Capítulo 10

Ecologia, Isolamento e Identificação

de Bactérias Diazotróficas

Veronica Massena Reis

Vera Lúcia Divan Baldani
José Ivo Baldani

Introdução

Os microrganismos que usam nitrogênio na forma de gás como

substrato para a enzima nitrogenase são conhecidos como fixadores de
nitrogênio ou diazotróficos. Esses microrganismos pertencem à classe
das bactérias e, dentre estas, vários gêneros foram descritos durante
mais de 30 anos de pesquisa. A Embrapa Agrobiologia tornou-se
conhecida mundialmente pelas pesquisas desenvolvidas com bactérias
diazotróficas associadas a gramíneas, principalmente cereais, como
trigo, arroz, milho, sorgo; gramíneas forrageiras, como capim Braquiária
(Brachiaria spp.), capim-elefante (Pennisetum purpureum), e principal-
mente pela pesquisa desenvolvida com a cana-de-açúcar (Saccharum spp.)

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 258 Capítulo 10

liderada pela pesquisadora Johanna Döbereiner. Faz-se necessário

enfatizar que essas bactérias podem colonizar diversas famílias vegetais,
e relatos de isolamento desses microrganismos de solo, água e de insetos,
embora escassos, também são encontrados na literatura.
Até bem recentemente, a identificação microbiana requeria o
isolamento em culturas puras seguidas de uma bateria de testes
fisiológicos e bioquímicos. Entretanto, o uso de contagem em placas
contendo meios de cultivo não representa o que realmente se visualiza,
quando se utilizam amostras de solo ou planta e avalia-se a presença
de microrganismos diretamente do microscópio marcados com corantes
específicos para componentes celulares. Os meios de cultivo, por mais
ricos que sejam, não são capazes de permitir o crescimento de todos os
microrganismos presentes numa amostra.
Dois diferentes tipos de células contribuem para este fenômeno:
espécies conhecidas, onde as condições aplicadas não permitem o seu
crescimento ou estão num estado não cultivável; espécies não
conhecidas que nunca foram cultivadas por não se conhecer o método
adequado (AMANN et al., 1996). Embora isso estimule a busca de
condições de “culturabilidade” e, conseqüentemente, de novas
formulações para acessar essa imensa diversidade natural, o uso de
meios de cultivo de células bacterianas é muito antigo.
A busca para acessar essa diversidade foi a responsável pelo
desenvolvimento de vários métodos baseados na amplificação de
seqüências a partir de amostras do ambiente. Isso revolucionou a
estratégia de ação de estudo que antes era baseado apenas em
microrganismos cultivados em formulações sintéticas. Hoje, sabemos
a seqüência de microrganismos que são descritos como espécies
novas, mas sem que um único indivíduo tenha sido cultivado. Atualmente,
a classificação filogenética de microrganismos tem se baseado no
conjunto de métodos necessários e tem sido chamada de análise polifá-
sica que inclui métodos fenotípicos e genotípicos. Estima-se que 99%
de diversidade de microrganismos é desconhecida. Em 2001, com a
nova validação de espécies e gêneros (a última foi em 1980), 4.518
espécies foram divididas em 998 gêneros, perfazendo um número médio
de 4,5 espécies para cada gênero (maiores detalhes veja YOUNG,
2001).

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 Ecologia, Isolamento e Identificação de Bactérias Diazotróficas 259

