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Controle Biológico 60 (2012) 132–140

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Controle biológico

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Biocontrole pós-colheita deMonilinia laxa, Monilinia fructicolaeMonilinia fructigena

em frutas de caroço por doisAureobasidium pullulansDeformação
Marta Mari⇑, Camilla Martini, Michela Guidarelli, Fiorella Neri
CRIOF – Diproval, Universidade de Bolonha, Via Gandolfi, 19, 40057 Cadriano, Bolonha, Itália

destaques resumo gráfico

"O efeito antagônico de duas leveduras

foi testado no mesmo experimento
contraM. laxa, M. fructicolaeM.
frutigena.
"Os dois antagonistas foram identificados
por ferramentas moleculares e
morfológicas comoAureobasidium
pullulans. "As células lavadas dos antagonistas
completamente inibidoM. laxae
fructicolaapodrece e reduz
M.frutigenainfecções.
"A baixa temperatura não influenciou
eficácia antagonista,M. laxaeM.
fructicolaforam completamente inibidos
pelos antagonistas.

artigoinfo abstrato

Historia do artigo: Os efeitos antagônicos das leveduras, L1 e L8, isoladas da carposfera de pêssegos 'Redhaven' foram testados pela primeira
Recebido em 22 de abril de 2011 Aceito em 22 vez no mesmo experimento contra trêsMoniliniaespécies (Monilinia laxa, Moniliniafructicola eMonilinia fructigena)emem vitro
de outubro de 2011 Disponível online em 29 de
ena Vivoensaios. Os dois antagonistas foram selecionados após ensaios preliminares por sua capacidade de reduzir a
outubro de 2011
podridão parda em pêssegos e nectarinas, e ambos foram identificados por ferramentas moleculares e morfológicas como
Aureobasidium pullulans.Emna Vivoensaios, nem as células autoclavadas, nem os filtrados de cultura estéril de qualquer um
Palavras-chave:
dos antagonistas mostraram qualquer redução significativa da incidência de podridão produzida por inóculos dos três
Pêssego
Moniliniaespécies, enquanto as células lavadas de L1 e L8 inibiram completamenteM. laxaeM. fructicolaapodrece e reduz
Nectarina
M.frutigenainfecções em 70% e 90%, respectivamente. Em outros experimentos, nectarinas tratadas com células antagonistas
podridão parda

Leveduras
e inoculadas com os patógenos foram armazenadas a 0 -C por 21 dias, mais 7 dias a 20 -C. A baixa temperatura reduziu o
doença pós-colheita desenvolvimento da podridão parda, uma vez que todas as frutas estavam livres de sintomas da doença ao serem retiradas do
armazenamento refrigerado. No entanto, após 7 dias a 20 -C, os frutos não tratados apodreceram mais de 45%, dependendo
doMoniliniaespécies, mas os antagonistas inibiram completamente
M. laxaeM. fructicola,enquantoM.frutigenaas infecções foram reduzidas em 89,8% e 91,2% em L1 e L8,
respectivamente. Para ambas as cepas, 108CFU ml-1foi a concentração mais ativa, embora L1 tenha apresentado boa
atividade na concentração de 107CFU ml-1. Isolar L8 na concentração de 107CFU ml-1foi ineficaz contraM. fructicolae
M.frutigena,não havendo diferença entre os frutos tratados e o controle, exceto no caso das nectarinas inoculadas
comM. laxa,onde L8 na concentração de 107CFU ml-1
reduziu as infecções de podridão parda em relação ao controle. O aumento da densidade populacional deA.
pullulanscepas L1 e L8 nas feridas de nectarinas armazenadas a 0 ou 20 -C foi baixa, mas suficiente para controlar a
podridão parda. Em conclusão, o presente estudo preliminar identificou duas cepas antagonistas deA. pullulans
como ingredientes ativos para o desenvolvimento de biofungicidas para aplicação pós-colheita contra três Monilinia
espécies responsáveis por grandes perdas econômicas em fruteiras de caroço.
- 2011 Elsevier Inc. Todos os direitos reservados.

⇑Autor correspondente. Fax: +39 051765049.

Endereço de email:marta.mari@unibo.it (M. Mari).

