UNIVERSIDADE JEAN PIAGET DE MOÇAMBIQUE

AGR Curso de Licenciatura em Agronomia

Cadeira: Genética e Melhoramento de Plantas

Tema: Variação somaclonal (transformações genéticas)

Discente:

Hélio Nordine Daudo Charifo

Malena do Rogério Tomé

Moisés Denílson Joaquim Moisés

Beira

2022
 UNIVERSIDADE JEAN PIAGET DE MOÇAMBIQUE
Curso de Licenciatura em Agronomia

Cadeira: Genética e Melhoramento de Plantas

Tema: Variação somaclonal (transformações genéticas)

Discente:

Hélio Nordine Daudo Charifo

Malena do Rogério Tomé

Moisés Denílson Joaquim Moisés

Docente:

Helton João Tomo (HJT. MSc.)

Beira

2022
Índice

1. Introdução…………………………………………………………………………………………………….……….4
2. Objectivos………………………………………………………………………………………………..…………….5
2.1 Objectivo geral………………………………………………………………………………….….…………5
2.2 Objetivos específicos……………………………………………………………………………..……….5
3. Metodologia……………………………………………………………………………………………….………….5
4. Variação Somaclonal……………………………………………………………………………………….………6
4.1 Breve histórico do cultivo in vitro…………………………………………………………….…….7
5. Micropropagação……………………………………………………………………………………………….……7
5.1 Cultura de meristemas…………………………………………………………………………...……….8
5.2 Embriogénese………………………………………………………………………………………...……….9
5.3 Organogénese………………………………………………………………………………………..…..……9
6. Cultura de protoplasto………………………………………………………………………………………………10
7. Cultura de material desorganizado……………………………………………………………………………11
7.1 Calos e suspensões…………………………………………………………………………………………..12
8. Cultura de anteras…………………………………………………………………………………………………..…12
9. Transformação genética de plantas……………………………………………………………………………13
9.1 Transformação genética…………………………………………………………………………...........14
9.2 Estratégia por Agrobacterium…………………………………………………………………………15.
10. Como ocorre o método por Agrobacterium…………………………………………………………….16
11. Vantagens e desvantagens………………………………………………………………………..…………….18
12. Conclusão………………………………………………………………………………………………………………..20
13. Referencias bibliográficas………………………………………………………………………………………..21
1.Introdução

O presente trabalho enquadra-se no âmbito da disciplina de Genética e Melhoramento, e o

mesmo tem como tema Variação soma clonais (transformações genéticas). No presente
trabalho buscara-se desenvolver e abordar assuntos com relação ao mesmo tema.
Clonagem é a produção de indivíduos geneticamente iguais. É um processo de reprodução
assexuada que resulta na obtenção de cópias geneticamente idênticas de mesmo ser vivo
matriz.
A clonagem vegetal é uma das aplicações mais rotineiras de maior impacto para agricultura,
pois permite uma propagação em larga escala de plantas sadias, conservando as mesmas
características agronómicas da planta-mãe.
Segundo (Lays L. Alves.2018), a cultura de arroz (Oryza sativa L.) por ser o alimento básico de
mais da metade da população mundial. A produtividade da cultura em todos os sistemas é
afectado pela brusone (Magnaporthe oryzae) que é considerada a principal doença do arroz, se
não combatida ou controlado pode ocasionar perdas de até 100%, durante a produção
dependendo das condições climáticas e da virulência do patógeno. A obtenção de variedades
mais resistentes a esta doença é muito importante.
A Clonagem na biotecnologia refere-se aos processos usados para criar cópias de fragmentos
de DNA (clonagem molecular), células ( clonagem celular), ou organismos.
A variação somaclonal é uma das técnicas de produção indicada para estes tipos de culturas
(culturas com tecidos). A batata (Salonum tuberosum L.) é a quarta cultura com grande
importância económica no mundo todo depois do trigo, milho, e o arroz. Esta cultura de
tecidos, tem contribuído no melhoramento genético da própria batata, no sentido de obtenção
de novas plantas livres de vírus e micropropagação de genótipos mais resistentes. No entanto,
plantas regeneradas a partir de culturas de tecidos, podem apresentar ou exibir uma variação
em importantes caracteres Agronómicos
2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