Funcionalidade versus localização

Em questão de funcionalidade, vários autores discutem onde esses

microrganismos poderiam fazer a diferença em termos de contribuição
para a nutrição nitrogenada das plantas. Até o final da década de 90,
bactérias diazotróficas eram estudadas somente com o enfoque da
localização radicular e, no caso das associativas, como o próprio nome
diz, a superfície ou rizosfera era o alvo principal das análises. Em 1992,
a presença desses organismos em amostras de colmos de cana-de-açúcar
e a contagem desses em números maiores de 10 mil células de tecido
coletado do interior dos colmos de cana-de-açúcar deu início aos estudos
onde o ponto-alvo era a localização interna nas plantas avaliadas. A
partir daí foi usado o termo endófito, isto é, bactéria localizada dentro
do tecido vegetal. Esse termo foi baseado em trabalhos de outros grupos
que não incluem bactérias diazotróficas. Döbereiner foi a primeira a
usar esse termo para o caso desses microrganismos.
Kloepper et al. (1997) descrevem que bactérias endofíticas são
aquelas que podem ser isoladas de tecidos vegetais superficialmente
desinfestados ou extraídas de dentro da planta, e que não causam danos
visíveis ou induzem sintomas na planta. Fica claro, portanto, que
bactérias com capacidade para se estabelecer endofiticamente em
tecidos vegetais devem ser enquadradas em algumas regras:
• A bactéria deve ser capaz de invadir e proliferar nos tecidos
da planta hospedeira, desenvolvendo mecanismos para ultra-
passar as barreiras físicas e químicas desenvolvidas pela planta
(mecanismos constitutivos e induzíveis), estabelecendo vias de
infeção e colonização, bem como os sítios de estabelecimento.
• A bactéria não deve induzir uma resposta drástica da planta à
infeção (resposta hipersensível), caracterizada pela morte
rápida e necrose das células ao redor do ponto de infeção,
impedindo a colonização dos tecidos.
• A bactéria deve possuir um padrão de colonização modelado
pela planta hospedeira, uma vez que a multiplicação massiva
e/ou hiperativação de genes de virulência pode colapsar os

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tecidos, induzindo sintomas na planta e conseqüentemente

estabelecendo uma interação patogênica.
• No caso de interações mais evoluídas, a bactéria deve seguir
o ciclo de vida da planta hospedeira, desenvolvendo mecanis-
mos para colonizar sementes ou estruturas de propagação
vegetativa.
Baldani et al. (1997a) propuseram a distinção em endófito
facultativo e obrigatório, diferenciando respectivamente bactérias
capazes de sobreviver no solo e estabelecer-se nas raízes, daquelas
com baixa capacidade de sobreviver no solo e capazes de colonizar
raízes e parte aérea. Para diferenciar os endófitos diazotróficos daqueles
microrganismos com capacidade de infectar as raízes e que possuem o
solo como um hábitat alternativo, Reinhold-Hurek & Hurek (1998)
sugeriram o termo “endófito oportunista”.
Estudos envolvendo o processo de infeção e colonização, vias de
dispersão sistêmica, bem como os sítios de estabelecimento e atividade
das bactérias diazotróficas endofíticas em gramíneas, são ainda bastante
escassos, principalmente com relação a plantas crescendo em condições
de campo. A ferramenta fundamental para responder a questões básicas
do estabelecimento endofítico é a microscopia ótica e eletrônica de
caráter descritivo associada a microanálise. Além da microscopia, outras
técnicas, como por exemplo as técnicas imunológicas e genéticas,
devem ser usadas para rastrear bactérias, genes, enzimas e/ou
metabólitos induzidos pela interação bactéria-planta.
Deixando de lado o caráter endófito de algumas espécies, este
capítulo irá abordar a ecologia, as diferenças morfológicas e as técnicas
de isolamento e contagem das bactérias fixadoras de nitrogênio
estudadas atualmente pelo grupo da Embrapa Agrobiologia.

Ecologia das bactérias fixadoras de nitrogênio

estudadas pelo grupo da Embrapa Agrobiologia

O descobrimento de duas espécies do gênero Azospirillum:

A. lipoferum e A. brasilense no final da década de 70 deve-se
principalmente à introdução do meio de cultivo semi-sólido NFb, sem

