupo cistite de 4 horas, em todas as frequências avaliadas. As contrações do

detrusor induzidas por estímulo elétrico refletem, principalmente, a ação dos

neurotransmissores ACh e ATP liberados das fibras parassimpáticas, e, visto que esses

animais também apresentam hiporreatividade ao carbacol, sugere-se uma alteração na

 69

liberação ou degradação de ACh, porém os mecanismos envolvidos não foram

caracterizados.

Dentre os grupos com cistite, observamos alterações mais evidentes no grupo cistite

24 horas, o que nos permite concluir que este é melhor modelo, dentre os avaliados,

para estudo das alterações funcionais observadas na cistite. Apesar de existirem

diferenças histopatológicas entre a cistite 24 horas de exposição à CYP e a CI/SDV

crônica, a marcante degradação do urotélio e irritação da parede da bexiga, resultando

em urgência, disúria, aumento da frequência e noctúria são alterações comumente

observadas em ambas as condições98. Assim, elegemos o grupo cistite 24 horas como

modelo para se avaliar os efeitos protetores do BAY 58-2667.

O NO, via GCs/GMPc, possui atividade inibitória sobre a musculatura lisa vesical
99
. Ratos tratados cronicamente com inibidores de NOS desenvolvem bexiga

hiperativa75. Portanto, a redução dos níveis de NO pode contribuir para a hiperatividade

da bexiga observada nos animais com cistite. Deficiências na via GCs/GMPc ainda não

haviam sido caracterizadas na cistite experimental. Por isso, avaliamos a expressão de

GCs e níveis de GMPc ao longo de 24 horas após exposição à CYP. Demonstramos

uma degradação da GCs tempo-dependente, e ao final de 24 horas de exposição à CYP,

observamos que a expressão protéica e gênica da enzima foram ~50% menores em

relação ao grupo controle, bem como os níveis de GMPc. Dessa forma, fica evidente a

deficiência desta via de sinalização na disfunção vesical induzida pela CYP, tornando-a

um interessante alvo terapêutico para CI/SDV.

Ativadores de GCs, como o BAY 58-2667, interagem diretamente com o

grupamento heme prostético da GCs, restaurando a resposta da enzima, mesmo em

condições oxidativas49,50,100. Em modelo de hipertensão induzida pelo L-NAME, a

ativação da GCs pelo BAY 58-2667 normalizou a hipertensão arterial e a

 70

vasoconstrição renal, restaurando o fluxo sanguíneo renal48. Em nosso estudo, o pré-

tratamento dos animais expostos à CYP com BAY 58-2667 preveniu significativamente

as reduções de volume e do número de micções avaliadas nos animais conscientes.

Preveniu, ainda, as alterações cistométricas, incluindo as elevações na pressão basal,

frequências de micção e CNMs, além de prevenir as reduções da capacidade,

complacência e intervalo entre micções nos animais anestesiados. A redução da

contração ao carbacol in vitro nos animais com cistite também foi prevenida pelo pré-

tratamento com BAY 58-2667.

Em seguida, nos direcionamos a avaliar os mecanismos pelos quais o BAY 58-2667

previne as disfunção vesical induzida pela CYP realizando-se ensaios de imunoblotting

das subunidades da GCs e de ELISA para os níveis de GMPc. Notamos que a exposição

à CYP resulta em marcantes reduções nas expressões das subunidades α1 e β1 da GCs e

na produção de GMPc, alterações estas prevenidas pelo pré-tratamento com BAY 58-

2667.

O estresse oxidativo elevado tem sido implicado em diferentes condições

patológicas da bexiga54,101,102, incluindo a cistite experimental103. O estresse oxidativo

acompanhando a diabetes tipo II também deteriora a função do músculo liso uretral64.

Além disso, em condições de desbalanço oxidativo vascular, o estado redox da enzima

GCs é alterado para um estado oxidativo, possivelmente como consequência da elevada

geração de ERO. O termo ERO compreende uma variedade de moléculas de sinalização

que desempenham um importante papel na progressão de doenças inflamatórias. Tais

moléculas são classicamente definidas como metabólitos parcialmente reduzidos de

oxigênio, e por possuírem forte capacidade oxidativa são capazes de oxidar proteínas,

lipídios e constituintes celulares, além de danificar o DNA104. As principais ERO

incluem o ânion superóxido (O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila

 71

(OH-). O NO também pode reagir com o ânion superóxido para formar peroxinitrito

(ONOO-). Normalmente, as células dispõem de enzimas antioxidantes que atuam contra

o acúmulo de ERO, como a catalase, glutationa peroxidase e superóxido

dismutase105,106.

Atualmente, os mecanismos moleculares subjacentes a degradação da GCs heme-

oxidada permanecem desconhecidos. Especula-se que a oxidação do grupamento heme

desestabiliza a enzima, tornando-a susceptível a degração via ubiquitina-proteassoma49.

Entretanto, sabe-se que o BAY 58-2667 liga-se com elevada afinidade ao grupamento

heme oxidado da GCs, anulando os efeitos dos compostos heme-oxidantes na proteína,

preservando assim sua sinalização e atividade49,107.