 Descrever a variação somaclonal e as transformações géticas das plantas

2.2. Objetivos específicos

 Explicar como ocorre e em quais plantas ocorre

 Mostrar a importância desta técnica de produção
 Mostrar as vantagens e desvantagens deste processo

3.Metodologia

Para materialização do presente trabalho, teve-se como base o método de consulta

bibliográfica, pois conforme Gil (2006), a pesquisa bibliográfica toma forma a partir da consulta
à materiais já elaborados, sendo esses, principalmente artigos científicos e livros.
Aponta também, que quase todos os tipos de estudos possuem essa natureza, contudo, há
pesquisas que se voltam exclusivamente ao desenvolvimento a partir de fontes bibliográficas.
Nesse sentido cabe auferir que uma grande parcela dos estudos descritivos e exploratórios são
definidos como pesquisas bibliográficas, e, desse modo, pode se propor análise de diversas
posições sobre um determinado problema, isto é, apoia-se na literatura para analisar,
cientificamente, um fenómeno.
A pesquisa bibliográfica é feita a partir do levantamento de referências teóricas já analisadas, e
publicadas por meios escritos e electrónicos, como livros, artigos científicos, páginas de web
sites. Qualquer trabalho científico inicia-se com uma pesquisa bibliográfica, que permite ao
pesquisador conhecer o que já se estudou sobre o assunto. Existem porém pesquisas que se
baseiam unicamente na pesquisa bibliográfica, procurando referências teóricas publicadas com
objectivo de recolher informações ou conhecimentos prévios sobre o problema a respeito do
qual se procura a resposta (FONSECA, 2002, p. 32).
4.Variação somaclonal

Os avanços na biotecnologia vegetal tem refletido positivamente principalmente na

agricultura, industriais de alimentos, nos consumidores e no meio ambiente.
A Variação somaclonal é uma variação fenotípica de origem genética, ou seja, é uma
variação cromossómica que se tornam herdável nas gerações seguintes, ou também
podem ser epigenéticas, que são as variações transitórias devido ao estresse fisiológico
que o material sofre, quando submetido a cultivo in vitro.

Fig.1. Cultivo in vitro de partes de plantas. Fonte: (biotecnologia verde 2017).

O cultivo in vitro é uma prática que permite o crescimento e multiplicação de células,

tecidos, órgãos ou partes de uma planta, sobre um meio nutritivo e em condições
assépticas (laboratório), ambientais com iluminação e temperatura controladas. A
propagação in vitro ou micropropagação é uma alternativa para a multiplicação de
espécies que tenham dificuldades de obtenção de sementes viáveis ou quando os
métodos tradicionais de propagação não são efetivos (Mantovani et al. 2008). Essa
prática garante a proteção e conservação de espécies vegetais ameaçadas de extinção, e
ajuda no melhoramento de espécies com interesse agronómicos.
A biotecnologia verde é uma área que resulta da inter-relação entre a cultura de tecidos
e a genética molecular, e atualmente é uma das áreas que tem contribuído bastante e
auxiliado no desenvolvimento da tecnologia de melhoramento de plantas, e explora em
grande parte, o DNA para selecionar algumas características (genes) de interesse e
evitar outras indesejadas.
A propagação vegetal in vitro consiste no cultivo de células, tecidos ou órgãos vegetais
em recipientes semi-herméticos, sob condições de assepsia, com o controle de
temperatura, umidade e pH utilizando meios de cultivo artificiais. Os meios do cultivo
podem ser líquidos ou gelificados, contendo nutrientes como sais inorgânicos, açucares,
vitaminas, hormônios de crescimento e aminoácidos necessários para o
desenvolvimento do fragmento da planta que está sendo propagada ou cultivada. A
multiplicação do material vegetal se da devido a propriedade das células vegetais se
multiplicarem chamada (totipotência), ou seja sua capacidade de regenerar uma planta,
ou partes dela, quando colocado em condições adequadas, se durante a propagação in
vitro a plântula multiplicada tiver sucesso elas podem produzir raízes, partes aéreas e
suas células isoladas podem produzir embriões.