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 Ecologia, Isolamento e Identificação de Bactérias Diazotróficas 261

nitrogênio. Mais tarde, outra espécie foi descrita usando esse mesmo
meio de cultivo, o Azospirillum amazonense. Entretanto, o seu cresci-
mento nesse meio era prejudicado pela melhor adaptabilidade das duas
espécies isoladas anteriormente. Sendo assim, uma modificação da fonte
de carbono de malato para sacarose, aumento da concentração de
tampão e concomitante redução do pH final foram os fatores seletivos
usados para favorecer o isolamento e a contagem dessa espécie, o que
resultou no meio semi-sólido LGI. Esse é um exemplo de como a pesquisa
evolui para adaptar o conhecimento da fisiologia do microrganismo novo
e aplicá-lo em metodologias que permitam a sua detecção de forma
mais barata, rápida e seletiva. Mas, antes disso, vamos conhecer um
pouco da distribuição ecológica de várias espécies de bactérias
diazotróficas.

Gênero Azospirillum

O gênero Azospirillum inclui atualmente seis espécies descritas,

mas apenas 5 são fixadoras de nitrogênio, incluindo a mais nova espécie
descrita, A. doebereinerae, em homenagem a Johanna Döbereiner
(ECKERT et al., 2001). As duas espécies primeiramente classificadas na
década de 70 são as mais estudadas, sendo A. brasilense a que acumula
o maior número de publicações durante essas últimas 3 décadas e pode
ser considerada como um modelo de estudo nessa área de pesquisa.
A distribuição ecológica de Azospirillum é extremamente ampla e
variada (DÖBEREINER; PEDROSA, 1987). Bactérias desse gênero têm
sido encontradas em associação com plantas monocotiledôneas e
dicotiledôneas, sendo por isso consideradas ubíquas (BASHAN;
HOLGUIN, 1997). Entretanto, algumas peculiaridades são observadas
na ocorrência das espécies de Azospirillum em associação com plantas
da família Gramineae. As espécies A. lipoferum e A. brasilense são as
mais freqüentemente encontradas colonizando a maioria das plantas
de regiões tropicais e temperadas, chegando a ser isoladas de gramíneas
crescidas em locais gelados como o Ártico (NOSKO et al., 1994). A maioria
dos isolados tem sido obtida de plantas de maior interesse agronômico
como milho, arroz, sorgo e trigo (BALDANI, 1984; BALDANI et al.,
1997a). Essa espécie também foi predominante em raízes e folhas da
forrageira Miscanthus sinensis cv. Giganteus, cultivada na Alemanha,

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(KIRCHHOF et al., 1997b) e na seiva de 91 genótipos de milho crescidos

no campo (MARRIEL; CARDOSO, 1998). A espécie A. amazonense,
inicialmente isolada de gramíneas forrageiras e da palmeira Bactrix
grassipus (MAGALHÃES et al., 1983), apresenta uma distribuição bastante
ampla, incluindo cereais como milho, sorgo, arroz (BALDANI, 1984) e
cana-de-açúcar (raízes, caules e folhas) que, juntamente com as espécies
A. lipoferum e A. brasilense, são detectadas em altos números, podendo
chegar até a 107 células por grama de tecido analisado (BALDANI et al.,
1986b). Apesar da sua ampla ocorrência, o isolamento da espécie
A. amazonense tem se restringido a plantas crescidas em algumas
regiões do Brasil, exceto por sua detecção em amostras de plantas de
cana-de-açúcar cultivadas no Havaí e na Tailândia (DÖBEREINER,
1992ab). As demais espécies do gênero possuem distribuição ecológica
muito mais restrita. Recentemente, Reis et al., (2001) apresentaram um
estudo da presença de Azospirillum em três genótipos de Brachiaria
colhidos de duas localidades do Brasil, Mata Atlântica e Cerrado, e
verificaram que o maior número de isolados obtidos pertencia à espécie
A. amazonense. Vale ressaltar que, das três espécies, essa é a mais
adaptada a pH baixo, condição essa predominante em solos tropicais.
Já A. halopraeferens foi isolado somente do rizoplano e raízes da
gramínea Kallar grass (Leptochloa fusca L.) crescida em solos salinos
no Paquistão, e nenhum estudo posterior detectou a sua presença
(REINHOLD et al., 1987). Da mesma forma, A. irakense só foi encontrado
em amostras do solo da rizosfera e de raízes de plantas de arroz
cultivadas no Iraque (KHAMMAS et al., 1989). A mais nova espécie de
Azospirillum, denominada A. largimobile, tem sua ocorrência restrita
às águas de um lago na Austrália (DEKHIL et al., 1997) e não está descrita
como fixadora de nitrogênio. Muito pouco se conhece sobre a ecologia
da nova espécie A. doebereinerae em virtude de sua recente descrição
(ECKERT et al., 2001).

