Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Licenciatura em Biologia e Geologia

Micropropagação de Pitaya em diferentes meios de cultura

Relatório de Estágio
Sara Pinto, nº75775
Departamento de Genética e Biotecnologia
Laboratório de Biotecnologia Vegetal

Orientadora: Professora Doutora Fernanda Maria Madaleno Rei Tomás Leal Santos
Vila Real, 2024

1
 Orientadora de Estágio

Professora Doutora Fernanda Maria Madaleno Rei Tomás Leal Santos

Departamento de Genética e Biotecnologia
UTAD

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Índice
1. Introdução ................................................................................................................4

2. Material e métodos...................................................................................................5
2.1. Material vegetal...........................................................................................5
2.2. Preparação dos meios de cultura.................................................................5
2.3. Instalação da planta em cultura...................................................................6

3. Resultados e Discussão ............................................................................................7

3.1. Efeito do meio de cultura na micropropagação da planta Pitaya................7
• Efeito no número de rebentos......................................................................8
• Efeito no comprimento dos rebentos...........................................................9
• Efeito no número de raízes..........................................................................9
• Efeito no comprimento das raízes..............................................................10
• Efeito no número de raízes adventícias ....................................................11

3.2. Efeito do tempo, em semanas, na micropropagação da planta Pitaya.......12

• Efeito no número de rebentos....................................................................13
• Efeito no comprimento dos rebentos.........................................................14
• Efeito no número de raízes........................................................................15
• Efeito no comprimento das raízes..............................................................15
• Efeito no número de raízes adventícias ....................................................16

4. Conclusão................................................................................................................17

5. Referências bibliográficas......................................................................................18

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1. Introdução

A planta pitaya pertence ao género Hylocereus da família Cactaceae. Originária da

América tropical, a planta adapta-se bem a diversas condições climáticas no seu
habitat natural, crescendo praticamente ao nível do mar nas áridas planícies costeiras
da Costa do Pacífico e em condições mais húmidas e de floresta nublada em elevações
mais altas (Trivellini et al., 2020).

As espécies de pitaya produzem um fruto comestível que tem despertado considerável

interesse por parte dos consumidores devido aos seus componentes nutracêuticos,
elevado valor nutricional e benefícios positivos para a saúde. Estes frutos são fonte de
micronutrientes e macronutrientes essenciais, além de apresentarem elevados níveis
de minerais e vitaminas indispensáveis (Kim et al., 2011). Diversos estudos têm
demonstrado os benefícios para a saúde da casca, polpa e sementes comestíveis da
pitaya, tais como a prevenção do cancro, efeitos anti-inflamatórios e antidiabéticos, e
uma redução no risco de mortalidade por doenças cardiovasculares, além de
propriedades antioxidantes (Trivellini et al., 2020).

Os frutos da maioria das espécies de Hylocereus apresentam cascas pigmentadas em

tons de vermelho-púrpura, enquanto a cor da polpa varia de branca (em H. undatus) a
vermelha e roxa (em H. polyrhizus e H. costaricensis), dependendo da concentração
de dois pigmentos betalaínas, nomeadamente, as betacianinas vermelhas-violeta e as
betaxantinas amarelas-alaranjadas (Esquivel et al., 2007).

A reprodução da pitaya é frequentemente feita através de sementes ou estacas. No

entanto, a propagação a partir de sementes é desencorajada devido à fase juvenil da
planta, e a propagação vegetativa por estacas pode resultar na disseminação de
doenças. Assim, a utilização da cultura de tecidos pode ser uma solução, pois
possibilita a produção de material de maior qualidade. Essa técnica permite a
obtenção de plantas saudáveis e a produção em grande escala a partir de uma pequena
quantidade de material propagativo (Menezes et al., 2012).

Para este estudo irá ser feita a micropropagação da pitaya, sendo monitorizado o seu
desenvolvimento.