4.1. Breve histórico do cultivo vegetal in vitro.

In Vitro (em vidro) é uma expressão latina que designa todos os processos biológicos
que têm lugar dentro de um sistema-vivo, no ambiente controlado e fechado de um
laboratório e que são feitos normalmente em recipientes de vidro.
A técnica começou a ser utilizada, em meados de 1920, inicialmente para estudos do
metabolismo celular vegetal. Na década de 1940, estudos sobre a doença chamada
galha da coroa, utilizando técnicas de cultivo in vitro, revelaram indícios de que a
interação de bactérias (Agrobacterium tumefaciens) e plantas resultava em princípios
activos que alteravam permanentemente as células vegetais infectadas. Mais tarde,
ainda nesta linha de pesquisa, sugeriu-se que a formação dos tumores causados pela
doença estaria relacionada a transferência de material genético da bactéria para as
células vegetais. Apenas na década 1967, foi constatada que essa transferência de genes
da bactéria para a planta acontecia por meio de plasmídeos bacterianos. Foi graças a
esses marcos que o a ideia de cultivo in vitro ficou mais consolidada.
O primeiro trabalho que relatou sucesso na regeneração de plantas de Eucalyptus
através do cultivo in vitro foi em 1969 usando explante de Eucalipto variedade (E.
citriodora). Em 1972 observou-se a produção de massa produzindo gemas e raízes que
podiam ser subcultivadas produzindo plantas inteiras.

5. Micropropagação ou clonagem

É uma das mais importantes aplicações de cultivo in vitro. Permite obter, em pouco
tempo, um grande número de plantas geneticamente uniformes e sadias, mesmo que a
partir de plantas-mães infectadas.
A micropropagação ou clonagem pode ser realizada por meio de três técnicas: a) cultura
de meristemas; b) embriogéneses somática; c) organogéneses.
 5.1. a) Cultura de meristemas (culturas de tecidos)
Meristemas são grupos de células não diferenciadas nos tecidos vegetais, que
apresentam alta actividade de divisão e são reesposáveis pelo crescimento dos
diferentes órgãos da planta.
O cultivo de meristemas é uma tecnologia utilizada para produzir plantas livres de
viroses, pois estas partes da planta são as únicas não infectáveis por vírus. Tal
capacidade se dá pela velocidade com que as células se multiplicam e pela ausência de
um sistema vascular por onde os vírus possam ser disseminados. Essa técnica consiste
em cultivar meristemas totalmente livres de vírus e induzir a formação de material
propagativo geneticamente idênticos aos parentais.
Por conta dessas peculiaridades, o cultivo de meristemas tornou-se importante na
obtenção de tecidos para a transformação genética por agentes biológicos como a
(Agrobacterium). A cultura de tecidos pode ser empregada para a multiplicacao de
espécies difícil propagação, como ee o caso de algumas espécies nativas

Fig.2. (a, b, c, d… e,). Passos na técnica utilizada para extrair e cultivar o ápice
merismático de uma planta de maracujá ( passiflora edulis). Fonte: (Efficient shoot
regeneration from directapical meristem tissue to produce virus-free purple passion fruit
plants).

 As etapas desse processo podem ser descritas como asseguir indica:

1. Etapa: seleção da planta matriz (planta- mãe );
2. Etapa: estabelecimento do explante (tecido ou partes de planta) in vitro;
 3. Etapa: multiplicação de brotos; e,
4. Etapa: aclimatização – transferência para ambiente natural (transplante).

5.2. b) Embriogéneses somática

Consiste na produção de embriões a partir de tecidos somáticos que regeneram uma

planta inteira, geralmente com constituição genética idêntica a da planta-mãe. Essas
plantas transmitem o material genético inserido para as próximas gerações.
A embriogénese somática, é considerada um pré-requisito na produção de plantas
transgénicas. Atualmente esse sistema tem sido o sistema regenerativo preferencial
para tal objetivo, uma vez que é eficiente e há pouca chance de anormalidades
genéticas nas plantas regeneradas.

Fig.3. Processo de propagação da embriogénese somática. Fonte: (biotecnologia verde).

A cultura de tecidos é um conjunto de técnicas com diversas vantagens e aplicações. Diferentes

partes de uma planta podem ser isoladas (explantes) e colocadas em meio de cultivo ou
propagação com balanço de nutrientes que irão orientar a diferenciação celular. Essas células
por sua vez formam tecidos e órgãos para o estabelecimento de novas plantas.
 5.3. c) Organogénese

É a formação de gemas (órgãos) directamente a partir de tecidos (bases de folhas, raízes,

pecíolos, segmentos, etc.) ou indiretamente a partir de calos. Essa técnica envolve duas fases
que são Desdiferenciação e a Rediferenciação.
 Desdiferenciação: logo após o isolamento do tecido, que promove uma rápida divisão
celular, formando um aglomerado de células indiferenciadas;
 Rediferenciação: quando o primórdio do órgão origina meristemas. Os novos órgãos são
chamados de adventícios.

