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Artigo de Pesquisa
J Mol Microbiol Biotechnol 2011;20:43–52
DOI: 10.1159/000323501
Funções dos Lipopeptídeos Bacilomicina D e
Fengicina no Antagonismo deBacillus
amyloliquefaciensC06 paraMonilinia fructicola
Jun Liua-cTing ZhoubDan EleaXiu-zhen LibHuijun WuaWenzhe Liub
Xuewen Gaoa
aDepartamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal, Universidade Agrícola de Nanjing, Laboratório Principal de
Monitoramento e Manejo de Doenças de Culturas e Insetos Pragas, Ministério da Agricultura, Nanjing, PR China;
bGuelph Food Research Centre, Agricultura e Agroalimentar Canadá, Guelph, Ontário, Canadá;cEscola de Ciências da
Vida e Tecnologia, China Pharmaceutical University, Nanjing, PR China
Palavras-chave
Monilinia fructicola-Bacillus amyloliquefaciensC06 -
Bacilomicina D - Fengicina - Crescimento micelial -
Germinação de conídios
Abstrato
Em estudos anteriores,Bacillus amyloliquefaciensO C06 provou ser
eficaz no controle da podridão marrom de frutas de caroço causada
porMonilinia fructicola.Quando testado in vitro, o filtrado livre de
células deB. amyloliquefaciensC06 inibiu significativamente o
crescimento micelial e a germinação de conídios do patógeno fúngico.
Este estudo teve como objetivo determinar o papel do(s) composto(s)
antifúngico(s) no filtrado livre de células deB. amyloliquefaciens C06
por uma abordagem que combina um método de hibridização
subtrativa (SSH) de supressão baseada em DNA com análise MALDI-
TOF-MS. Foi demonstrado queB. amyloliquefaciensC06 abrigava dois
genes,bmyCefenD, envolvidos na biossíntese de bacilomicina D e
fengycin, dois lipopeptídeos pertencentes à família iturina e fengycin,
respectivamente. Para determinar os papéis da bacilomicina D e da
fengycin deB. amyloliquefaciensC06 na supressãoM. fructicola, os
mutantes de
B. amyloliquefaciensC06 deficiente na produção de bacilomie-
Este trabalho é resultado da colaboração de dois laboratórios e, no processo de trabalho
conjunto, nossos dois laboratórios contribuíram igualmente.
© 2011 S. Karger AG, Basel 1464–
1801/11/0201–0043$38.00/0
Fax +41 61 306 12 34 E-
Mail karger@karger.ch Acessível online em:
www.karger.com www.karger.com/mmb
Publicado online: 18 de fevereiro de 2011
cin D, fengycin ou ambos foram construídos e avaliados in vitro
juntamente com o tipo selvagemB. amyloliquefaciensC06. Os
resultados indicaram que bacilomicina D e fengycin contribuíram
conjuntamente para a inibição da germinação de conídios de
M. fructicola,e a fengycin desempenhou um papel importante na supressão
do crescimento micelial do patógeno fúngico.
Copyright © 2011 S. Karger AG, Basel
Introdução
A podridão parda causada porMonilinia fructicola(Wint.) o mel
é uma das doenças mais destrutivas de frutas de caroço, incluindo
damascos, cerejas e pêssegos [Biggs e Northover, 1985; Emery et
al., 2000; Hong, 1997; Landgraf e Zehr, 1982; Zhou e Sholberg,
2002; Zhu et al., 2005]. Embora a doença possa afetar flores e
galhos, ela é altamente destrutiva para as frutas, e não é incomum
que metade das frutas aparentemente saudáveis se deteriore
devido à podridão parda na primeira semana após a colheita em
condições de armazenamento frias e úmidas [Smilanick et al. ,
1993]. Uma pesquisa realizada no sul de Ontário, Canadá, indicou
que 20 a 80% dos pêssegos comercialmente maduros colhidos em
pomares locais desenvolveram podridão parda após 4 a 5 dias de
incubação em temperatura ambiente [Smilanick et al., 1993].
Tanto a indústria quanto os consumidores exigem urgentemente
estratégias eficazes para prolongar a vida útil dos pêssegos.
UTFPR Univ. Tecnológica Federal do Paraná
Xuewen Gao, Departamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal
200.130.19.176 - 4/9/2023 2:54:38 AM
da Universidade Agrícola de Nanjing, Laboratório Principal de Monitoramento e
Manejo de Doenças de Culturas e Insetos Pragas, Ministério da Agricultura
Nanjing 210095 (PR China)
Tel./Fax +86 25 8439 5268, E-Mail gaoxw@njau.edu.cn
Baixado por:
 O fungo produz inóculos no fruto pós-colheita primário de
micélio nos frutos infectados latentes que esporulam sob
condições favoráveis [Northover e Cerkauskas, 1994; Ogawa
et al., 1975; Wittig et al., 1997]. A germinação de conídios
representa o primeiro passo para desencadear um ciclo de
vida assexuado e espalhar a doença. Após a germinação, o
micélio deM. fructicolase espalhará rapidamente e causará
podridão marrom em frutas de caroço; o inóculo secundário
pode surgir dos frutos infectados nos quais o teor de umidade
é suficiente para a esporulação [Byrde e Willetts, 1977]. A
inibição da germinação dos esporos e o crescimento micelial
seriam dois mecanismos supressivos críticos envolvidos no