1049-9644/$ - ver matéria inicial - 2011 Elsevier Inc. Todos os direitos reservados.
doi:10.1016/j.biocontrol.2011.10.013
 M. Mari et al. / Controle Biológico 60 (2012) 132–140
1. Introdução
A podridão parda é uma das doenças fúngicas mais importantes em
Prunusespécies em todo o mundo (Batra, 1991). A doença pode ser causada
por três espécies:Monilinia laxa (Aderhold e Ruhland) Querida,Monilinia
fructicola (Inverno) Mel eMonilinia fructigena (Aderhold e Ruhland) (Ogawa e
outros, 1995).M.frutigenaé predominante em pomefruits.M. fructicolaé o
patógeno mais comum em frutas de caroço na América do Norte,
Australásia, Japão e Brasil, embora tenha sido identificado apenas
recentemente em países europeus.Lichou et al., 2002; De Cal e outros, 2009;
Pellegrino e outros, 2009), passando de A1 para A2 na lista de organismos
em quarentena (EPPO, 2003).M. laxaé a espécie mais comum nos pomares
de frutas de caroço da Europa e da África do Sul. Todos os três patógenos
podem causar perdas severas em frutas de caroço, mais frequentemente
após a colheita durante o armazenamento e transporte do que no campo.
Na Europa, as perdas pós-colheita causadas porM. laxaàs vezes atingem
valores altos (59%) (Larena e outros, 2005), enquantoM. fructicolanos EUA,
quando em condições favoráveis ao desenvolvimento da doença, produz
altas perdas pós-colheita, em alguns casos atingindo valores de 80 a 90% (
Hong e outros, 1997). Poucas perdas produzidas porM.frutigenaem frutas
de caroço foram relatadas, mas recentemente foi detectado com frequência
na Itália em cerejas e pêssegos (Mari, comunicação pessoal).
Chuvas perto da colheita, alta umidade e temperaturas quentes são
favoráveis ao desenvolvimento da podridão parda, e um cronograma
padrão italiano para controlar o patógeno recomenda duas aplicações de
fungicidas no campo, a primeira durante a floração e a segunda logo antes
da colheita. Na Europa, nenhum tratamento químico é permitido em frutas
de caroço após a colheita (Casals e outros, 2010), favorecendo
frequentemente o desenvolvimento da podridão parda durante o
armazenamento, transporte, varejo e nos locais de consumo.Moniliniao
controle depende de uma estratégia integrada baseada em programas de
pulverização de fungicidas nos pomares e práticas culturais e manutenção
de condições adequadas de armazenamento em frigoríficos e durante a
distribuição. No entanto, para superar os problemas relacionados ao uso de
fungicidas e seus resíduos em frutas, outras estratégias de controle de
patógenos têm sido investigadas. Estes incluem tratamentos baseados em
agentes de biocontrole (BCAs) (Karabulut e Baykal, 2003; Larena et al., 2005;
Zhang e outros, 2010), produtos químicos de baixa toxicidade (Gregori e
outros, 2008), água quente (Karabulut e outros, 2004, 2010) e substâncias
naturais (Neri e outros, 2007; Mari e outros, 2008). Dentro dos BCAs, as
leveduras que ocorrem naturalmente na superfície de frutas ou vegetais
geralmente são preferidas para o controle de doenças pós-colheita, como
podridão parda eMetschnikowia pulcherrima (Pitt & MW Mill.) (Grebenisan e
outros, 2008),Pseudozyma fusiformata (Buhagiar) (Zhang e outros, 2010),
Cryptococcus laurentii (Kuff.) CE Skinner (Yao e Tian, 2005) são exemplos de
leveduras testadas contraM. laxaouM. fructicolaem frutas de caroço.
Leveduras e microrganismos semelhantes a leveduras merecem atenção
especial como BCAs, uma vez que sua atividade não está relacionada à
produção de antibióticos, não tem impacto ambiental ou toxicológico
negativo, também são facilmente cultivados para produção em larga escala
em meios nutritivos baratos e simples.Aureobasidium pullulans (De Bary)
Arnaud, um micróbio semelhante a uma levedura, reside em diferentes
ambientes, como a superfície da fruta, desde os estágios iniciais de seu
desenvolvimento até a maturidade (Janisiewicz e outros, 2010) ou em tecidos
lenhosos e folhas (González e Tello, 2011). Sua atividade preventiva contra
doenças fúngicas no armazenamento e no campo tem sido amplamente
divulgada:Botrytis cinereaPers. ePenicillium expansumLink. em maçãs (
malus domesticaBorkh) (Castoria et al., 2001; Weiss e outros, 2006; Zhang e
outros, 2010),Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. eAspergillus niger (Tiegh.)
em uvas de mesa (Vitis viniferaTerraP. italicumeP. digitatumem frutas
cítricas (Lima e outros, 1999) foram significativamente controladas pela
aplicação deA. pullulans.Apesar desses resultados encorajadores, apenas
alguns estudos relataram o controle deMoniliniaspp. porA. pullu-
133
lans. M. fructicolafoi inibido por cepas deA. pullulansem nectarinas
Prunus persica (L.) Batsch. var.laevis (Janisiewicz e outros, 2010),
enquanto o diâmetro de podridão em pêssegosP. pérsica (L.) Batsch
infectado porM. laxafoi reduzido pela metade por um tratamento
baseado emA. pullulanscepa PL5 (Zhang e outros, 2010). Portanto,
esforços adicionais devem ser feitos para rastrear e desenvolver novos
BCAs e disponibilizar no mercado produtos biofungicidas eficazes
contra a podridão parda.
O objetivo do presente estudo foi o isolamento de BCAs eficazes
contra a podridão parda em pêssegos e nectarinas. Os antagonistas
são geralmente selecionados por sua atividade contra uma espécie de
patógeno, enquanto em nossos experimentos duas cepas efetivas deA.
pullulans (L1 e L8) foram testadosem vitroena Vivocontra três espécies
deMonilinia (M. laxa, M. fructicolaeM.frutigena),todos derivados de
Moniliniapopulações presentes na região de Emilia-Romagna da Itália.
O efeito das concentrações de BCA e das temperaturas de
armazenamento da fruta na eficácia do biocontrole também foi
testado. Por fim, também foi avaliada a dinâmica populacional dos
antagonistas em tecidos feridos de frutas mantidas em temperatura
ambiente e sob refrigeração.
2. Materiais e métodos
2.1. Patógenos e sua identificação molecular por reação de PCR
Uma estirpe deM. laxa,um deM. fructicola,e um deM.frutigenade
nossa coleção foram usados. Os isolados foram cultivados em Potato