Gênero Herbaspirillum

O gênero Herbaspirillum é representado por cinco espécies, sendo

três descritas no Brasil: H. seropedicae isolado de gramíneas pelo grupo
da Embrapa Agrobiologia e descrito em 1986 (BALDANI et al., 1986a),

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H. rubrisubalbicans foi proposto em 1996 utilizando isolados depositados

em coleção de culturas (GILLIS et al., 1995), e o mais novo destes, o
H. frisinguense, que engloba isolados de gramíneas plantadas no Brasil
(Pennisetum purpureum) e na Alemanha (Miscanthus spp. e Spartina
spp.) (KIRCHHOF et al., 2001). Existe um último grupo chamado grupo 3,
que não representa uma espécie e é constituído de isolados não fixadores
e por isso não será incluído nesta revisão (GILLIS et al., 1995).
O Herbaspirillum seropedicae tem sido isolado da maioria das
gramíneas examinadas, tais como milho, sorgo, arroz, forrageiras e cana-
de-açúcar, cultivadas no Brasil. Mais recentemente, a mesma espécie
foi isolada de raízes, caules e folhas de cana-de-açúcar cultivada na
Austrália (BODDEY et al., 1998). Os estudos têm demonstrado que o
H. seropedicae apresenta uma baixa sobrevivência quando inoculado
no solo natural ou esterilizado e monitorado por meio de contagem em
meio JNFb semi-sólido (OLIVARES et al., 1996). Os autores, entretanto,
conseguiram reisolar a bactéria do solo quando sementes de sorgo
esterilizadas (livres de bactérias) foram germinadas neste solo, e a
população de bactérias diazotróficas presentes nas plântulas foi avaliada
em meio semi-sólido JNFb, sugerindo que a bactéria pode estar em
estágio viável, mas não culturável no solo. Essa pode ser uma das razões
de a mesma ter sido inicialmente isolada de solo de rizosfera de milho,
sorgo e arroz (BALDANI et al., 1986a) e mais recentemente de diversas
gramíneas cultivadas em solo contaminado com metais pesados, mas
não em solo desnudo (LANGE et al., 1998).
A outra espécie do gênero Herbaspirillum, H. rubrisubalbicans,
tem sido encontrada associada a plantas de cana-de-açúcar e de raízes
da erva daninha Digitaria insularis, crescida no interior da plantação
de cana-de-açúcar (OLIVARES et al., 1996). Por ser uma bactéria causadora
da doença estria-mosqueada na variedade de cana-de-açúcar B-4362,
hoje erradicada dos canaviais brasileiros, sua detecção tem sido bastante
restrita.
Já H. frisinguense foi descrito recentemente utilizando amostras
de tecido de raízes e colmos de diversos genótipos de capim-elefante
(Pennisetum purpureum Schum.) em um experimento conduzido na
Embrapa Agrobiologia e em amostras de duas gramíneas Miscathus e
Spartina plantadas na Estação Experimental do GSF, centro de pesquisa

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voltado para a saúde e desenvolvimento agrícola localizado na cidade

de Friesing, Alemanha.