controle da doença da podridão parda e na redução das
perdas.
Anteriormente,Bacillus amyloliquefaciensC06, uma única colônia
isolada de um starter de queijo mesófilo, controlou significativamente
a podridão parda causada porM. fructicolaem pêssegos e maçãs, e
estendeu a vida útil dos pêssegos para 7 dias quando aplicado com
células bacterianas ou filtrado livre de células [Zhou et al., 2008]. O
filtrado livre de células do isolado C06 mostrou forte atividade de
biocontrole em pêssegos naturalmente infectados, indicando que as
substâncias extracelulares produzidas pelo isolado bacteriano podem
desempenhar um papel importante na redução da podridão dos
frutos. Quando testado in vitro, o filtrado inibiu completamente a
germinação de conídios de
M. fructicola, sugerindo que pode conter composto(s)
antifúngico(s). Os objetivos deste estudo foram caracterizar
o(s) composto(s) antifúngico(s) produzido(s) porB.
amyloliquefaciensC06 com uma abordagem que combina um
método de hibridização subtrativa de supressão baseada em
DNA (SSH) com análise MALDI-TOF e para determinar os
papéis dos compostos antifúngicos no controle da podridão
marrom de frutas de caroço. Dois lipopeptídeos, fengicina e
bacilomicina D, foram produzidos pela cepa C06. A fengicina
foi o principal composto antifúngico responsável por inibir o
crescimento micelial deM. fructicola, enquanto fengycin e
bacilomicina D contribuem conjuntamente para a inibição da
germinação de conídios.
Resultados
Supressão Hibridização Subtrativa
Uma triagem rápida de genes sem homologia com
Bacillus subtilis168 foi executado por SSH. DNAs
cromossômicos deB. amyloliquefaciensC06 (testador) eB.
subtilis168 (driver) foram digeridos com endonuclease de
restriçãoRasseparadamente e os fragmentos de DNA
obtidos por digestão foram então subtraídos. A maioria
dos clones obtidos após a subtração não hibridou
44 J Mol Microbiol Biotechnol 2011;20:43–52
com DNA cromossômico deB. subtilis168 na subsequente análise
Southern blot. Um total de 43 clones foi selecionado para análise
de sequência e sua função putativa foi deduzida pela análise da
ferramenta de busca de alinhamento local básico (BLAST) (para
obter detalhes, consulte o material suplementar on-line 1,
www.karger.com/doi/10.1159/000323501).
A análise das sequências revelou que oito dos 43 clones
SSH, designados A18, A25, A121, B84, CB40, D81, D84 e
F114, eram semelhantes a genes envolvidos na síntese de
peptídeos não ribossômicos, lipopeptídeos cíclicos e
policetídeos. Três fragmentos SSH, CB40, A18 e D81, foram
encontrados para exibir o maior grau de homologia,
respectivamente, parabmyC[Moyne e outros, 2004],fenDe
fenE[Steller et al., 1999], os genes como parte de operons
responsáveis pela síntese de bacilomicina D e fengycin de
B. amyloliquefaciensFZB42 [Chen et al., 2007]. Outros três
clones, A25, A121 e F114, foram atribuídos a três grupos de
genes diferentes que codificam os policetídeos difficidina e
bacilo. As sequências dos dois clones restantes, D84 e B84,
exibiram semelhança com genes que codificam peptídeo
sintetase não ribossomal emB. amyloliquefaciensFZB42.
Identificação de MS dos Lipopeptídeos de
B. amyloliquefaciensC06
O espectro de massa deB. amyloliquefaciensO C06 obtido
por este método apresentou dois grupos de picos de massa,
um variando de m/z = 1.032 a 1.112 e o segundo de m/z =
1.449,8 e 1.557,8 (fig. 1a, b). Os picos de massa em m/z =
1.032, 1.046 e 1.060 representam as formas protonadas de
C14-16 bacilomicina D, e aqueles em m/z = 1.068, 1.082, 1.096
e 1.112 correspondem a C15-17 adutos de bacilomicina D com
íons de metais alcalinos , respectivamente; os picos de massa
entre m/z = 1.449 e 1.558 indicaramB. amyloliquefaciensC06
também é produtor de fengycin [Vater et al., 2002, 2003].
Figura 1.Análise MALDI-TOF-MS de lipopeptídeos deB.
amyloliquefaciensC06 e as cepas mutantes.a-hEspectros de massa
de extratos preparados a partir de filtrados livres de células de
C06 de tipo selvagem ou seus mutantes cultivados em meio
mínimo: (a) detecção de picos de massa de bacilomicina D em
extratos de tipo selvagem C06; (b) detecção de picos de massa de
fengycin em extratos de tipo selvagem C06; (c) C06-sfpera
deficiente na produção de bacilomicina D; (d) C06-sfpera deficiente
na produção de fengycin; (e) C06-bmyCera deficiente na produção
de bacilomicina D; (f) detecção de picos de massa de fengycin em
extratos de C06-bmyC; (g) detecção de picos de massa de
bacilomicina D em extratos de C06-fenD, e (h) C06-fenDera
deficiente na produção de fengycin.
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Liu/Zhou/He/Li/Wu/Liu/Gao
200.130.19.176 - 4/9/2023 2:54:38 AM
Baixado por:
 ×108 ×108
1.082 1.502
6 1.486
1.068
1.096 1,50
5
1.25
1.517
4
Intensidade

