UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E

CIÊNCIA DE ALIMENTOS
DISCIPLINA: SEPRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE BIOMELÉCULAS
PROFESSORA: Renata Cristina Ferreira Bonomo
ALUNO: Raphael Patury Lins MATRÍCULA: 2023m0055

Atividade 1

Exercício 1) A água, a amônia e o metano têm massas moleculares próximas. Apesar

disso, a água possui ponto de ebulição muito mais elevado que os da amônia e do
metano. Com base nas interações intermoleculares e geometria e estrutura dos
compostos, explique porque este fato ocorre.

A água (H2O), a amônia (NH3) e o metano (CH4) são moléculas que possuem
massas moleculares próximas, mas possuem propriedades físicas muito diferentes,
incluindo pontos de ebulição. A partir da molécula e da natureza das ligações, pode-se
deduzir se determinada substância se encontra no estado sólido, líquido ou gasoso. As
substâncias podem ser encontradas em um desses três estados da matéria devido às forças
atrativas intermoleculares, ou somente forças intermoleculares. O ponto de ebulição de
uma substância é influenciado pelas forças intermoleculares presentes nas moléculas.

A água possui um ponto de ebulição muito mais elevado do que a amônia e o

metano, mesmo que as massas moleculares sejam semelhantes, devido às pontes de
hidrogênio presentes nas moléculas de água. As pontes de hidrogênio são forças
intermoleculares fortes que ocorrem quando um átomo de hidrogênio ligado a um átomo
eletronegativo, como o oxigênio na água, interage com o par de elétrons não compartilhado
de um átomo eletronegativo em outra molécula. A forma em V das moléculas HOH e a
natureza polarizada da ligação O−H resultam na distribuição assimétrica de cargas dentro
da molécula. Polaridades dessa grandeza resultam em forças de atração intermoleculares
consideráveis, o que faz com que as moléculas se associem com uma tenacidade
considerável.

As grandes forças de atração intermolecular entre as moléculas de água podem ser

explicadas por sua capacidade de participar de diversas associações por ligações de
hidrogênio no espaço tridimensional. Como cada molécula de água apresenta um número
igual de sítios doadores e aceptores de ligação de hidrogênio, arranjados de modo a
permitir ligações de hidrogênio tridimensionais, a força de atração entre as moléculas de
água é excepcionalmente alta em comparação à força de atração existente entre outras
moléculas pequenas que também possuem ligações por ponte de hidrogênio

A amônia também possui pontes de hidrogênio, mas menos fortes que as da água,
porque o hidrogênio na amônia é menos positivo e o nitrogênio é menos eletronegativo do
que o oxigênio na água. Por isso, a amônia tem um ponto de ebulição mais baixo que a
água. Além disso, não possui números iguais de sítios doadores e aceptores, nenhum deles
pode formar redes tridimensionais de pontes de hidrogênio, como as encontradas na água

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limitando-se a formar redes bidimensionais extensivas, as quais envolvem menos pontes de
hidrogênio por molécula.

Quando se observa o metano, percebe-se que ele não possui pontes de hidrogênio,
mas tem forças de dispersão de London. Essas forças são forças intermoleculares muito
mais fracas do que as pontes de hidrogênio, pois resultam das flutuações momentâneas na
distribuição eletrônica das moléculas. Por isso, o metano tem um ponto de ebulição ainda
mais baixo que a amônia. Além disso, a geometria e a estrutura das moléculas também
influenciam as interações intermoleculares. A água é uma molécula polar, enquanto a
amônia é ainda mais polar e o metano é apolar. Isso afeta as forças intermoleculares, pois
as moléculas polares tendem a interagir mais fortemente do que as moléculas apolares.

Portanto, o ponto de ebulição da água é mais elevado do que o da amônia e do

metano, porque as pontes de hidrogênio presentes nas moléculas de água são mais fortes
do que as interações intermoleculares na amônia e no metano. As diferenças nas forças
intermoleculares são influenciadas pela polaridade, geometria e estrutura das moléculas.

Exercício 2) Sabe-se que a polimerização de proteínas como a Beta-lactoglobulina

com a transglutaminase utilizada na indústria alimentícia é uma técnica utilizada
para diminuir a sinérese e aumentar a viscosidade e a consistência dos queijos de
coalho e iogurtes. Diante deste fato, a obtenção de Beta-lactoglobulina de forma
purificada é um objetivo constante na área de bioprocessos. Uma etapa inicial para
isto seria a precipitação desta proteína. Na Figura a seguir tem-se a relação entre a
solubilidade desta proteína e a concentração de sal e o valor de pH. A partir dos
dados contidos na Figura faça uma discussão sobre a solubilidade desta proteína
frente às variáveis em questão e atrele a isto um modo de retirada desta do meio
aquoso por um processo sem transferência de massa. Descreva outra alteração que
poderia ser feita no meio e que levaria a precipitação da mesma.