Dextrose Agar (PDA) (Sigma St. Louis, MO, EUA) a 25 -C por 10 dias e
identificados por análise morfológica e sequenciamento das regiões ITS
do DNA ribossomal. A PCR foi realizada utilizando primers universais
ITS1 (GCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (GCCTCCGCTT ATTGATATGC)
diretamente de micélio em cultura pura, utilizando os protocolos
descritos porIotti e Zambonelli (2006). As reações de PCR foram
conduzidas em 50eul volume de reações contendo 10 mM Tris/HCl (pH
8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 150euM para cada dNTP, 300euM
para cada iniciador e 1,5 U de TaKaRa Taq DNA polimerase (Takara,
Otsu, Japão). Vinte microgramas de Bovine Serum Albumin (BSA)
(Fermentas, Vilnius, Lituânia) foram adicionados aos tubos de reação
contendo o fragmento molde do micélio fúngico antes de adicionar os
outros reagentes de PCR. As reações de amplificação foram realizadas
em um termociclador T gradiente (Biometra, Gottingen, Alemanha)
com uma desnaturação inicial a 95 -C por 6 min seguido de 30 ciclos de
94 -C por 30 s, 55 -C por 30 s, 72 -C por 1 min e uma etapa final de 72 -C
por 10 min. Os produtos de PCR foram executados em géis de agarose
a 1,5%, corados com brometo de etídio e visualizados sob luz
ultravioleta. O DNA amplificado foi purificado pelo Kit Nucleospin
Extracts II (Macherey-Nagel, Alemanha) e finalmente sequenciado pela
BMR Genomics (Padova, Itália;http://www.bmgenomics.it). As
sequências ITS foram comparadas com as do banco de dados GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) usando a pesquisa BLASTN. Para
os testes de infecção, os patógenos foram cultivados em ágar V-8 (V8A:
250 ml de suco V8 puro e 40 g de ágar em 1 l de água destilada). As
placas de Petri foram incubadas a 25 -C com ciclos de 12 horas de
escuro: 12 horas de luz por 10 dias. As suspensões de conídios foram
preparadas lavando as colônias com água destilada estéril contendo
0,05% (v/v) de Tween 80, quantificadas com hemacitômetro e diluídas
nas concentrações necessárias para cada experimento.
2.2. Fruta
Nectarinas e pêssegos foram obtidos em empacotadoras locais; diferentes
cultivares foram usados de acordo com a disponibilidade. Frutos livres de feridas
visíveis e podridão e homogêneos em maturidade e tamanho foram armazenados
a 0 -C e usados para experimentos dentro de 5 dias
134 M. Mari et al. / Controle Biológico 60 (2012) 132–140
de coleção. Os frutos foram feridos por uma unha estéril (3 - 3 - 3 mm)
no equador (uma ferida por fruto).
2.3. Isolamento de levedura, identificação e seleção preliminar para atividade
contra M. laxa
As cepas L1 e L8 utilizadas neste estudo foram originalmente
isoladas da superfície de pêssegos 'Redhaven' coletados em um pomar
orgânico da Faculdade de Agricultura (Universidade de Bolonha, Itália).
Uma amostra de fruta foi lavada em um béquer de 1 litro contendo 200
ml de tampão fosfato (0,05 M, a pH 6,8) por agitação em agitador rotativo
por 15 minutos a 140 rpm. A lavagem foi centrifugada por 20 min a 4800
rpm, o sobrenadante descartado, exceto por uma pequena quantidade (2
ml) de lavagem que foi diluída em série com tampão fosfato. Cem
microlitros das suspensões diluídas foram transferidos para placas de Petri
contendo BDA adicionado de sulfato de estreptomicina e neomicina (0,1%)
para evitar isolados bacterianos. As placas foram incubadas a 25 -C por até 3
dias, as colônias em desenvolvimento foram observadas sob microscópio de
luz e as leveduras com diferentes características foram selecionadas e
purificadas por tripla re-estreia de colônias únicas em Nutrient Yeast
Dextrose Agar (NYDA: 8 g de caldo nutritivo, 5 g de extrato de levedura, 10 g
de dextrose e 15 g de agar em 1 l de água destilada). Uma seleção
preliminar de antagonistas com base em sua atividade contraM. laxafoi feita
diretamente na fruta testando os isolados em pêssegos 'Springcrest' feridos
e nectarinas 'Rita Stark' de acordo com a disponibilidade, conforme descrito
porBonaterra et ai. (2003). Alíquotas de 20eul de suspensão antagonista (10
7CFU ml-1) foram introduzidos em cada local da ferida. Após 2 horas em
temperatura ambiente, as feridas foram inoculadas com 20eueu de
M. laxade suspensões contendo 103conídios ml-1. Frutas tratadas com 20eul
de água destilada e inoculada com um patógeno representou o controle.
Depois de secos, os frutos foram incubados a 20 -C por 5 d e as
porcentagens de feridas infectadas foram registradas. A unidade amostral
foi representada por 10 frutos para cada isolado de candidato a antagonista.
O experimento foi conduzido duas vezes. Antagonistas selecionados
(classificações de eficácia superiores a 50%) foram usados para ensaios
adicionais em cinco rodadas de triagem de ensaios. Após esses testes
preliminares, dois antagonistas (L1 e L8) foram selecionados e
posteriormente identificados através da observação microscópica da
morfologia celular e da colônia e pelo sequenciamento do domínio D1/D2 do
DNA ribossomal 26S e dos espaçadores internos transcritos (região ITS 1 e 2)
de acordo paraBranco e outros. (1990)como descrito acima. As colônias
purificadas foram mantidas em inclinações NYDA a 4 -C até o uso.
2.4. Atividade antifúngica de L1 e L8 contra M. laxa, M. fructicola e
M. fructigena em frutos armazenados a 20 -C e 0 -C
Os efeitos dos antagonistas selecionados, L1 e L8, foram testados
contraM. laxa, M. fructicolaeM.frutigenaem nectarinas 'Stark Red Gold'.
Cada antagonista foi cultivado em frascos Erlenmeyer de 250 ml
contendo 75 ml de NYDB (NYDA sem ágar) incubados em agitador
rotativo (140 rpm) a 25 -C por 48 h. As células de levedura foram
colhidas por centrifugação a 4800gpor 10 min e ressuspenso em água
destilada estéril (SDW). Uma amostra (5 ml) de células de cada isolado
foi autoclavada (120 -C por 20 min) e representou a suspensão celular
autoclavada (ACS); outra amostra (5 ml) foi centrifugada novamente e
ressuspensa duas vezes em SDW para remover o meio de cultura e
representou a suspensão de células lavadas (WCS) (108CFU ml-1). As