Intensidade
1,00 1.472
3 1.112

0,50
2 1.532
1.046 1.464
1 0,25
1.032
0 0
a 1.020 1.040 1.060 1.080 1.100 1.120 1.140 m/zb 1.440 1.460 1.480 1.500 1.520 1.540 1.560 m/z

×108 ×108
5
2.5

4
2.0
Intensidade

Intensidade
3 1,5

2 1,0

1 0,5

0 0
c1.000 1.020 1.040 1.060 1.080 1.110 1.120 m/z d 1.400 1.420 1.440 1.460 1.480 1.500 1.520 1.540 1.560 m/z

×108 ×108 1.502

1.486

3 1.25

1,00
1.516
Intensidade

Intensidade

2 1.472
0,75

1.531
0,50
1
0,25 1.592

0 0
e 1.020 1.040 1.060 1.080 1.110 1.120 m/z f 1.350 1.400 1.450 1.500 1.550 1.600 1.650 1.700 m/z

×108 ×108
1.082
6
1.068 1.096 8
5

4 6
Intensidade

Intensidade

3 1.112
4
2
1.046
1.060 2
1
1.032
0 0
g1.000 1.020 1.040 1.060 1.080 1.100 1.120 m/z h1.350 1.400 1.450 1.500 1.550 1.600 1.650 1.700 m/z
1
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Lipopeptídeos antifúngicos,B. J Mol Microbiol Biotechnol 2011;20:43–52 45

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amyloliquefaciensC06 eM. fructicola