Fig.4. Organogénese: formação de plantas de abacaxizeiro (ananás) a partir de base de uma

folha (explante) da planta-mãe cultivada in vitro. Fonte: (THAIS R.SEMPREBOM):.

6. Cultura de protoplasmas

Protoplastos é o material celular resultante após a remoção enzimática da parede celular. Após
a fusão de protoplastos, é possível regenerar plantas completas a partir dos tecidos
selecionados.Protoplastos constituem um sistema útil para o estudo da expressão de (genes
isolados) e a sua regulação em plantas. A fusão de protoplastos pode ser utilizado para produzir
híbridos.
Fig.5. Representação da fusão de protoplastos.

7. Cultura de material desorganizado

7.1. Calos e suspensões

a).Calos são uma massa de tecido desorganizado, uma alternativa para obter e selecionar
plantas resistentes a condições adversas e destintos tipos de materiais para produzir
compostos de interesse.
b).Suspensões são proliferações de células isoladas ou em pequenos aglomerados, obtidas a
partir da agitação de calos, dispersos em um meio líquido.
Esses sistemas de cultivo podem ser utilizados para estudar os processos celulares ou
bioquímicos relacionados a divisão, crescimento e diferenciação celular.

Fig.6. Calos de tabaco (Nicotina tabacum) em meio de cultivo in vitro. Fonte ( wikimedia
Commons, igge).
8. Cultura de anteras

Anteras são a parte de estrutura reprodutora masculina das flores onde são produzidos os
grãos de pólen. O cultivo de cultura de anteras tem sido utilizado para se conseguir plantas
clones com células que possuem uma só cópia da dotação cromossómica (haploides).

Fig.7. Aspecto de uma planta com anteras. Fonte: (floresreprodutoras. bioaulas).

Plantas superiores haploides não produzem sementes (são inférteis), portanto antes de serem
usadas para a reprodução, é necessário duplicar o número de cromossomos. Essa técnica de
cultivo é considerada uma ferramenta com grande potencial para o melhoramento de plantas,
pois possibilita a obtenção de linhas inteiramente homozigotos, oque diminui
consideravelmente o tempo de obtenção de novas cultivares (plântulas).
De acordo com os objetivos de cada propagação o modo de vida das plantas nesses ambientes
possui seus modelos e técnicas de cultivo, permitindo assim utilizar as mais diferentes
estratégias para se atingir as metas desejadas. No intento, seja qual for a técnica do cultivo
vegetal in vitro utilizada, sua escolha dependerá dos objectivos desejados, da disponibilidade
do material vegetal da sua capacidade em responder aos tratamentos e métodos.
9. Transforação Genética

O estabelecimento de um eficiente sistema de transformação genética de qualquer espécie

vegetal necessita de três etapas: (a)identificação, isolamento e introdução do DNA exógeno na
célula; (b) seleção após o crescimento das células transformadas; e (c) estabelecimento de um
sistema simples e eficiente de regeneração das células transformadas (RIBEIRO & DUSI,1999).
Esse processo acontece primeiramente com a retirada do DNA de um organismo que será
utilizado como doador, separa-se o gene que será usado. Em seguida há a combinação desse
gene ao DNA de outro organismo, o qual pretende-se melhorar e o resultado é um DNA que
contem características dos dois organismos.
 A transformação direta consiste no uso de métodos químicos ou físicos e, atualmente as
principais são (Biolística e a eletroporação).

 A transformação indireta consiste no uso de um vetor, como (Agrobacterium), para

intermediar a transferência do DNA.