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A técnica de cultura de tecidos vegetais é empregue para cultivar células, tecidos e
órgãos de plantas isolados em condições asséticas (in vitro), visando regenerar e
propagar plantas inteiras. O termo "cultura de tecidos" é comummente utilizado como
uma expressão geral para descrever todos os tipos de culturas de plantas, incluindo
calli, células, protoplastos, anteras, meristemas, embriões e órgãos. A técnica baseia-
se no fenómeno da totipotência celular, que é a capacidade das células individuais de
se dividirem, produzirem todas as células diferenciadas características dos órgãos e
regenerarem-se formando uma planta completa (Bhojwani et al., 2013).
Na teoria, acredita-se que todas as células das plantas têm a capacidade de expressar a
sua totipotência. No entanto, os explantes são uma mistura de células em diversos
estados: fisiológico, bioquímico e de desenvolvimento. Assim, espera-se que ao expor
esses explantes a um ambiente in vitro, haja estímulo para reações variadas nos
diferentes tipos celulares. Isso resultaria em apenas algumas células do explante
respondendo às condições da cultura in vitro, eventualmente levando à regeneração de
um novo indivíduo (Mantell el al., 1994).
Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes meios de cultura, mais
precisamente da concentração da citocinina BAP (6-benzilaminopurina), e da
presença ou não da auxina, na micropropagação de plantas de pitaya.

2. Material e métodos

2.1. Material vegetal

O material vegetal utilizado foi a planta pitaya, previamente cultivada em condições
in vitro, utilizando o meio de cultura de Murashige e Skoog (MS), pelo que não houve
necessidade de desinfeção. Este material é oriundo do laboratório de Biotecnologia
Vegetal da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.

2.2. Preparação dos meios de cultura

Quatro tipos distintos de meios de cultura foram preparados. A solução-base
empregada foi o meio Murashige e Skoog (MS).

Em primeiro lugar, foram selecionados quatro balões erlenmeyer, nos quais foram
adicionados 320mL de água destilada, 4,406g de meio MS, 10g de sacarose (25 g/L)
e, os reguladores de crescimento respetivos. O primeiro frasco é o nosso controlo,

5
contendo apenas o meio MS sem nenhum regulador de crescimento adicional. No
segundo frasco, foram adicionados 400μL de BAP (1mg/L) – 1BAP. No terceiro
frasco, foram adicionados 800μL de BAP (2mg/L) – 2 BAP. No quarto frasco
adicionaram-se 800μL de BAP (2mg/L) e 80μl de NAA (0,2mg/mL) – 2 BAP+0,2
NAA.

Utilizando um elétrodo, o pH foi ajustado para 5,6. Para esse ajuste, foram
adicionadas gotas de NaOH (0,1N) para aumentar o pH ou gotas de HCl (0,1N)
diluído em água destilada para diminuir o pH, conforme necessário. Após o ajuste do
pH, a solução foi completada até atingir 400mL com água destilada e então foram
adicionados 3g de agar. Os balões de erlenmeyer foram selados com papel alumínio e
colocados num autoclave por 15 minutos, a 121ºC.

Na estufa, colocaram-se cerca de 30 frascos a esterilizar fechados com papel de

alumínio durante 1 hora a 180ºC.

Após o tempo estipulado, os balões de erlenmeyer e os recipientes foram transferidos

para a câmara de fluxo laminar, previamente ligada e esterilizada com luz ultra violeta
(durante 15 a 20 minutos). Dentro da câmara de fluxo laminar, aproximadamente
25mL de meio de cultura foram adicionados a cada frasco. Este processo foi repetido
para todos os meios. Os frascos foram então identificados com o nome do meio de
cultura correspondente.

2.3. Instalação da planta em cultura

Após esterilização da câmara de fluxo laminar, e preparação do material necessário
para a instalação dos explantes, as mãos e o material necessário, como bisturi e pinça,
foram desinfetados para evitar contaminações. Com o uso de uma pinça, o papel
esterilizado foi retirado e colocado próximo à lamparina acesa.
Utilizando uma pinça, as plantas foram removidas dos frascos onde se encontravam e
cortadas com o bisturi para produzir vários explantes com aproximadamente 2cm de
comprimento. Quatro desses explantes foram colocados dispersos em cada frasco
contendo meio de cultura. Todo este processo foi efetuado junto à lamparina, no
interior da câmara de fluxo laminar. Os frascos foram identificados com a data e o
nome da planta.

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No período de 6 semanas, os explantes foram observados e foram registados os
seguintes parâmetros: número e comprimento dos rebentos, número e comprimento
das raízes e número de raízes secundárias.

3. Resultados e Discussão

Ao longo de 6 semanas, foram avaliados vários parâmetros, de 64 explantes, como o

número e comprimento de rebentos, número e comprimento de raízes e número de
raízes secundárias (Figura 1, em anexo).