concentrações de células em todas as suspensões foram ajustadas para
108CFU ml-1, com um hemocitômetro, salvo indicação em contrário. O
sobrenadante da primeira centrifugação foi esterilizado por filtração
com microfiltro estéril (0,45eum) e representou o filtrado da cultura
(CF). As frutas foram feridas como descrito acima e tratadas com 20eul
de ACS ou WCS ou CF ou água destilada estéril como controle (CK).
Após secagem ao ar (2 h), 20eueu de
103conídios ml-1suspensões de cada um dos três patógenos foram
pipetadas nas feridas. Os frutos foram mantidos a 20 -C após
tratamento e inoculação. As incidências da doença (porcentagem de
feridas infectadas) foram registradas 5 dias após a inoculação. Cada
tratamento foi representado por cinco frutos e cada tratamento foi
repetido cinco vezes. O experimento foi conduzido três vezes.
Além disso, para determinar o efeito da temperatura de armazenamento
(0 -C) na eficácia de L1 e L8, frutos feridos artificialmente, conforme descrito
acima, foram tratados com 20eul de suspensão celular de cada antagonista
(108CFU ml-1) e após 2 h à temperatura ambiente foram inoculados com a
mesma quantidade de uma suspensão de conídios dos três patógenos (103
conídios ml-1). As amostras controle foram inoculadas apenas com
suspensões de conídios do patógeno. As nectarinas tratadas foram
incubadas a 0 -C durante 21 dias e depois incubadas a 20 -C durante 7 dias,
altura em que se registaram as percentagens de infecções. A unidade
amostral foi representada por quatro repetições de 20 frutos cada. O
experimento foi conduzido duas vezes.
2.5. Ensaios de atividade antagonista in vitro
As cepas selecionadas L1 e L8 foram avaliadas quanto às suas
interações comM. laxa, M. fructicolaeM.frutigenana cultura. Para tanto,
discos (6 mm de diâmetro) foram cortados de placas de PDA e poços
preenchidos com 105-eul de 108CFU ml-1de WCS ou ACS, ou CF das
cepas L1 ou L8 obtidas conforme descrito acima, ou água destilada
estéril como controle (Zhang e outros, 2008). Uma hora depois, uma
alíquota de 35-eul de 105esporos ml-1de um único patógeno foi
inoculado em cada poço. As placas foram então seladas com parafilme
para reter a umidade e evitar a contaminação cruzada e incubadas a 25
-C por 6 dias, momento em que os diâmetros das colônias foram
registrados. A unidade amostral foi representada por cinco pratos para
cada interação entre patógeno e antagonista. O experimento foi
conduzido três vezes.
2.6. Efeito da concentração do antagonista no controle de M. laxa, M.
fructicola e M. fructigena
Suspensões de células de levedura L1 e L8 foram preparadas a partir de
colônias cultivadas em NYDA após 48 h a 25 -C. As concentrações finais de
106, 107e 108CFU ml-1foram preparados por diluição com SDW. As nectarinas
'Guerriera' foram feridas como descrito acima e tratadas com 20eul de
tratamentos L1 ou L8. Após 2 h de secagem ao ar, os frutos foram
inoculados pela introdução de 20eul de suspensão de cada patógeno (103
conídios ml-1) nas feridas. Os frutos foram mantidos a 20 -C por 4 dias após a
inoculação, momento em que a incidência da doença (porcentagem de
feridas infectadas) foi registrada. Cada tratamento foi representado por
cinco frutos repetidos cinco vezes. O experimento foi conduzido três vezes.
2.7. Dinâmica populacional das leveduras L1 e L8
Para estudar a dinâmica populacional de antagonistas, cv 'Guerriera',
nectarinas foram feridas conforme descrito acima e 20eul de suspensão
celular (108CFU ml-1) de L1 ou L8 foram introduzidos em cada ferida. Frutos
tratados foram mantidos a 20 -C e coletados após 0, 6, 24, 48, 72, 96, 120 h
do tratamento ou mantidos a 0 -C e coletados após 0, 7, 14, 21 d mais 7 d a
20 - C (prazo de validade). O número de células de levedura nas feridas foi
determinado conforme descrito por Mari et ai. (1996)com algumas
modificações. Três amostras de tecido de fruta foram retiradas ao redor da
ferida com uma broca de cortiça estéril de 10 mm de diâmetro (cerca de 10
mm de profundidade) e transferidas para sacos de estômago estéreis
contendo 10 ml de SDW e Tween 80 (0,05%) e homogeneizados por um
estômago para 10 min (Bag Mixer 400; Interscience, St Nom, França). A
pasta resultante com diluição prévia em SDW foi revestida na superfície em
NYDA para enumeração de células antagonistas. As placas de Petri foram
incubadas a 25 -C por 2 d. Cada
 M. Mari et al. / Controle Biológico 60 (2012) 132–140
tratamento, contendo três frutos, foi repetido três vezes. O
experimento foi conduzido duas vezes.
2.8. Análise de dados
Todos os dados relativos a frutas infectadas foram submetidos a uma
análise de variância (ANOVA) de um fator usando o pacote estatístico
Statistica para Windows (Statsoft Inc.). A separação de médias foi realizada
usando o teste de diferença mínima significativa (LSD), emP <0,05. Antes da
análise dos dados, a homogeneidade da variância foi testada pelo teste de
Kruskal-Wallis. A fim de melhorar a homogeneidade das variâncias, dados de
dinâmica populacional (CFU feridas-1) foram transformadas em logaritmos.
Todos os experimentos foram conduzidos em delineamento de blocos
inteiramente casualizados.
3. Resultados
3.1. Isolamento de levedura e seleção preliminar para atividade contra M. laxa
Oitenta e seis isolados de leveduras e organismos semelhantes a
leveduras, diferentes em cor e forma, foram isolados da superfície de
pêssegos 'Red Haven'. Realizou-se um processo de seleção diretamente
no fruto tratando feridas de pêssegos e nectarinas com uma suspensão
celular dos isolados e posteriormente inoculando-os com
M. laxa.Aproximadamente, 5,8% desses possíveis antagonistas mostraram
uma redução da incidência de podridão parda em mais de 50% em relação à
fruta não tratada (dados não mostrados). Ao final de cinco rodadas de
testes, dois antagonistas (L1 e L8) foram selecionados para testes adicionais
devido à sua melhor atividade antifúngica na concentração de 107CFU ml-1. A
linhagem L1 apresentou os maiores níveis de atividade no controle deM.