A precipitação de proteínas é uma técnica que se baseia na redução da solubilidade

das proteínas em uma solução, levando à formação de uma fase sólida (precipitado) e uma
fase líquida (sobrenadante). Isso ocorre quando as condições do meio são alteradas, como
mudança de pH, adição de sal ou solvente orgânico, ou alteração da temperatura. A solu-
bilidade das proteínas depende da força iônica e do pH. Se o pH se aproxima do pI de uma

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determinada proteína, a carga líquida dessa proteína irá para zero e, na ausência de repul-
são eletrostática, forças de atração eletrostática fracas podem levar à agregação e precipi-
tação; essa tendência de interagir pode ser promovida pela redução da força iônica.
No caso da Beta-lactoglobulina, a precipitação pode ser realizada através da alter-
ação do pH da solução onde ela se encontra. A Beta-lactoglobulina possui um ponto
isoelétrico (pI) de aproximadamente 5,3. Acima ou abaixo desse pH, todas as moléculas
têm cargas negativas ou positivas e se repelem, de modo que a proteína é muito solúvel em
pH ácido ou básico. No ponto isoelétrico, a carga líquida é zero, mas cada molécula ainda
apresenta manchas superficiais de carga positiva e negativa.
As interações iônicas entre eles, junto com outros tipos de interações intermolecu-
lares, como as forças de van der Waals, fazem com que as moléculas tendam a se agrupar e
precipitar. Portanto, a solubilidade é mínima no ponto isoelétrico. Se a força iônica é au-
mentada, no entanto, a atmosfera do contra-íons encolhe em torno das regiões carregadas e
as interações atraentes entre os grupos positivos e negativos são efetivamente rastreadas.
Consequentemente, a solubilidade aumenta, mesmo no ponto isoelétrico.
O gráfico indica uma mudança no pH da solubilidade mínima para um pH mais alto
com a diminuição da concentração de NaCl. Percebe-se que, de acordo com o gráfico, o
aumento do teor de sal parece reduzir ligeiramente o pI da β-lactoglobulina, mas não
diminuir a solubilidade mínima da proteína em água. Em relação à concentração de sal, a
solubilidade da proteína pode ser afetada de duas maneiras distintas, dependendo do tipo
de sal presente na solução. Salting in: em baixas concentrações de sal, a presença de íons
pode aumentar a solubilidade da Beta-lactoglobulina, por meio de interações eletrostáticas
que estabilizam a estrutura da proteína e reduzem sua hidrofobicidade. Salting out: em con-
centrações mais elevadas, a presença de íons pode diminuir a solubilidade da proteína, por
meio da competição pelos íons hidratados e pela diminuição do volume de solvente
disponível para a proteína.
Em relação ao pH, a solubilidade da Beta-lactoglobulina é influenciada pelo ponto
isoelétrico (pI) da proteína. Em pH abaixo do pI, a proteína possui carga positiva e pode in-
teragir com outras moléculas carregadas negativamente, favorecendo sua precipitação. Já
em pH acima do pI, a proteína possui carga negativa e pode interagir com outras moléculas
carregadas positivamente, reduzindo sua solubilidade.
Para retirar a Beta-lactoglobulina do meio aquoso por um processo sem transferên-
cia de massa, é possível utilizar técnicas de separação por adsorção. Uma das técnicas de
adsorção que pode ser utilizada para a separação da Beta-lactoglobulina é a cromatografia

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de afinidade. Nessa técnica, a superfície sólida é funcionalizada com um ligante específico
para a proteína de interesse, como um anticorpo ou um análogo da proteína. A solução
contendo a proteína é injetada no sistema de cromatografia e as moléculas de Beta-lac-
toglobulina são adsorvidas pelo ligante na superfície sólida. Após a adsorção, a proteína
pode ser eluída com uma solução que altere as condições de interação entre a proteína e o
ligante, permitindo sua separação do meio líquido.

Outra alteração que pode levar à precipitação da Beta-lactoglobulina é a adição de

solventes orgânicos, como etanol, isopropanol ou acetona, à solução aquosa contendo a
proteína. A adição de solventes orgânicos pode desestabilizar as interações hidrofóbicas
entre as cadeias de proteína, diminuindo sua solubilidade e favorecendo a sua precipitação.
Após a adição do solvente, a solução é agitada e/ou centrifugada para promover a precipi-
tação da proteína. Em seguida, a proteína pode ser separada do sobrenadante por filtração
ou decantação, e pode ser lavada com uma solução contendo o solvente orgânico para re-
mover resíduos de sais e outras impurezas.
A solubilidade de uma proteína pode ser afetada pela temperatura do meio. Normal-
mente, a solubilidade aumenta com o aumento da temperatura entre 0 e 40 °C, mantendo-
se constante o pH e a força iônica, exceto para proteínas altamente hidrofóbicas, que apre-
sentam uma relação negativa com a temperatura. No entanto, acima de 40 °C, a energia
cinética térmica aumenta e pode levar ao desdobramento (desnaturação) da proteína, ex-
posição de grupos apolares, agregação e precipitação, o que resulta em diminuição de solu-
bilidade. Por outro lado, temperaturas baixas também podem desestabilizar as estruturas
protéicas, principalmente quando a interação hidrofóbica é o principal fator estabilizador
da estrutura terciária. Essas interações são mais fracas em baixas temperaturas, em com-
paração com as ligações de hidrogênio e eletrostáticas.