Para avaliar os níveis de estresse oxidativo nas bexigas dos animais expostos à CYP,

realizamos ensaio de histoquímica com DHE em secções frescas de bexigas,

identificando-se a formação de ERO no detrusor e no urotélio. Nossos resultados

mostraram que a CYP aumenta significativamente os níveis de ERO em ambos,

detrusor e urotélio, os quais são prevenidos pelo pré-tratamento com BAY 58-2667.

Estudos prévios demonstraram que o tratamento com antioxidantes, como tempol,

flavonóides antioxidantes e glutationa, reduz o estresse oxidativo e melhora a disfunção

vesical induzida pela CYP103,108.

Observamos ainda uma marcante resposta inflamatória acompanhando a disfunção

miccional pela exposição à CYP, como evidenciado pela elevação da atividade da MPO,

um marcador para infiltração neutrofílica109, da expressão protéica da COX-2 e da razão

peso da bexiga/peso corporal, indicativo de edema inflamatório. É reconhecido que a

expressão de COX-2 está elevada no urotélio subsequente a inflamação induzida por

CYP110,111. A COX-2 é uma enzima chave na conversão do ácido araquidônico a

prostanóides pró-inflamatórios, como a prostaglandina E2, que desempenha papel

 72

importante na hiperatividade do detrusor e dor associada a inflamação da bexiga112. De

fato, antiinflamatórios não esteroidais são empregados na CI/SDV para diminuição da

dor83. Entretanto, o pré-tratamento com BAY 58-2667 não alterou os parâmetros

inflamatórios avaliados, sugerindo que a melhora promovida por este ativador na

disfunção vesical ocorre independentemente do processo inflamatório local.

Na dose utilizada no presente estudo, o BAY 58-2667 não interferiu

significativamente na maioria das avaliações funcionais e moleculares nos animais

controles, não inflamados, reforçando que o BAY 58-2667 depende de uma condição

oxidativa prévia para exercer suas ações. Este seria um indicativo de seletividade da

droga e uma grande vantagem farmacológica. Ressalta-se que o com BAY 58-2667 em

animais controles reduziu significativamente a pressão basal (análise cistométrica),

sugerindo que este ativador por si produz algum nível de relaxamento da bexiga.

Estudo anterior mostrou menor fluxo sanguíneo na bexiga de pacientes com

CI/SDV, apesar de não ter ficado claro se esta alteração contribui, parcial ou totalmente,

para os sintomas vesicais113. Reconhecido como potente vasodilatador, o BAY 58-2667

é capaz de produzir vasodilatação sustentável na circulação cardíaca e veias

pulmonares, melhorando a perfusão tecidual, reduzindo assim os danos locais114,115.

Dessa forma, acreditamos que a melhora da função vesical pelo BAY 58-2667 pode

também se dar através de um efeito indireto por promover vasodilatação dos vasos

sanguíneos que irrigam a bexiga, facilitando inclusive o clearance de espécies reativas.

Entretanto, estudos adicionais são necessários para se comprovar esta hipótese.

Em suma, este estudo mostrou que a exposição à CYP acarreta alterações vesicais in

vivo, favorecendo um quadro hiperativo. A via de sinalização GCs/GMPc está

marcantemente alterada na cistite induzida por CYP, com redução significativa na

expressão e atividade da enzima GCs, os quais são prevenidos pelo tratamento com o
 73

ativador de GCs, BAY 58-2667. Sugerimos que a preservação das subunidades da GCs

e normalização da produção de GMPc resulta na melhora da disfunção vesical e

manutenção de ciclos adequados de micção. Pesquisas futuras ainda são necessárias

para o melhor entendimento da patofisiologia desta doença e identificação de opções

terapêuticas novas, seguras e efetivas. Nesse sentido, a classe dos ativadores de GCs

pode prover uma nova opção para tratamento da CI/SDV.

 74

6. CONCLUSÃO

• A exposição à CYP promoveu nos três momentos avaliados (4 h, 24 h e 10 dias)

aumento significativo de peso vesical, níveis elevados de MPO e alterações

histológicas, como edema, desorganização tecidual e denudação do urotélio.

• A exposição à CYP promoveu disfunção miccional e hiperatividade do detrusor,

caracerizada por elevação de parâmetros de pressão vesical, de frequência urinária e

de contrações não-miccionais, assim como redução do volume de micção.

• A contração do músculo detrusor isolado induzida pelo carbacol se mostrou

reduzida nos animais injetados com CYP.

• A injeção de CYP provocou a intensa degradação da enzima GCs no tecido vesical,

de forma tempo dependente, e com consequente redução dos níveis de GMPc.

• Dentre três grupos experimentais de cistite induzida por CYP, concluímos que o

modelo intermediário, injeção única de CYP (300 mg/kg) e avaliação após 24 horas,

consiste no melhor modelo para o estudo da disfunção miccional induzida por CYP,

uma vez que observamos alterações mais consistentes e similares com a doença em

humanos.

• O pré-tratamento com BAY 58-2667 preveniu significativamente a disfunção

miccional na cistite induzida por CYP, preservou as subunidades da enzima GCs e

normalizou a produção de GMPc.

• O pré-tratamento com BAY 58-2667 não influenciou o edema, a atividade de MPO

e expressão de COX-2 no tecido vesical dos animais expostos à CYP, porém

preveniu de modo significativo a geração de ERO.

• Em conclusão, os ativadores da enzima GCs podem constituir uma nova e

promissora alternativa para a terapêutica da CI/SDV.
 75

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8. ANEXO