Baixado por:
 a b
Figura 2.Atividade biológica do filtrado livre de células extraído de
C06 e dos mutantes prejudicados na biossíntese de bacilomicina D
(C06-bmyC), fengicina (C06-fenD), ou bacilomicina D e fengycin
(C06-sfp) na inibição do crescimento micelial deM. fructicola. Um
volume de 30 l de filtrado livre de células de C06 ou a respectiva
cepa mutante cultivada em meio mínimo foi despejado sobre
Interrupção desfp,bmyCefenDOs genes produziram um
fenótipo deficiente em lipopeptídeos
Para determinar os papéis dos lipopeptídeos deB.
amyloliquefaciensC06 no controle biológico de patógeno
pós-colheita de frutasM. fructicola,sfp,bmyCefenDgenes
foram interrompidos por recombinação cruzada única,
resultando em três mutantes C06-bmyC, C06-fenDe C06-
sfp. A análise das cepas mutantes por MALDI-TOF-MS
confirmou que a cepa C06-bmyCera deficiente na
produção de bacilomicina D (fig. 1e) e que a cepa C06-fenD
era deficiente na produção de fengycin (fig. 1h) e que C06-
sfpfalhou em produzir ambos os lipopeptídeos (fig. 1c, d).
Com base nesses resultados, confirmamos que os
fragmentos gênicos obtidos do DNA SSH são responsáveis
pela biossíntese dos respectivos lipopeptídeos emB.
amyloliquefaciensC06.
Atividade biológica do tipo selvagemB. amyloliquefaciens C06
B. amyloliquefaciensO C06 é capaz de inibir o crescimento de
fungo patogênico de plantasM. fructicola.In vitro, o filtrado livre
de células de C06 inibiu o crescimento micelial e a germinação de
conídios deM. fructicola(Figo. 2, 3). em uma batata
46 J Mol Microbiol Biotechnol 2011;20:43–52
o disco de papel colocado nas placas de ágar PDA com crescimento
ativoM. fructicola. As placas foram incubadas durante 4 dias a 25°C.
a1 = Água destilada; 2 = filtrado livre de células de C06; 3 = filtrado livre de
células de C06-sfp; 4 = 30 -l de meio mínimo.b1 = Filtrado livre de células de
C06; 2 = filtrado livre de células de C06-bmyC; 3 = filtrado livre de células de
C06-fenD; 4 = meio mínimo.
placa de ágar dextrose (PDA), o filtrado livre de células de C06
mostrou um efeito significativo no crescimento micelial deM.
fructicolae a distância média entre as bordas da placa de Petri
e o micélio fúngico foi de 3 cm, enquanto a água e o meio não
mostraram efeito no crescimento micelial deM. fructicola. A
observação microscópica mostrou que o crescimento
vegetativo deM. fructicolamicélio do ponto de contato com o
filtrado livre de células deB. amyloliquefaciensO C06 foi muito
inibido e a maioria dos micélios foi forçada a começar a
produzir conídios (fig. 4).
O bioensaio in vitro foi conduzido para avaliar os efeitos do
filtrado livre de células C06 na inibição da germinação de
conídios deM. fructicola. O filtrado livre de células de C06,
considerado como a concentração de 100%, foi diluído 2, 4 e 8
vezes com meio líquido até as concentrações finais de 50, 25 e
12,5% separadamente. Como mostrado nas figuras 3 e 4, os
conídios deM. fructicolagerminaram profusamente em discos
de água não tratada (100%) e a taxa de germinação deM.
fructicolafoi significativamente reduzido para 17% em uma
concentração final do filtrado livre de células em 12,5% e
nenhum fenômeno de germinação foi observado desde que a
concentração final do filtrado livre de células fosse superior a
25%.
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Liu/Zhou/He/Li/Wu/Liu/Gao
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Baixado por:
 100
80
60
Inibição (%)
40
20
0 0
0 12.5 25,0 37,5 50,0