laxaem pêssegos e nectarinas (P93%), enquanto o isolado L8 também foi
eficaz, mas sua atividade foi menor que a de L1 (P60%) (tabela 1).
3.2. Identificação molecular de patógenos e antagonistas
A análise da sequência das regiões ITS rDNA identificou as três cepas do
patógeno usadas neste estudo comoM. laxa, M. fructicola eM. frutigena.
Além disso, tanto o sequenciamento do domínio D1/D2 quanto as regiões
ITS rDNA reconheceram as duas cepas antagonistas de levedura (L1 e L8)
comoA. pullulans,com uma porcentagem de homologia de sequência de
100% comA. pullulansCBS 584.75T (número de acesso FJ150906) (Figura 1).
Os resultados das observações microscópicas dos conídios fúngicos e da
morfologia das colônias de leveduras foram comparados com as chaves de
identificação deBatra (1991)eBarnett et ai. (2000)respectivamente e foram
complementares à análise molecular. Nossas identificações de levedura
também foram confirmadas pela Coleção de Leveduras Industriais,
Departamento de Biologia Aplicada, Universidade de Perugia, Perugia, Itália
(informação não publicada).
tabela 1
Atividade de biocontrole de dois antagonistas selecionadosana redução da incidência de podridão parda
causada porMonilinia laxaem pêssegos e nectarinas. Os frutos foram armazenados a 20 -C por 5 dias.
Tratamento Pêssegos 'Springcrest' Nectarinas 'Rita Star'
Frutos infectados (%) EIb(%) Frutos infectados (%) EI (%)
Ao controle 80ac – 52a –
L1 4c 95 3.8c 93
L8 32b 60 16.7b 67,9
aOs antagonistas foram aplicados a 107CFU ml-1.
bEI = Índice de Eficácia (Controle - Tratado)/Controle - 100.
cOs dados sobre pêssegos e nectarinas são a média de três e duas tentativas, respectivamente.
Valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes pelo teste LSD (P <0,05).
135
3.3. Ensaios de atividade antagonista in vitro
Os efeitos de ambosA. pullulanscepas aplicadas como WCS, ACS e CF no
crescimento de todos os trêsMoniliniaespécies foram investigadas em testes
em placas de PDA. Após 6 dias de incubação a 25 -C, o diâmetro das colônias
sem antagonista foi de 38, 68 e 57 mm paraM. laxa, M. fructicola, M.
fructigena,respectivamente (mesa 2). Ambos os antagonistas aplicados
como WCS inibiram completamente o crescimento deM. laxae
M.frutigena,porém L1 e L8 WCS reduzidoM. fructicoladiâmetro da colônia
em 63,2% e 36,8%, respectivamente. Além disso, o CF de ambos os
antagonistas inibiu significativamente o crescimento deM.frutigena em
relação ao controle, reduzindo o crescimento em 59,6% para L1 e 57,9% para
L8.
3.4. Atividade antifúngica de L1 e L8 contra M. laxa, M. fructicola e
M.frutigena
As atividades de L1 e L8 foram testadas em nectarinas 'Star Red Gold' a
20 -C. Inoculação artificial de frutas comM. laxa, M. fructicolaeM.frutigena (
103conídios ml-1) resultaram em 85%, 70% e 100% de incidência de infecção,
respectivamente, após 5 dias de incubação (Figura 2). As células lavadas dos
antagonistas foram eficazes contra todos os trêsMoniliniaespécie, inibindo
completamenteM. laxa eM. fructicolae reduzindoM.frutigenaem 70% (L1) e
90% (L8). As suspensões de células autoclavadas e os filtrados de cultura de
ambos os antagonistas foram ineficazes contra a podridão parda, uma vez
que os frutos tratados apresentaram uma incidência da doença não
significativamente diferente do controle. Em frutos tratados com L8 ACS e CF
e inoculados com
M. fructicola,a incidência de frutos infectados foi significativamente maior do
que o controle.
Em um segundo experimento, as nectarinas 'Star Red Gold' foram
armazenadas a 0 -C por 21 dias, seguidas de incubação por 7 dias a 20 -C. A baixa
temperatura influenciou a podridão parda, uma vez que todos os patógenos
permaneceram quiescentes e nenhum sintoma da doença foi observado nos
frutos após a remoção após 3 semanas de armazenamento. Quando as nectarinas
foram movidas para 20 -C,M. laxa, M. fructicolaeM.frutigenaretomaram o
crescimento e apodreceram os frutos controle em 65%, 53% e 49%,
respectivamente, após 7 dias nesta temperatura (Tabela 3). Ambas as cepas
inibiram completamenteM. laxaeM. fructicola,enquantoM.frutigenaas infecções
foram reduzidas em 89,8% e 91,2% em L1 e L8, respectivamente.
3.5. Efeito da concentração do antagonista no controle de M. laxa, M.
fructicola e M. fructigena
Três concentrações de células antagonistas (108, 107e 106CFU ml-1) foram
testados contra os trêsMoniliniaespécies. Ambos os antagonistas
proporcionaram o maior controle de patógenos (0% de frutos infectados
após 5 dias a 20 -C) na maior concentração (108CFU ml-1) (Fig. 3). Quando as
concentrações de L1 foram reduzidas em uma unidade logarítmica (107CFU
ml-1), sua eficácia foi reduzida contraM. laxae
M.frutigenade 100% para 84,6% e 64,3%, respectivamente. No entanto,
diferenças estatísticas foram observadas com relação à redução da
doença obtida na concentração mais alta (108CFU ml-1). Enquanto,
frutas tratadas com L1 em 107CFU ml-1e inoculado comM. fructicola
foram significativamente mais infectados do que os frutos tratados
com L1 108CFU ml-1e inoculados com o mesmo patógeno. A
concentração média de L8 (107CFU ml-1) foi ineficaz para o controle de
M. fructicolaeM.frutigena,não mostrando diferenças significativas entre
os frutos tratados e os controles inoculados. Tratamento de nectarinas
com a cepa L8 (107CFU ml-1) inoculado comM. laxareduziu
significativamente as infecções de podridão parda em relação ao
controle inoculado (36% contra 76%, respectivamente). As
concentrações mais baixas de ambos os antagonistas (106CFU ml-1) não
foram eficazes contra todos os trêsMonilinia espécies.
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Figura 1.Comparação de sequências de nucleotídeos do espaçador transcrito interno ITS 1 e 2 região deAureobasidium pullulanslevedura (cepas L1 e L8) com a sequência deA. pullulans
CBS 584.75T, número de acesso FJ150906, identificação na pesquisa BLASTN. O alinhamento foi realizado no programa ClustalX.
 M. Mari et al. / Controle Biológico 60 (2012) 132–140 137