9.1. Transformação genética: estratégias e aplicações para o melhoramento genético de

espécies florestais
A transformação genética, que consiste na introdução controlada de um gene no genoma de
uma célula receptora e em sua posterior expressão, assume adicional significância, pois abre
novas perspectivas ao melhoramento genético de espécies florestais, disponibilizando novos
genes com características desejáveis para serem incorporadas em menor espaço de tempo.
Através do uso de estratégias com (Agrobscterium, biolística e outras técnicas), já foram
obtidas plantas transgénicas com maior produção de biomassa, melhor qualidade de madeira,
maior resistências a determinados insectos e com tolerância a herbicidas, entre outras
características de interesse. O tamanho e a complexidade do plasmídeo T, também podem
interferir nessa capacidade de transformação genética.
A biolística é também conhecida como gene gun (arma de genes),aceleração de partículas ou
bombeamento com micropartículas (BRICK.1993).
Fig.8. Representação do método biolística.
A grande vantagem do sistema ou método biolística ee que ela permite a transformaco de
células, tecidos e espécies de forma direta, simples e rápida, semdo aplicável para transferência
de genes a espécies em que os outros métodos falham, com essa técnica a eficiência na
obtenção de transformantes estáveis é cerca de 1 a 5% dos transformantes (SANFORD, 1990;
PATTRYKUS,1990).
Genoma é o perfil genético de espécie, transmitido de geração em geração. No genoma
encontram-se gravadas características genéticas encarregadas de dirigir o desenvolvimento
biológico de cada individuo. As doenças hereditárias também estão escritas no genoma
Atualmente, diferentes sistemas para a transferência de genes em plantas estão disponíveis.
Dentre estes, pode-se destacar o método indirecto, baseado na patogenidade de
agrobacterium e os métodos diretos, os quais dispensam o uso de vetor intermediário (BABU et
a.,l 2000). Hoje os métodos de transformação de plantas utilizados com maior frequência e
eficiência são baseados nos sistemas agrobacterium e biolística (GONSALVES 2001,STUDART-
GUIMARAES et al.,2003).
 9.2. Estratégia via Agrobacterium:
Agrobacterium tumefaciens é o agente causal da ¨galha-da-coroa¨ (do inglês crown gall),
doença que se caracteriza pelo crescimento de tumores na juncão entre o caule e a raiz.

Fig. (9,10,…) galha-da-coroa (grown gall). Fonte: (genética da planta).

A formação desses tumores é o resultado de um processo natural de transferências de
genes contidos em uma região específica do plasmídeo.
Plasmídeos bacterianos são sequencias de DNA de fita dupla, com formato circular, que
apresentam duplicação autónoma e carregam alguns genes. Para houver sucesso com
essa técnica, é necessário que durante o processo haja uma boa interação entre o
patogeno, e a planta que pretende-se multiplicar.
Fitopatologistas descobriram que, mesmo depois da desinfecção das plantas que tinham
a doença galha-da-coroa, os sintomas permaneciam, sugerindo a presença de um fator
determinante nas plantas infectadas. Mais tarde, esse fator foi identificado como um
fragmento do DNA oriundo da Agrobacterium, denominado T-DNA ou DNA de
transferência.
A primeira etapa deste método é o reconhecimento e a fixação da bactéria no tecido
vegetal. Na segunda, ocorre o processo de transferência do T-DNA e, finalmente, a
integração do T-DNA no genoma da célula vegetal. Dessa forma a execução de todas
essas etapas é necessária, para a obtenção de sucesso em um cultivo in vitro de uma
planta transgénica.
A primeira espécie florestal transformada via o método Agrobacterium foi o hibrido de
álamo (Populus alba), e desde então, numerosos protocolos vem sendo estabelecidos e
otimizados para diferentes espécies florestais (FILLATTI et al., 1987).
Embora aparentemente simples, essa técnica possui algumas limitações. A principal
refere-se ao tipo de hospedeiro, isso porque a Agrobacterium pode colonizar amplo
espectro de espécies de dicotiledóneas, porém, coloniza poucas espécies de
monocotiledóneas.
A razão dessa limitação não é bem conhecida, mas pode ser devido a ausência de sítio
de reconhecimento para a bactéria na superfície da planta ou inibição da indução dos
genes de transferências, ou também o efeito inibitório do balanço hormonal de auxinas
e citocininas das monocotiledóneas (GRANT et al., 1993).