O material vegetal apresentou contaminação fúngica e bacteriana ao longo das 6

semanas, apresentando uma percentagem de contaminação fúngica de 8,20% e uma
percentagem de contaminação bacteriana de 59,02%.

Os resultados foram registados utilizando o programa excel e os tratamentos

estatísticos dos dados foram realizados utilizando análise de variância (ANOVA)
efetuada pelos programas IBM SPSS Statistics 29.0. e StatView v5.0, considerando
diferenças estatisticamente significativas quando P-value<0.05.

3.1. Efeito do meio de cultura na micropropagação da planta Pitaya

Neste estudo foram utilizados 4 meios de cultura, e avaliado o efeito da concentrações da

citocinina BAP em diferentes parâmetros do desenvolvimento de pitaya.

Tabela 1 – Número e comprimento médios de rebentos e raízes, e número de raízes

secundária, nos diferentes meios de cultura

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 Efeito no número de rebentos

Gráfico 1 - Efeito do meio de cultura no número de rebentos, na planta pitaya.

É possível observar no gráfico 1 que, relativamente ao número de rebentos formados

o meio onde ocorreu maior formação foi o meio MS suplementado com 2BAP e
0,2NAA, apresentando 27 rebentos no total dos explantes. Quanto ao meio com
menor formação de rebentos foi o meio controlo MS (sem reguladores de
crescimento) com 7 rebentos no total.

Após a análise estatística verificamos que ocorreram diferenças significativas (P-

value<0,05) quando se comparam os resultados obtidos em meio de cultura MS, sem
reguladores de crescimento, com os resultados obtidos em todos os outros meios. O
efeito do meio de cultura foi altamente significativo para a formação de novos
rebentos (P-value=0,0003).

Os melhores meios para a formação de rebentos na planta são o meio MS

suplementado com 2 mg/L de BAP e o meio MS suplementado com 2 mg/L de BAP e
0,2mg/L de NAA. Num estudo realizado por Arruda et al. (2019), na
micropropagação de Actinia deliciosa (Kiwi) com diferentes concentrações de
citocininas, observou-se que o meio suplementado com 2mg/L de BAP induziu o
maior número de rebentos em relação aos meios com concentrações menores deste
fitorregulador.

8
 Efeito no comprimento dos rebentos

Gráfico 2 - Efeito do meio de cultura no comprimento dos rebentos (mm), na planta pitaya

No que diz respeito ao comprimento dos rebentos (Gráfico 2), podemos observar que
o mesmo é maior no meio MS suplementado com 2mg/L de BAP, com uma média de
7.92mm. Quanto ao meio que apresentou menor comprimento dos rebentos foi o meio
MS suplementado com 1mg/L de BAP, com uma média de 3.85mm.

Após a análise estatística verificamos que ocorreram diferenças significativas (P-

value<0,05) quando se comparam os resultados obtidos entre todos os meios. O efeito
do meio de cultura foi significativo para o alongamento dos rebentos formados (P-
value=0,0021).

O meio mais favorável para o alongamento dos rebentos é o meio MS+2BAP. O

mesmo não acontece num estudo realizado por Santana et al. (2006), na
micropropagação de O. basilicum, no qual se verificou que o maior alongamento dos
rebentos se deu com a ausência de BAP no meio.

 Efeito no número de raízes

Quanto ao número de raízes formadas, é possível observar (gráfico 3) que no meio

MS+2BAP não houve qualquer formação de raízes e que houve a formação do mesmo
número de raízes nos meios MS+1BAP e MS+2BAP+0,2NAA, com 4 raízes totais
formadas. É possível verificar também que o meio com maior formação de raízes foi

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o meio MS, com 17 raízes totais formadas. Estes resultados estão de acordo com os
conhecimentos teóricos que nos indicam que a citocinina inibe a formação de raízes.

Gráfico 3 - Efeito do meio de cultura no número de raízes, na planta pitaya

De acordo com a análise estatística verificamos que o p-value é igual a zero quando se
comparam os resultados obtidos entre o meio MS suplementado com 1 mg/L de BAP
e com 2mg/L de BAP e 0,2mg/L de NAA. Por outro lado, verifica-se que ocorreram
diferenças significativas (P-value<0,05) quando se comparam os resultados obtidos
entre todos os meios. O efeito do meio de cultura foi significativo para a formação de
novas raízes (P-value=0,0211).