mesa 2
Efeito de L1 e L8Aureobasidium pullulanstensões no crescimento deMoniliniaspp. em placas PDA. O diâmetro da colônia foi medido após 6 dias de incubação a 25 -C. Cada valor é a
média de cinco placas (réplicas) ± erros padrão. Na mesma coluna, os dados seguidos de asterisco são significativamente diferentes do controle pelo teste LSD (P <0,05).

Tratamentos Monilinia laxa Monilinia fructicola Monilinia fructigena

L1 WCS (108CFU ml-1) L1 0±0 27 ±7,13 0±0

ACS 36 ± 1,8 66 ± 0,75 56 ± 0,25
L1 CF 36 ± 1,05 68 ± 0,95 23 ± 0,63
L8 WCS (108CFU ml-1) L8 0±0 43 ± 3,55 0±0
ACS 37 ± 0,34 65 ± 0,63 54 ± 0,87
L8 CF 36 ± 2,29 68 ± 0,41 24 ± 0,75
Ao controle 38 ± 1,60 68 ± 0,75 57 ± 1,03

Tabela 3
Efeito do armazenamento a frio naAureobasidium pullulansCepas L1 e L8aatividade contra
Moniliniapodridão em nectarinas 'Star Red Gold'. Frutos infectados (%) após 21 d a 0 -Cb+ 7 d a
20-C.

patógeno Ao controle L1 L8
Monilinia laxa 65 ± 5ax 0b 0b
Monilinia fructicola 53 ± 19,2a 0b 0b
Monilinia fructigena 49 ± 12,9a 5 ± 5b 4,3 ± 6,2b

aOs antagonistas foram aplicados a 108CFU ml-1.

bAo serem retirados do armazenamento refrigerado, nenhum fruto apresentou sintomas de podridão parda.

xOs dados são a média de quatro réplicas de 20 frutas cada. Dentro da mesma linha, os

valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes pelo teste LSD (P6
0,05).

No entanto, não foram observadas diferenças significativas entre as

duas populações de antagonistas. Nos frutos armazenados a 0 -C, as
populações de L1 e L8 permaneceram as mesmas durante os primeiros
7 dias após o tratamento, depois aumentaram até o 21º dia de
armazenamento em temperatura refrigerada, atingindo 1,7 - 106CFU
ml-1e 2 - 106CFU ml-1respectivamente. Quando os frutos foram movidos
para 20 -C, as populações diminuíram lentamente para 1,5 - 106CFU ml
-1para L1 e 1.3 - 106CFU ml-1para L8. Não houve diferença significativa

entre L1 e L8A. pullulanscepas neste experimento.