10. Como ocorre o processo pelo método Agrobacterium.

As bactérias do género Agrobacterium são fitopatogenos com capacidade natural de

transferir DNA para algumas espécies de dicotiledóneas, induzindo a formação de um
tumor conhecido como galha-da-coroa.
De acordo com (TZFIRA & CITOVSKY.2000), a primeira etapa é o reconhecimento e a
fixação da bactéria no tecido vegetal. Na segunda, ocorre o processo de transferência
do T-DNA e, finalmente, a integração do T-DNA no genoma da célula vegetal (GELVIN,
2000; ANDRADE et al.,2003).
Fig.14. Transformação genética de plantas.
11. Vantagens e Desvantagens

Vantagens:

 Propagar plantas de qualidade em grande escala;

 As plantas melhoradas abrem novas possibilidades para o produtor, sendo um recurso adicional
ao melhoramento tradicional;
 As plantas melhoradas podem ser produzidas em locais definitivos sem risco de introduzir
doenças no local;
 Ajuda a recuperar espécies de plantas em vias de extinção, ou regenerar indivíduos resultantes
de cruzamentos com pouca viabilidade;
 Ajuda a criar variedades de indivíduos resistentes a fatores como estresses ou com
características melhoradas (aumento de produção de açúcar, resistência a fungos, bactérias,
vírus, etc.);
 Permite obter, em pouco tempo, um grande número de plantas geneticamente uniformes e
sadias, mesmo que a partir de plantas-mães infectadas;
 A maioria das plantas irão naturalmente produzir sementes, que normalmente são livres de
doenças e que crescerão rapidamente sob boas condições.

Desvantagens:

 A maior desvantagem dessas técnicas de propagação, são os custos financeiros requeridos para
execução ou instilação de um sistema:
 A segunda maior dificuldade na separação dos indivíduos normais e variantes é que as
características morfológicas, que são inerentes a este tipo de variação, só se tornam evidentes
quando a planta está adulta;
 Necessidade de plantas-mães e de instalações de propagação adequadas;
 Existe o risco de estreitamento da base genética dos plantios clonais, quando durante a
utilização de clones não ocorre o ganho genéticos adicionais a partir da primeira geração da
seleção.
12. Conclusão

Os avanços na biotecnologia vegetal tem refletido positivamente principalmente na agricultura,

industriais de alimentos, nos consumidores e no meio ambiente.
Clonagem é a produção de indivíduos geneticamente iguais. É um processo de reprodução
assexuada que resulta na obtenção de cópias geneticamente idênticas de mesmo ser vivo
matriz.A clonagem vegetal é uma das aplicações mais rotineiras de maior impacto para
agricultura, pois permite uma propagação em larga escala de plantas sadias, conservando as
mesmas características agronómicas da planta-mãe.
O cultivo in vitro é uma prática que permite o crescimento e multiplicação de células, tecidos,
órgãos ou partes de uma planta, sobre um meio nutritivo e em condições assépticas
(laboratório), ambientais com iluminação e temperatura controladas.
A transformação direta consiste no uso de métodos químicos ou físicos e, atualmente as
principais são (Biolística e a eletroporação).

A transformação indireta consiste no uso de um vetor, como (Agrobacterium), para intermediar

a transferência do DNA.
13.Referenciais bibliográficas

ANDRADE, M. M. Introdução à metodologia do trabalho científico: elaboração de trabalhos na

graduação. São Paulo, SP: Atlas, 2010.
FONSECA, J. J. S. Metodologia da pesquisa científica. Fortaleza: UEC, 2002. Apostila.
GIL, A. C., Como elaborar projectos de pesquisa, Editora Atlas, São Paulo, 2006.
GAMBORG, Oluf L.. Plant tissue culture. Biotechnology. Milestones. In vitro Cellular &
Developemental Biology – Plant, v.2 n. 38, p.84-92.
Noções de Cultivo de Tecidos Vegetais. Campina Grande: Embrapa Arroz,2003, 39p.
NEUMANN.Krl-hermann, KUMAR, Ashwani; IMANI, Jafargholi. Plant Cell and Tissue
Culture – A Tool in Biochnology: Basics and Application. Heidelberg: springer. 2009 .331 p.
OLIVEIRA, M.M. aplicações e Avanços na Área da biotecnologia Vegetal. Biotecnologia
molecular: Avanços e Aplicações. N. 66,lisboa, p.22-27, 2000.
PAIVA, H. N.; GOMES, J.M. Propagação vegetativa de espécies florestais. Apostila 322, UFV,
Viçosa, 1993, 40 p.