Exercício 3) Você está conduzindo um estudo a respeito da solubilidade de vitaminas.

Dentro deste contexto, você escolheu as vitaminas A e C para determinar a
solubilidade delas em três solventes: água, clorofórmio e álcool etílico. Indique e
explique qual vitamina será mais solúvel em cada um dos solventes citados.

A vitamina C é mais solúvel em água do que em clorofórmio e álcool etílico. Isso

ocorre devido à presença de grupos hidroxila na molécula da vitamina C, que estabelecem
interações de hidrogênio com a água, aumentando a solubilidade. Já o clorofórmio e o

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álcool etílico são solventes apolares, o que dificulta a interação com grupos hidroxila,
resultando em uma menor solubilidade da vitamina C.
Já a vitamina A é mais solúvel em solventes apolares, como o clorofórmio e o
álcool etílico, do que em água. Isso ocorre devido à sua estrutura molecular, que é
composta por uma longa cadeia hidrocarbonada apolar. Assim, a interação entre a vitamina
A e solventes apolares é favorecida, aumentando a solubilidade, enquanto que a interação
com a água é mais limitada, resultando em uma menor solubilidade.

Exercício 4) De acordo com estudos, muitos baseados na série de Hofmeister, existe

uma relação entre a ação de íons sobre a molécula de água e a camada de solvatação
de biomoléculas. A partir dos artigos sobre a série de Hofmeister enviados e dos
estudos sobre interações intermoleculares, descreva como esta relação citada acima
pode influenciar na solubilidade ou na precipitação de biomoléculas. Aborde como
íons “cosmotrópicos” e “caotrópicos” podem induzir o efeito salting-in ou o efeito
salting-out.

A série de Hofmeister é uma sequência de íons que foram classificados em ordem

crescente de sua capacidade de salting-out ou salting-in em soluções aquosas. A ordem da
série de Hofmeister é a seguinte:

CO3 2- > SO4 2- > SO2O3 2- > H2PO4 - > F- > Cl- > Br- ∼ NO3 - > I- > ClO4 - > SCN-

A relação entre a ação dos íons sobre a molécula de água e a camada de solvatação
das biomoléculas pode influenciar significativamente a solubilidade e precipitação de
biomoléculas em soluções aquosas. Os íons destacados a esquerda do cloreto são
chamados íons cosmotrópicos, e possuem a tendência de precipitar proteínas em solução e
prevenir o desenovelamento de proteínas, por outro lado os íons que se encontram a direita
do cloreto são denominados íons caotrópicos, que por sua vez aumentam a solubilidade e
promovem a desnaturação de proteínas. O íon cloreto é considerado o ponto divisor entre
os comportamentos cosmotrópicos e caotrópicos. Esses termos foram originalmente
desenvolvidos referindo-se à habilidade que esses íons têm de alterarem as ligações de
hidrogênio da estrutura das moléculas de água que envolvem os solutos

Íons cosmotrópicos, têm uma estrutura mais rígida e organizam a molécula de água
em torno de si, reduzindo a entropia da solução e diminuindo a solubilidade das

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biomoléculas, levando ao efeito de salting-out. Por outro lado, íons caotrópicos, têm uma
estrutura mais flexível e não organizam tanto a molécula de água em torno de si,
aumentando a entropia da solução e aumentando a solubilidade das biomoléculas, levando
ao efeito de salting-in.
Em geral, quanto maior a concentração de íons cosmotrópicos, menor é a
solubilidade de biomoléculas, e quanto maior a concentração de íons caotrópicos, maior é a
solubilidade de biomoléculas. Portanto, a escolha de íons para uso em soluções de
biomoléculas pode ser estrategicamente feita com base na série de Hofmeister, com o
objetivo de maximizar a solubilidade das biomoléculas e minimizar a precipitação
indesejada.
A influência da série de Hofmeister na solubilidade ou precipitação de
biomoléculas pode ser observada em diversas aplicações, como na purificação de proteínas
por precipitação salina. Nesse caso, o íon escolhido para induzir a precipitação deve ser
selecionado de acordo com a propriedade físico-química da proteína, para garantir o
máximo rendimento de precipitação. A série de Hofmeister descreve a capacidade de
diferentes íons em afetar a solubilidade de biomoléculas, e essa influência é devida à sua
ação específica na camada de solvatação. Íons cosmotrópicos induzem o efeito salting-in,
aumentando a solubilidade, enquanto íons caotrópicos induzem o efeito salting-out,
diminuindo a solubilidade.