4. Discussão

Duas cepas, L1 e L8, deA. pullulansisolados da superfície de pêssegos

Figura 2.Efeito de duas cepas deAureobasidium pullulansno controle de (1)Monilinia laxa,
(2)Monilinia fructicola, (3)Monilinia fructigenaem nectarinas 'Star Red Gold' feridas. Os
dados foram registrados após 5 dias de incubação a 20 -C. As suspensões de células
autoclavadas continham 1 - 108CFU ml-1(ACS); suspensões de células lavadas continham 1
- 108CFU ml-1(WCS) e filtrados de cultura (CF). Os controles foram tratados com água
destilada estéril. Os dados são as médias de quatro réplicas de cinco frutos cada, 20
frutos por tratamento. Para cada patógeno, os valores seguidos por letras diferentes
(maiúscula – L1; minúscula – L8) foram significativamente diferentes de acordo com o
teste LSD,P60,05.
3.6. Dinâmica populacional das leveduras L1 e L8
As populações deA. pullulanscepas L1 e L8 nas feridas de nectarinas
armazenadas a 20 -C dobrou durante os primeiros 3 dias (Fig. 4),
chegando a 3,7 - 106CFU ml-1e 2,7 - 106CFU ml-1para L1 e L8,
respectivamente. A concentração de L8 nas feridas atingiu o pico (4,4 -
106CFU ml-1) ao final do ensaio, 7 dias após a aplicação, enquanto a
população L1 permaneceu constante (3,7 - 106CFU ml-1).
'Redhaven', foram identificados neste estudo por ferramentas moleculares e
testados quanto à sua atividade contra trêsMoniliniaspp. O sequenciamento
do domínio D1/D2 da subunidade grande (26S) do DNA ribossômico foi
previamente utilizado para identificarAureobasidium (Sasahara e Izumori,
2005) e os resultados foram confirmados pelo sequenciamento das regiões
ribossomais ITS1 e ITS2.
Vários isolados e cepas deAureobasidiumsp. têm sido relatados
como eficazes contra uma série de doenças pós-colheita em frutas,
como cerejas.Schena e outros, 2003), morangos (Lima e outros, 1997) e
maçãs (Lebinger e outros, 1997), mas poucos estudos relataram a
atividade deAureobasidiumsp. contraM. laxa em pêssegos (Zhang e
outros, 2010) eM. fructicolaem nectarinas (Janisiewicz e outros, 2010).
Até onde sabemos, este é o primeiro estudo demonstrando o
biocontrole deM. laxa, M. fructicolae
M.frutigenanos mesmos experimentos pelos mesmos antagonistas e
não há relatos sobre o controle deM.frutigenaem pêssegos e
nectarinas por antagonistas microbianos.
O patógeno mais importante responsável pela podridão parda de frutas
de caroço na Europa éM. laxa,seguido pelaM. frutigena.Larena et ai. (2005)
mostraram que em frutas de caroço afetadas pela podridão parda, 10-15%
da infecção foi causada porM.frutigena,e em nosso trabalho de
monitoramento em populações italianas deMoniliniaspp., 7% das podridões
foram causadas porM.frutigenade uma amostra de 125 frutas com podridão
marrom (dados não relatados). DesdeM. fructicolaagora está presente em
138 M. Mari et al. / Controle Biológico 60 (2012) 132–140
Figura 3.Efeito de diferentes concentrações de duas cepas (t L1 e L8) de Aureobasidium
pullulansno controle de (1)Monilinia laxa, (2)Monilinia fructicola,
(3)Monilinia fructigenaem nectarinas 'Star Red Gold' feridas. Os dados foram registrados
após cinco dias de incubação a 20 -C. (A) 108; (B) 107; (C) 106CFU ml-1suspensão celular. Os
controles foram tratados com água destilada estéril. Os dados são as médias de cinco
réplicas de cinco frutos cada, 25 frutos por tratamento. Para cada patógeno, os valores
seguidos por letras diferentes (maiúscula – L1; minúscula – L8) foram significativamente
diferentes de acordo com o teste LSD,P60,05.
Pomares europeus de frutas de caroço juntamente comM. laxaeM.frutigena,
testar a atividade antagonista contra todos os três patógenos pode ser uma
necessidade para desenvolver novos biofungicidas. A triagem de BCAs pode
ser realizada porem vitroena Vivoensaios (Janisiewicz e Korsten, 2002),
emborana Vivoensaios são preferíveis, pois geralmente são mais confiáveis
e transferíveis para condições de campo e pós-colheita. Além disso, a
eficácia do antagonistaem vitroe na Vivonem sempre podem ser
comparados se o mecanismo de ação predominante dos BCAs for a
competição por nutrientes e espaço, comoem vitro os testes não refletem o
ambiente nutricional no local da ferida do hospedeiro. Em nossos
experimentos, microrganismos semelhantes a leveduras isolados da
carposfera de pêssegos foram testados diretamente em pêssegos e
nectarinas e apenas uma pequena porcentagem de antagonistas provou ser
eficaz contra a podridão parda (dados não mostrados). Oem vitroensaios
foram feitos para avaliar a interação direta entre antagonistas e patógenos
sem hospedeiros (pêssego). O teste não leva em consideração a fruta e seu
ambiente nutricional, embora o teste seja rápido e simples, deve ser
considerado preliminar e útil apenas para confirmar a atividade antagonista
do BCA observadana Vivo.Oem vitroresultados foram ligeiramente
comparáveis com os obtidosna Vivo;de fato, as células lavadas mostraram
uma significativa
Figura 4.Dinâmica populacional de duas cepas (L1 e L8) deAureobasidium pullulansem
feridas de nectarinas 'Star Red Gold' incubadas a 20 -C por 7 dias (A) e por 21 dias a 2 -C +
7 dias a 20 -C (B). Cada ponto representa a média do número de unidades formadoras de
colônias (CFUs) de três frutas replicadas + barras de erro, cada uma semeada em
triplicata em cada tempo de amostragem.
controle de todosMoniliniaspp. em relação ao controle, embora a
concentração de patógenos tenha sido maior (105conídios ml-1) do que o
utilizado para ona Vivotentativas (103conídios ml-1), além disso, as células
autoclavadas não apresentaram efeitos inibitórios sobre patógenos. Os
filtrados de cultura de ambos os antagonistas reduziram significativamente
apenas o diâmetro da colônia deM. frutigena.Esses resultados parecem
bastante diferentes dos obtidosna Vivotestes, uma vez que as células
lavadas de L1 e L8Aureobasidiumcepas completamente controladasM. laxae
M. fructicolaem pêssegos após 5 dias a 20 -C e nenhuma redução da
podridão parda foi observada em frutas tratadas com ambos os filtrados de
cultura dos antagonistas. Nossos dados sugerem que os dois antagonistas,
cultivados em PDA, podem produzir metabólitos tóxicos paraM.frutigena
diferente do produzidona Vivo;resultados semelhantes também foram
obtidos porSpadaro et ai. (2002)com quatro isolados da leveduraM.
pulcherrimacontra patógenos pós-colheita em maçãs. Investigações
adicionais são necessárias para entender esse comportamento diferente,
embora nossos dados confirmem a discrepância entreem vitroena Vivo
testes relatados por outros autores (Janisiewicz, 1987; Dal Bello e outros,
2008) sugerindo que oem vitrotestes são geralmente realizados para uma
avaliação preliminar do modo de ação dos BCAs. A perda de atividade pelo
filtrado da cultura está de acordo com os resultados obtidos com
AureobasidiumporZhang et ai. (2010), levando à exclusão da produção de
metabólitos tóxicos como modo de ação do antagonista. No entanto, um