Gênero Gluconacetobacter

As espécies de bactéria pertencentes à família Acetobacteriaceae

são caracterizadas fenotipicamente pela habilidade de crescer em
pH baixo e oxidar etanol a ácido acético (DE LEY, 1992, SWINGS,
1992). Historicamente, era dividida em dois gêneros: Gluconobacter
e Acetobacter. Nos últimos anos, várias modificações ocorreram e a
última atualização da classificação filogenética dessa família permitiu
a divisão entre quatro gêneros: Acetobacter, Gluconobacter, Gluco-
nacetobacter e Acidomonas baseado na análise parcial da seqüência
de pares de base da subunidade 16 S do RNA ribossomal (YAMADA
et al., 1997). A partir dessa reorganização, a espécie Acetobacter
diazotrophicus foi transferida para o novo gênero Gluconacetobacter
(YAMADA et al., 1998).
Gluconacetobacter diazotrophicus foi isolada inicialmente de
cana-de-açúcar (CAVALCANTE; DÖBEREINER, 1988) e posteriormente
encontrada associada a batata-doce (PAULA et al., 1993), Pennisetum
purpureum (Reis et al., 1994), café (JIMENÉZ-SALGADO et al., 1997),
abacaxi (TAPIA-HERNÁNDEZ et al., 2000), insetos como cochonilhas,
que habitam a bainha foliar da cana-de-açúcar (FRANKE et al., 1999),
e o cereal Eleusine coracana, plantado na Índia (LOGANATHAN et al.,
1999). Ao longo desses anos a sua presença tem sido observada em
raízes, caules e folhas de plantas de cana-de-açúcar cultivadas no Brasil,
assim como de plantas cultivadas na Argentina, Uruguai, México, Cuba,
Estados Unidos e Austrália (BALDANI et al., 1997a, LI; MACRAE, 1992).
Foi também isolada do fluido do apoplasto de cana-de-açúcar cultivada
no Canadá (DONG et al., 1994). Entretanto, nas amostras de café, outras
bactérias de crescimento semelhante a G. diazotrophicus foram isoladas
e dois novos grupos foram identificados e classificados como novas
espécies de Gluconacetobacter fixadoras de nitrogênio: G. johannae e
G. azotocaptans (FUENTES-RAMIREZ et al., 2001), perfazendo um total
de três espécies diazotróficas descritas nessa família.

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Por ser uma bactéria que possui uma sobrevivência muito baixa
no solo (BALDANI et al., 1997a), é bem provável que a via principal de
transmissão seja o tolete de cana-de-açúcar, muito embora o palhiço
da própria cultura não deve ser descartado como uma fonte alternativa
de inóculo quando incorporado ao solo (BALDANI et al., 1998).
Um argumento a favor dessa possibilidade é a detecção recente por
meio da técnica de imunocaptura, mas não da contagem do número
mais provável do G. diazotrophicus em plantas adultas (oriundas de
micropropagação), cultivadas no campo (REIS JÚNIOR, 1998).
Outras possibilidades seriam por meio de esporos de fungos
micorrízicos arbusculares presentes no solo, já que a bactéria foi
detectada colonizando os mesmos, principalmente em experimentos
de inoculação em vasos (PAULA et al., 1993) ou pela contaminação
ocorrida no momento da sucção da seiva do floema por cochonilhas
que vivem dentro da bainha foliar das plantas de cana-de-açúcar e que
possuem essa bactéria dentro da linfa (ASHBOLT; INKERMAN, 1990).
Caballero-Mellado & Martinez-Romero (1994) levantaram a hipótese
de que esse inseto é o responsável pela dispersão dessa espécie a curta
distância e que o tolete transporta a bactéria para as regiões onde a
cana-de-açúcar foi importada.

Gênero Burkholderia

Por sua vez, o gênero Burkholderia tem sido isolado de diversas

plantas, como por exemplo, arroz, mandioca, batata doce e cana-de-
açúcar (OLIVEIRA, 1992; BALOTA, 1994; BALDANI, 1996b). A mesma
ainda não foi encontrada em associação com outros cereais e sua
presença em outras gramíneas forrageiras ainda não foi explorada.
Os resultados obtidos até o momento apontam o arroz como uma das
plantas que apresenta elevada ocorrência deste gênero (CAMPOS et al.,
1998). Uma análise recente dos isolados obtidos de cana-de-açúcar
mostrou a existência de um novo gênero de Burkholderia colonizando
essa planta, denominada B. tropica (REIS et al., 2004). Isolados com
características semelhantes a essa espécie foram obtidos de plantas
micropropagadas de cana-de-açúcar cultivadas em solo oriundo de

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 266 Capítulo 10

canavial (ARCANJO et al., 2000) e de plantas de cana-de-açúcar adultas

cultivadas na Austrália (BODDEY et al., 1998).