a Concentração final (%)
Figura 3.Efeitos do filtrado livre de células retirado de C06 e os
mutantes prejudicados na biossíntese de bacilomicina D (C06-
bmyC), fengicina (C06-fenD), ou bacilomicina D e fengycin
(C06-sfp) na germinação de conídios deM. fructicola.aCo-
Atividade Biológica dos Mutantes de
B. amyloliquefaciensC06
O filtrado livre de células do mutante C06-sfpdeficiente na
produção de todos os tipos de lipopeptídeos (fig. 1) nem
suprimiu oM. fructicolacrescimento em ágar BDA (fig. 2) nem
inibiu a germinação deM. fructicolaconídios (fig. 3), indicando
que os principais compostos antifúngicos contra
M. fructicolano filtrado livre de células deB.
amyloliquefaciensC06 eram lipopeptídeos.
Os filtrados livres de células dos mutantes deficientes na
produção de bacilomicina D (C06-bmyC) e fengycin (C06-fenD)
diferiram em sua capacidade de biocontrole. Embora a cepa
produtora de fengycin C06-bmyCcrescimento micelial
suprimido deM. fructicolade maneira semelhante à cepa do
tipo selvagem (fig. 4), C06-fenD foi muito menos eficiente na
inibição do crescimento fúngico, sugerindo que a fengycin
contribuiu para a atividade de inibição do crescimento micelial
deB. amyloliquefaciensC06 (fig. 2).
No bioensaio in vitro avaliando os filtrados livres de células de
mutantes C06 quanto às suas capacidades de inibiçãoM. fructicola
germinação de conídios, diferenças significativas foram
observadas entre os discos de ágar água tratados com os filtrados
livres de células de C06-fenD, C06-bmyCe C06-sfpapós 12h de
incubação. Como mostrado na figura 3,M. fructicolaos conídios
germinaram profusamente no tratamento com o filtrado livre de
células de C06-sfp(97%) na concentração final de filtrado livre de
células de 50%; os filtrados livres de células
Lipopeptídeos antifúngicos,B.
amyloliquefaciensC06 eM. fructicola
100
80
60
Inibição (%)
40
20
Ao controle C06 - sfp - bmyC - fenD
b
nídia deM. fructicolatratados com uma série de concentrações do
filtrado livre de células deB. amyloliquefaciensC06.bConídios deM.
fructicolatratados com o filtrado livre de células de C06 e os mutantes
com uma concentração final de 50%.
de C06-fenDe C06-bmyCreduziu significativamente a taxa
de germinação para 1-2% na concentração final de 50%
(fig. 3).
Discussão
O filtrado sem células deB. amyloliquefaciensO C06 mostrou
forte atividade de biocontrole em pêssegos naturalmente
infectados, enquanto o tratamento apenas com células foi menos
eficaz, indicando que havia substâncias extracelulares produzidas
por bactérias, que efetivamente reduziram a podridão dos frutos
[Zhou et al., 2008]. Quando testado in vitro, o filtrado livre de
células inibiu completamente a germinação de conídios e o
crescimento micelial deM. fructicola, sugerindo que pode conter
composto(s) antifúngico(s).
Neste estudo, uma abordagem não tradicional combinando
um método SSH baseado em DNA com análise MALDI-TOF MS foi
usada para identificar os principais compostos produzidos por
B. amyloliquefaciensC06 envolvido na atividade de
biocontrole contraM. fructicola. Diferenças genéticas entre
B. subtilis168, uma cepa tipo cultivada em laboratório por
décadas [Burkholder e Giles, 1947], eB. amyloliquefaciens
C06 foi detectado por SSH. Aqui, o digerido
B. subtilisO DNA cromossômico 168 empregado como driver
para o experimento SSH foi baseado em dois motivos: (1) 16S
rRNA e análise bio-log indicaram que C06 mostrou alto
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Baixado por:
 Ao controle