depsipeptídeo cíclico antifúngico (aureobasidina A) produzido porA.
pullulansfoi encontrado para inibir a germinação de esporos, alongamento
do tubo germinativo e crescimento de hifas deM. fructicolaem umem vitro
estudar (Xiaoping e outros, 2007), embora os autores tenham testado o
produto puro e as condições experimentais aplicadas não sejam
comparáveis com as do presente trabalho. Estudos anteriores sobre os
modos de ação mostraram queAureobasidiumspp. agem contra patógenos
fúngicos através da competição por nutrientes (Bencheqroun et al.,
 M. Mari et al. / Controle Biológico 60 (2012) 132–140
2007) e indução de resistência (Ippolito et al., 2000), enquanto nenhuma
interação física direta (parasitismo) foi observada entre as células
antagonistas e as hifas do patógeno (Castoria et al., 2001). Nossos dados
preliminares sobre a atividade antifúngica deA. pullulanscepas L1 e L8
excluem a produção de antibióticos nona Vivocondições testadas, embora
seu modo de ação ainda não tenha sido investigado em profundidade. A
produção de metabólitos tóxicos por antagonistas pode ter um impacto
ambiental negativo e, por esse motivo, as leveduras ou microrganismos
semelhantes a leveduras são preferidos às bactérias, comoBacilo sp. e
Pseudomonassp. (Sharma e outros, 2009). A atividade de biocontrole do
testadoA. pullulanscepas contraMoniliniaspp. dependia das concentrações
celulares. Em todos os casos, a maior concentração do antagonista (108CFU
ml-1) proporcionou o melhor controle de todos os patógenos testados,
embora nenhuma diferença significativa tenha sido encontrada no controle
da doença em frutas tratadas com L1 em uma concentração menor (107CFU
ml-1) e inoculado comM. laxaeM. frutigena.Nossos resultados estão de
acordo com outros estudos que consideraram 107–108células ml-1as
concentrações de antagonista mais adequadas para obter uma alta redução
de decaimento (McLaughlin et al., 1990; El-Ghaouth et al., 2004) e
concentrações mais altas raramente são necessárias.M.frutigenafoi
controlado por L1 e L8 menos que os outros doisMoniliniaespécies; sua taxa
de inibição foi, de fato, 70% e 90% para L1 e L8, respectivamente. Uma
explicação para a menor atividade antagonista contraM.frutigenapode estar
relacionado ao tamanho dos conídios desse patógeno, maior (média 21 - 13
eum) do que conídios deM. laxaeM. fructicola (média 15 - 9eum) (Mordue,
1979). Por esta razão,M.frutigenaos conídios poderiam competir de forma
mais efetiva pelo espaço em direção a L1 e L8A. pullulansDeformação. No
entanto, o grande tamanho deM.frutigenaconidia sugere também um maior
teor de reservas de nutrientes que podem desempenhar um papel
importante na competição por nutrientes. No entanto, ambos os
antagonistas são eficazes contraMoniliniaspp., L1 parece mais ativo que L8,
quando aplicado em concentrações menores que 108CFU ml-1
(Fig. 3). No futuro, o uso de misturas de antagonistas pode ser uma forma
atrativa de aumentar a gama de patógenos controlados, explorando um
eventual efeito aditivo. Conforme relatado anteriormente por Weiss e
outros. (2006), os ingredientes ativos do Blossom Protect FBMT
foram duas cepas deA. pullulans (CF10 e CF40) isolados da superfície da
maçã no sudoeste da Alemanha. Além disso, como L1 e L8 pertencem à
mesma espécie, precisarão de apenas um registro, economizando
tempo e dinheiro.
Atualmente, poucos dados estão disponíveis sobre a interação
antagonista-patógeno em termos de competição por nutrientes limitantes
essenciais para a patogênese.Sharma e outros, 2009). No entanto, parece
que uma rápida colonização das feridas da fruta pelo antagonista é crítica
para o controle da cárie. Estudos anteriores indicaram que as populações de
leveduras, comoRhodotorula glutinis (Fresen.) FC em laranja aumentou
aproximadamente 10.000 vezes durante os primeiros 3 dias a 20 -C e 40.000
vezes após 7 dias 4 -C (Zheng e outros, 2005). Um aumento acentuado deM.
pulcherrimaeHanseniaspora uvarum (Niehaus) também foi observada em
maçãs (Piano e outros, 1997) e uvas (Liu e outros, 2010) respectivamente. Ao
contrário, no presente trabalho,A. pullulansa população aumentou
fracamente em cavidades de frutas tanto a 20 -C quanto a 0 -C, e a taxa de
crescimento de L1 e L8 foi comparável à deA. pullulansisolado L47,
observado em feridas de maçã porIppolito et ai. (2000). No entanto, em
ambos os estudos os resultados obtidos mostraram um bom controle (mais
de 70%) da podridão dos frutos, sugerindo queA. pullulanspode se adaptar
bem ao ambiente da ferida e inibir a intrusão de patógenos.
Aureobasidiumsp. faz parte da flora microbiana comumente residente
em frutas de caroço e pomóide crescendo em regiões temperadas.De Hoog
e Yurlova, 1994). Seu uso como agente de controle biológico de doenças
pós-colheita de frutas só pode ser promissor se for combinado com práticas
pós-colheita de rotina. Neste estudo, foi demonstrada a adequação das
linhagens L1 e L8 a condições críticas de pós-colheita, como baixa
temperatura, uma vez que os antagonistas sobreviveram em
139
os frutos ferem por longos períodos de tempo a 0 -C sem apresentar
redução de população; de fato, um aumento moderado de células viáveis
foi observado após 21 dias a 0 -C. A eficácia das cepas L1 e L8 no controle do
apodrecimento também foi testada em ensaio simulando condições
comerciais de frutas (armazenamento refrigerado seguido de simulação de
varejo à temperatura ambiente) em nectarinas 'Star Red Gold' armazenadas
a 0 -C por 21 dias mais 9 dias de vida útil a 20 -C. Em geral, o
armazenamento em baixa temperatura retarda o crescimento de fungos,
enquanto os patógenos retomam o crescimento e se desenvolvem
rapidamente em lesões de decomposição quando as frutas são movidas da
sala refrigerada para as áreas de manuseio e comercialização. 'Star Red
Gold' é uma cultivar adequada para longos períodos de armazenamento e
pode ser armazenada por 3 semanas ou mais a 0 -C sem efeitos prejudiciais
notáveis nos parâmetros de qualidade.M. laxa, M. fructicolaeM.frutigenano
final do armazenamento refrigerado (21 dias a 0 -C), enquanto uma alta
porcentagem de infecções (65%, 53% e 49%, respectivamente) se
desenvolveu nessas frutas mais seguras 7 dias a 20 -C. Ambas as cepas
foram muito eficazes no controle da podridão parda, pois sua aplicação
inibiu completamenteM. laxaeM. fructicolainfecções após armazenamento a
frio e prazo de validade e marcadamente reduzidaM.frutigenaapodrece
(>90%). Estas descobertas tornam viável o controle biológico da podridão
parda sob condições comerciais após uma formulação apropriada dos
antagonistas testados.
Em resumo, o presente estudo identificou pela primeira vez dois
antagonistas (L1 e L8A. pullulanscepas) como ingredientes ativos para o
desenvolvimento de biofungicidas para aplicação pós-colheita contra três
Moniliniaespécies, todas responsáveis por grandes perdas econômicas em
frutos de caroço.
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