Características morfológicas das espécies

Azospirillum spp.

O gênero Azospirillum foi definido por Tarrand et al. (1978) e

hoje compreende seis espécies, A. brasilense e A. lipoferum
(TARRAND et al., 1978), A. amazonense (MAGALHÃES et al., 1983),
A. halopraeferens (REINHOLD et al., 1987), A. irakense (KHAMMAS
et al., 1989) e A. largimobile (DEKHIL et al., 1997), caracterizadas
com base na análise fenotípica e genotípica (homologia DNA:DNA e
seqüência da rRNA 16S). O seqüenciamento da rRNA 16S mostrou a
formação de dois subgrupos distintos: o primeiro subgrupo é formado
pelas espécies A. lipoferum, A. brasilense, A. halopraeferens e
A. largimobile, e as duas primeiras espécies apresentam um alto grau
de similaridade genética; o outro subgrupo é formado pelas espécies
A. amazonense e A. irakense. Entretanto, por não apresentarem
características genéticas divergentes que justifiquem a criação de novo
gênero, os mesmos continuam a fazer parte do gênero Azospirillum
(DEKHIL et al., 1997). Algumas características fisiológicas possibilitam
distinguir as espécies de Azospirillum e têm sido usadas como base
para os estudos de isolamento e pré-identificação nos laboratórios.
Tanto a espécie A. lipoferum como A. brasilense utilizam malato como
fonte de carbono, mas somente a primeira consegue utilizar glicose,
necessita de biotina como fator de crescimento e forma células
pleomórficas em meio alcalino (BALDANI et al., 1997a). As duas
espécies também têm a habilidade para produzir fito-hormônios como
AIA. Os genes para a biossíntese desse fito-hormônio foram encontrados
também em A. amazonense, mas não em A. irakense e A. halopraeferens
(VANDE BROEK; VANDERLEYDEN, 1995). A habilidade para utilizar
sacarose é a principal característica de A. amazonense e A. irakense,
embora somente a primeira espécie seja capaz de crescer em pH

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 Ecologia, Isolamento e Identificação de Bactérias Diazotróficas 267

mais ácido, e, para as demais espécies do gênero, o pH ótimo de

crescimento está próximo da neutralidade. A. halopraeferens e
A. largimobile utilizam o malato como principal fonte de carbono, porém
manitol também é usado. A temperatura ótima para crescimento está
entre 32oC e 37oC, entretanto, A. halopraeferens tem um crescimento
ótimo a 41oC e possui tolerância a condições salinas. Já A. largimobile
apresenta uma temperatura ótima de crescimento ao redor de 28oC.
Uma característica interessante da espécie A. irakense é a capacidade
de hidrolisar pectina e também de tolerar altas concentrações de sais
(KHAMMAS et al., 1989) como já observado para o A. halopraeferens
(REINHOLD et al., 1987). O seqüenciamento da rRNA 16S e 23S
permitiu o desenvolvimento de sondas para a identificação de estirpes
da maioria das espécies de Azospirillum através da hibridização com
o DNAr (KIRCHHOF et al., 1997a), com exceção da espécie
A. largimobile, descrita muito recentemente.

Herbaspirillum spp.