C06

C06-sfp

C06-bmyC

Figura 4.Efeitos do filtrado livre de células

retirado de C06 e os mutantes C06-fenD
prejudicados na biossíntese de
bacilomicina D (C06-bmyC), fengicina (C06-
fenD), ou bacilomicina D e fengycin (C06-
sfp) na morfologia do crescimento micelial
e na inibição da germinação de conídios de
M. fructicola. As microfotografias foram Germinação de conídios crescimento de micélio

tiradas com uma câmera digital Leica

DC100DC 350F (barra de escala = 50 -m).
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Baixado por:
semelhança comB. subtilis168 [Zhou et al., 2008] e (2) a
comparação de uma cepa de tipo selvagem com uma cepa
modelo de laboratório deve permitir a identificação de elementos
genéticos adicionais responsáveis pela competência bacteriana
em um ambiente natural, como os genes que direcionam a síntese
de metabólitos secundários [ Koumoutsi et al., 2004]. Dois
fragmentos SSH foram encontrados apresentando alta homologia
com genes envolvidos na síntese do lipopeptídeo bacilomicina D e
fengycina, respectivamente. Análises MALDI-TOF-MS de
lipopeptídeos deB. amyloliquefaciensC06 confirmou que a cepa
C06 é produtora de bacilomicina D e fengycin (fig. 1a, b). A cepa
C06 é naturalmente competente para captação de DNA e
recombinação homóloga, portanto é ideal para abordagens
genéticas para analisar sua capacidade metabólica, por exemplo,
pela construção direcionada de mutantes prejudicados na síntese
de lipopeptídeos cíclicos. O fato de que a interrupção de qualquer
bmyCoufenDimpediu a produção de bacilomicina D ou fengycin
(fig. 1e, h) confirmou a previsão funcional dos fragmentos SSH
bmyCefenDque nesta cepa, estes genes estão envolvidos na
biossíntese dos dois lipopeptídeos.
Alguns lipopeptídeos têm sido estudados com mais detalhes,
incluindo a surfactina, fengycinas e várias iturinas. As fengicinas e
a plipastatina intimamente relacionada são lipodecapeptídeos
cíclicos contendo um ácido graxo -hidroxi com um comprimento
de cadeia lateral de 16 a 19 átomos de carbono. São ativos contra
fungos filamentosos e na inibição da atividade da fosfolipase A2
[Nishikiori et al., 1986a, b; Umezawa et al., 1986]. Membros da
família iturina contendo um
- ácidos graxos amino e sete aminoácidos, como
micosubtilina, bacilomicina D e iturina A, exibem fortes
atividades antifúngicas e hemolíticas e uma atividade
antibacteriana limitada [Maget-Dana e Peypoux, 1994].
Embora a toxicidade para fungos de bacilomicina D e fengycin
dependa principalmente de suas propriedades de
permeabilização de membrana [Bonmatin et al., 2003; Deleu
et al., 2005; Vanittanakom et al., 1986], suas atividades
biológicas diferem devido à diversidade de grupos polares e
resíduos de aminoácidos [Ongena e Jacques, 2008].
O mutante C06-sfpdeficiente na produção de qualquer um dos
lipopeptídeos não desenvolveu atividade antifúngica contra
M. fructicola(Figo. 1, 2), sugerindo que os lipopeptídeos foram os
principais compostos antifúngicos produzidos por C06. Ensaio de
atividade biológica subsequente dos filtrados livres de células de
C06-fenDe C06-bmyCmostraram que tanto fengycin quanto
bacilomicina D contribuíram para a inibição da germinação de
conídios deM. fructicola(Figo. 2) enquanto a fengycin foi
identificada como os principais compostos envolvidos na inibição
do crescimento micelial deM. fructicola(Figo. 1). Tanto
bacilomicina D [Moyne et al., 2001] ou fengycin [Ongena et al.,
Lipopeptídeos antifúngicos,B.
amyloliquefaciensC06 eM. fructicola
al., 2005b] pode ser empregado porBacilocepas como a
principal arma para o controle de doenças de plantas, que
depende principalmente da quantidade relativa de
lipopeptídeos secretados para o meio ambiente. Por exemplo,
emB. amyloliquefaciens FZB42, a bacilomicina D é o principal
composto antifúngico em antagonismo contraFusarium
oxysporum, por causa de sua alta produtividade em
comparação com a fengycin [Koumoutsi et al., 2004]. No caso
do C06, a razão pela qual a fengycin foi o principal
lipopeptídeo no controle do crescimento do micélio deM.
fructicolaprovavelmente porque o C06 foi capaz de sintetizá-lo
em maior quantidade. O processo de germinação dos conídios
foi desencadeado por umidade e temperatura adequadas
[Manners e Hossain, 1963], e os conídios germinados
mostraram-se sensíveis a mudanças ambientais externas e o
processo de germinação pode ser facilmente interrompido
[Osherov e May, 2001]. Em outras palavras, o processo de
germinação dos conídios foi menos resistente a condições
ambientais adversas, como a presença de antibióticos, do que
o crescimento micelial, o que pode explicar porque a
bacilomicina D foi mais eficaz no controle da germinação dos
conídios do que no crescimento micelial.
Os resultados obtidos no presente trabalho foram
baseados principalmente na avaliação in vitro; as funções dos
lipopeptídeos em frutas destacadas são amplamente
desconhecidas. Além do antagonismo direto de fitopatógenos,
os lipopeptídeos também podem interagir com células
vegetais como um determinante bacteriano para ativar uma
resposta imune através da estimulação do fenômeno de
resistência sistêmica induzida [Blee, 2002; Dixon et al., 2002;
Ongena et al., 2005a, 2007]. Ao aplicar C06 para fins de
preservação pós-colheita, também foi observado o fenômeno
de resistência induzida em frutos destacados (dados não
mostrados). Pesquisas estão em andamento para esclarecer o
mecanismo do efeito de resistência induzida e o papel dos
lipopeptídeos nos processos de inibição.
Procedimentos experimentais
Patógeno fúngico
M. fructicolafoi obtido a partir de um pêssego (Prunus persica(EU.)
Batsch) com sintomas típicos de podridão parda. O isolado de conídio único
foi cultivado em inclinações de PDA [Hitchins et al., 1998] e armazenado a
4°C. Os conídios do patógeno foram produzidos em ágar V-8 a 22–24 ° C
por 7–10 dias, conforme descrito anteriormente [Zhou et al., 2008].
Estirpes bacterianas, plasmídeos e condições de crescimento
As cepas bacterianas e plasmídeos utilizados neste estudo são
descritos na tabela 1.Escherichia coliDH5 foi usado como hospedeiro
para todos os plasmídeos. Meio mínimo [Sambrook e Russell, 2001] e
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Baixado por:
Tabela 1.Cepas bacterianas e plasmídeos usados neste estudo