O melhor meio para a formação de raízes é o meio MS. Ao contrário de Pereira et al.
(2000) que, no seu estudo realizado com Echinodorus cf. scaber, uma planta
medicinal nativa do Brasil, demonstraram que o meio MS suplementado com 1mg/L
de BAP apresentou o maior número de formação de raízes.

 Efeito no comprimento das raízes

Relativamente ao gráfico 4, é possível verificar que, dos meios onde houve formação
de raízes o meio MS, sem nenhum regulador de crescimento, foi o que registou maior
comprimento das mesmas com uma média de 1,89mm. Os meios MS+1BAP e
MS+2BAP+0,2NAA registaram, em média, um alongamento das raízes igual, com
uma média de 1,33mm.

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Gráfico 4 - Efeito do meio de cultura no comprimento das raízes (mm), na planta pitaya

Após a análise estatística verifica-se que o p-value é igual a zero quando se comparam
os resultados obtidos nos meios MS suplementado com 1mg/L de BAP e MS
suplementado com 2mg/L de BAP e 0,2mg/L de NAA, visto que a média de
alongamento das raízes nos mesmos é igual. Por outro lado, verifica-se que ocorreram
diferenças significativas (P-value<0,05) quando se comparam os resultados obtidos
entre todos os meios. O efeito do meio de cultura foi altamente significativo para o
comprimento das raízes (P-value<0,0001).

O melhor meio para o alongamento das raízes formadas é o meio MS, sem nenhum
regulador de crescimento. Khaleghi et al. (2008) verificaram também que, as raízes
apresentam maior desenvolvimento em comprimento na ausência de BAP no meio.

 Efeito no número de raízes adventícias

No que diz respeito ao número de raízes secundárias, é possível observar que tanto no
meio MS+1BAP quanto no meio MS+2BAP não houve formação de raízes
adventícias e no meio MS+2BAP+0,2NAA apenas houve a formação de uma raíz
secundária.
O meio MS foi o meio com maior formação de raízes adventícias.

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Gráfico 5 - Efeito do meio de cultura no número de raízes secundárias, na planta pitaya

Após a análise estatística verifica-se que o p-value é igual a zero quando se comparam
os resultados obtidos entre o meio MS suplementado com 1mg/L de BAP e o meio
MS suplementado com 2mg/L de BAP, visto que em ambos os meios não houve
formação de nenhumas raízes secundárias. Por outro lado, verifica-se que ocorreram
diferenças significativas (P-value<0,05) quando se comparam os resultados obtidos
entre todos os meios de cultura. O efeito do meio de cultura foi altamente
significativo para a formação de novas raízes adventícias (P<0,0001).

O melhor meio para a formação de raízes adventícias é o meio MS.

3.2. Efeito do tempo, em semanas, na micropropagação da planta Pitaya

Tabela 2 - Número e comprimento médios de rebentos e raízes, e número médio de raízes

secundária, em função da semana.

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Figura 1 - Evolução do crescimento dos explantes de pitaya ao longo das 6 semanas de
estudo (A- Semana nº1; B- Semana nº2; C- Semana nº3; D- Semana nº4; E- Semana nº5; F-
Semana nº6)

 Efeito no número de rebentos

Gráfico 6 - Efeito do tempo, em semanas, no número de rebentos na planta pitaya

Quanto ao número de rebentos formados (Gráfico 6), é possível observar que o

número de rebentos formados aumenta com o decorrer do tempo e que o

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desenvolvimento dos mesmos ocorre de imediato na primeira semana com um total de
14 rebentos formados. O número de rebentos na última semana é de 81.

De acordo com a análise estatística verificamos que as diferenças são significativas

quando se comparam os valores obtidos em todas as semanas.

O efeito do tempo foi altamente significativo para a formação de novos rebentos (P-
value<0,0001).

 Efeito no comprimento dos rebentos

Gráfico 7 - Efeito do tempo, em semanas, no comprimento dos rebentos(mm,) na planta

pitaya
No gráfico 7, é possível verificar um aumento gradual no comprimento dos rebentos
ao longo das seis semanas, atingindo um comprimento total de 262mm na última
semana, o que representa um aumento de 231mm em relação à primeira semana.

Após a análise estatística verifica-se que as diferenças são significativas quando se

comparam os resultados obtidos em todas as semanas. O efeito do tempo foi
altamente significativo para o comprimento dos rebentos (P-value<0,0001).