Cepa ou plasmídeo Genótipo ou características relevantes Fonte ou referência

E. coli
DH5 F- 80dlacZ -M12 minirecA Armazenado neste laboratório

B. amyloliquefaciens
C06 Tipo selvagem Zhou e outros, 2008

C06-bmyC bmyC:: pMar-bmyC-; Ermr este estudo

C06-fenD fenD:: pMar-fenD-; Ermr este estudo

C06-sfp sfp:: pMar-sfp-; Ermr este estudo

plasmídeos

pMarC vetor de transporte transportando transposon TnYLB-1; replicon pUC, replicon Le Breton e outros, 2006
termossensível para hospedeiros Gram-positivos; kmr, amplificadorr, Ermr
pMar-bmyC- derivado pMarC carregando parte debmyCem vez de TnYLB-1; amplificadorr, Ermr este estudo

pMar-fenD- derivado pMarC carregando parte defenDem vez de TnYLB-1; amplificadorr, Ermr este estudo

pMar-sfp- derivado pMarC carregando parte desfpem vez de TnYLB-1; amplificadorr, Ermr este estudo

Marcadores de resistência: Ampr= resistência à ampicilina; Ermr= resistência à eritromicina; kmr= resistência à canamicina.

Mesa 2.Primers e adaptadores de oligo DNA usados neste estudo

Nome Sequências (5-–3-)a

bmyC-pMar-1 GGGGTACC GTACAAAACAGGAGACCTT (KpnEU)

bmyC-pMar-2R AACTGCAG AATTGGTTTCCGATCTCTCC (PSTEU)
fenD-pMar-1 GGGGTACC GCACCCTTGTATCGTGCCCGAA (KpnEU)
fenD-pMar-2R AACTGCAG AAGCCTGAACAAACGTGAGA (PSTEU)
sfp-pMar-1 GGGGTACC GCTTTTACCATAAGGAGGA (KpnEU)
sfp-pMar-2R AACTGCAG AACGACCACAGGTGGTAAAA (PSTEU)
EM-pMar GGTCTATTTCAATGGCAGTTACGA
bmyC-3S CTTTATACCTTCCAGCTGTAA
fenD-3S TATGCAGCTGCATACCGTGTAA
sfp-3S CAGCCTTCATACGTTTTCAT
CAIXA-A1R CTACGGCAAGGCGACGCTGACTGA
iniciador de PCR 1 CTAATACGACTCACTATAGGGC
1 aninhado TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT
2R aninhados AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT
Adaptador 1 CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGC GGCCGCCGGGCAGGT (NãoEU;Raseu 1/2 site)
Adaptador 2R CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCG AGGT (EagEU/EaeEU;Raseu 1/2 site)

aOs locais de restrição nos primers estão sublinhados.

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Baixado por:
Luria-Bertani meio [Bertani, 1951] foram usados para culturaB.
amyloliquefaciensC06. Quando necessário, foram adicionados
antibióticos à concentração final de ampicilina (Amp), 100 -g/ml, ou
eritromicina (Erm), 10 -g/ml.
SSH de DNA baseado em PCR
O SSH foi realizado essencialmente como descrito em outro lugar
[Akopyants et al., 1998; Diatchenko et al., 1996].B. amyloliquefaciens
DNA genômico C06 foi usado como testador eB. subtilis168 foi usado
como o driver. O kit de subtração do genoma bacteriano PCR-Select
(Clontech Corp., EUA) foi utilizado de acordo com as instruções do
fabricante. 500 clones SSH foram escolhidos aleatoriamente e, em
seguida, os fragmentos inseridos foram amplificados com os primers 1
e 2R aninhados. Os produtos de PCR foram submetidos à triagem
Southern dotblotting com sondas feitas de DNA digerido de ambos
B. amyloliquefaciensC06 eB. subtilis168 conforme descrito anteriormente [Liu et
al., 2011a]. Os clones que exibiram intensidade de sinal significativamente mais
forte quando hibridizados com oB. amyloliquefaciensO genoma C06 foi
selecionado e enviado para sequenciamento.
Análise MS MALDI-TOF
Para caracterizar os lipopeptídeos produzidos porB.
amyloliquefaciensC06, os extratos filtrados sem células deB.
amyloliquefaciens C06 foram analisados por MALDI-TOF-MS
conforme descrito anteriormente [Vater et al., 2002, 2003]. Os
espectros de massa MALDI-TOF foram registrados usando um
instrumento Bruker Daltonik Ref lex MALDI-TOF contendo um laser de
nitrogênio de 337 nm para dessorção e ionização. Para a detecção dos
produtos lipopeptídicos,B. amyloliquefaciensC06 foi cultivado em meio
mínimo a 25°C por 30 h e os lipopeptídeos foram então isolados por
precipitação ácida com HCl concentrado em pH 2,0. O precipitado
contendo lipopeptídeos foi coletado por centrifugação e ressuspenso
em 2 ml de metanol ajustado para pH 7,0 [Lin et al., 1994]. O ácido
-ciano-4-hidroxicinâmico foi usado como matriz.
2010, 2011b] e três mutantes, C06-sfp, C06-bmyCe C06-
fenD,foram obtidos.
Bioensaio de antagonismo in vitro
A atividade antifúngica deB. amyloliquefaciensC06 e seus mutantes
paraM. fructicolafoi testado em placas PDA. 30 l de filtrados livres de
células das culturas bacterianas obtidos por incubação em meio
mínimo a 25 ° C por 30 h foram carregados em discos de papel de
filtro de 5 mm colocados a 2 cm da borda das placas de Petri e
deixados difundir no ágar . Um tampão (cerca de 1 cm de diâmetro) de
M. fructicolacortado da vanguarda de uma cultura deM. fructicola
crescido em BDA a 25°C por 3 dias foi colocado no centro da placa.
As placas foram incubadas a 25°C e a distância entre as bordas da
placa de Petri e o micélio fúngico foi medida após 4 dias. O micélio
deM. fructicolada borda da cultura em contato com o filtrado livre
de células foi examinado sob um microscópio de luz. O
experimento foi repetido 3 vezes.
Bioensaio de inibição da germinação de conídios
Os filtrados livres de células deB. amyloliquefaciensC06 e seus
mutantes foram testados no ensaio antifúngico. Conídios deM.
fructicola foram usados como alvos e a concentração de suspensão
de conídios foi ajustada para 105conídios/ml. Em cada teste, 25 -l de
filtrado livre de células foram misturados com 25 -l de suspensão de
conídios e incubados a 25°C por 12 h. A germinação de 100 conídios foi
determinada em microscópio de luz e calculada a porcentagem de
inibição. O experimento foi repetido 3 vezes.
Análise estatística
Os dados foram avaliados estatisticamente por meio de análise de variância,
seguido pelo teste de menor diferença significativa de Fisher (p = 0,05) usando o
software SPSS (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA).

Construção deB. amyloliquefaciensC06 Mutantes Reconhecimentos

O isolamento e a manipulação do DNA recombinante foram
realizados usando técnicas padrão.E. colieB. amyloliquefaciensforam
transformadas conforme descrito por Sambrook e Russell [2001] e
Spizizen [1958], respectivamente. Todas as enzimas usadas neste
estudo foram adquiridas da Takara (Dalian, China). Os primers
específicos usados para a PCR estão listados na tabela 2.
Para determinar os papéis dos lipopeptídeos deB. amyloliquefaciensC06
no controle biológico do patógeno pós-colheita de frutasM. fructicola,sfp,
bmyCefenDos genes foram interrompidos por recombinação cruzada única,
conforme descrito anteriormente [Liu et al.,
Esta pesquisa é financiada pela Agriculture and Agri-Food Canada e
também apoiada por doações do Fundo Nacional de Ciências Naturais
da China (30570041), Programa Nacional 863 da China
(2006AA10Z172), Programa de Cooperação Internacional em Ciência e
Tecnologia (2009DFA32740), o Programa Especial de Pesquisa
Científica Sem Fins Lucrativos, PR China (3-23), e o Programa Nacional
Transgênico Principal (2009ZX08009-055B). J. Liu recebeu uma bolsa de
pós-graduação do China Scholarship Council.

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amyloliquefaciensC06 eM. fructicola

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