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 Efeito no número de raízes

Gráfico 8 - Efeito do tempo, em semanas, no número de raízes na planta pitaya

No que diz respeito ao gráfico 8, ou seja, ao número de raízes formadas é possível

observar que houve desenvolvimento radicular logo na primeira semana, com a
formação de 18 raízes. Verifica-se também que houve um aumento gradual na
formação das mesmas ao longo das seis semanas, sendo que na 6ª semana se
registaram 38 raízes.

De acordo com a análise estatística verificamos que as diferenças não são

significativas quando se comparam os resultados obtidos ao longo das seis semanas.
O efeito do tempo não foi significativo (P-value=0,2457) para a formação de raízes.

 Efeito no comprimento das raízes

Relativamente ao gráfico 9, é possível verificar um aumento do comprimento das

raízes ao longo do tempo, com um comprimento total de 39mm na primeira semana e
869mm na sexta e última semana.

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Gráfico 9 - Efeito do tempo, em semanas, no comprimento (mm) das raízes na planta pitaya.

Após a análise estatística verifica-se que as diferenças são significativas (P-

value<0,05) quando se comparam os resultado obtidos desde a primeira à sexta
semana.

O efeito do tempo foi altamente significativo (P-value=0,0006) para o crescimento,

em comprimento, das raízes.

 Efeito no número de raízes adventícias

Gráfico 10 - Efeito do tempo, em semanas, no número de raízes adventícias na planta Pitaya

No gráfico 10, é possível observar que o desenvolvimento das raízes secundárias

apenas ocorreu a partir da 4ª semana, com 10 raízes adventícias formadas e que a

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partir desta semana houve um aumento na formação das mesmas, com um total de 35
raízes secundárias registadas na última semana.
De acordo com a análise estatística verifica-se que o valor do p-value é igual a zero
quando se comparam os valores entre as três primeiras semanas, devido ao facto de
que não houve formação de raízes adventícias nesse período de tempo. Observa-se
também que as diferenças são significativas (P-value<0,05) quando se comparam os
resultados obtidos em todas as semanas. O efeito do tempo foi significativo para a
formação de novas raízes adventícias (P-value=0,0019).

Verifica-se que a presença de NAA no meio foi relevante, apenas na formação de

novos rebentos. Kristiansen et al. (1999) concluíram que o NAA promove a indução
de raízes, enquanto o BAP inibe a formação das mesmas. No entanto, esta auxina por
si só não consegue contrariar o efeito inibitório do BAP no enraizamento. O mesmo
se observou no nosso estudo, visto que o meio com presença de NAA apresentou
resultados muito similares aos meios com presença de BAP mas ausência da auxina,
no que diz respeito aos parâmetros relacionados ao enraizamento dos explantes.

É possível observar que, na micropropagação os reguladores de crescimento

desempenham um papel crucial na indução e controle do crescimento de tecidos
vegetais. Quando utilizados nas concentrações adequadas para cada espécie e
combinados corretamente, estes permitem controlar o desenvolvimento das plantas
em cultura de tecidos, estimulando a multiplicação celular, o enraizamento e o
desenvolvimento de rebentos. Os reguladores vegetais tornam, então, o processo de
micropropagação mais rápido e eficaz, permitindo a produção em massa de plantas
num curto espaço de tempo.

4. Conclusão

A técnica de cultura in vitro demonstrou ser eficiente para o estudo conduzido, pois
proporcionou uma rápida resposta no crescimento e desenvolvimento de todos os
parâmetros analisados, apesar da presença de infeção fúngica e bacteriana em parte
dos explantes.

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Os dados obtidos permitem-nos chegar à conclusão que dos meios de cultura em
estudo, o que mostrou ser mais eficaz para a formação de novos rebentos foi o meio
MS suplementado com 2mg/L de BAP e 0,2mg/L de NAA. O meio no qual os
rebentos apresentaram maior alongamento foi o meio MS suplementado com 2mg/L
de BAP. O meio mais eficiente para a formação de novas raízes e alongamento das
mesmas foi o meio MS, sem nenhum regulador de crescimento. Na formação de
novas raízes adventícias, o meio que mostrou ter mais eficiência foi, também, o meio
MS, sem nenhum regulador de crescimento.

Também podemos concluir que ao longo das 6 semanas, a planta não esgotou os seus
nutrientes, pois houve um crescimento gradual em todos os parâmetros analisados.

5. Referências bibliográficas

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18
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