No caso das espécies do gênero Herbaspirillum, existem

dificuldades para distinguir as duas espécies já conhecidas. Além
disso, o isolamento do Herbaspirillum é dificultado, uma vez que
pode ser confundido com Azospirillum, principalmente aquelas
bactérias capazes de tolerar o pH inicial mais ácido do meio JNFb.
Desse modo, a formação de película no meio JNFb, per si, não indica
a presença de bactérias das espécies de Herbaspirillum. A separação
das duas espécies só é possível após a purificação das colônias em
meio JNFb contendo três vezes a concentração de azul de bromotimol
(as colônias ficam azuladas) e crescimento em meio com meso-
eritritol e N-acetilglucosamina. O H. seropedicae usa a N-acetilglu-
cosamina, mas não a primeira fonte de carbono, enquanto o oposto
ocorre com estirpes da espécie H. rubrisubalbicans. O uso de sondas
específicas desenvolvidas para diferenciar as espécies (BALDANI
et al., 1996a) podem ser usadas para confirmar a que espécies
pertencem os isolados.

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 268 Capítulo 10

Gluconacetobacter spp.

No caso do Gluconacetobacter diazotrophicus, o meio de cultivo

LGIP permite o crescimento, quase que exclusivo, da bactéria-alvo,
tendo em vista a alta concentração de açúcar cristal (10% - 100 g L-1) e
do baixo valor do pH do meio (5,5 a 5,7). No meio LGIP sólido, as
colônias são alaranjadas, porém a formação de colônias cor chocolate
em meio batata-P é uma característica que as distingue facilmente de
qualquer outra bactéria diazotrófica endofítica caracterizada até o
momento. Embora cresça e metabolize a sacarose, essa bactéria não
usa diretamente esse açúcar como fonte de carbono, já que nenhum
sistema de transporte de sacarose foi detectado em G. diazotrophicus
(MARTINEZ–DRETZ, 1995). A autora demonstrou a necessidade de uma
enzima extracelular com atividade sacarolítica para que a mesma seja
metabolizada. Um aspecto interessante dessa bactéria refere-se à sua
capacidade de crescer e fixar nitrogênio em presença de nitrato e ser
parcialmente inibida por amônia (STEPHAN et al., 1991), principalmente
na presença de altas concentrações de sacarose (REIS & DOBEREINER,
1998).

Burkholderia spp.

Este gênero inclui mais de 30 espécies descritas. Dentre as espécies

fixadoras de nitrogênio desse grupo, muito pouco se sabe, pois a maioria
dos laboratórios que a estudam não está relacionada com atividades
agrícolas. Sabe-se que B. vietnamiensis e um isolado de B. kururiensis,
o KP 23, são capazes de reduzir nitrogênio a amônio (ESTRADA DE
LOS-SANTOS et al., 2001; BALANDREAU et al., 2001). Isso não implica
que essa habilidade esteja presente em outras espécies, faltando apenas
testá-las, e que mesmo algumas estirpes o façam.
Na Embrapa Agrobiologia, as duas espécies de bactérias perten-
centes ao gênero Burkholderia, B. brasilensis e B. tropica têm como
meio semi-seletivo o JMV semi-sólido, que usa manitol como fonte de
carbono e pH ao redor de 5,0. Esse meio, acrescido de 100 mg L-1 de

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 Ecologia, Isolamento e Identificação de Bactérias Diazotróficas 269

extrato de levedura, tem permitido o isolamento dessa bactéria,

principalmente B. brasilensis. As células são encapsuladas e podem
apresentar de 1 a 4 flagelos polares. As colônias em meio JMV são de
pequenas a médias, úmidas, esbranquiçadas, com o centro amarelado.
Na presença de extrato de levedura (20 a 100 mg L-1) ocorre um aumento
da atividade da nitrogenase e favorecimento da divisão celular. Ambas
são capazes de crescer em meio contendo 50 g L-1 de açúcar cristal,
mas somente B. tropica tolera 100 g L-1 desse açúcar, usando a formu-
lação do meio LGI-P.

O que se precisa para formular um meio de

cultivo semi-seletivo para bactérias diazotróficas

Meios de cultivo variam em grau de seletividade, isto é, utilizam-

se de substâncias ou condições que separam parte da população nativa
de um certo hábitat pela capacidade de adaptação. No caso de
bactérias diazotróficas, o primeiro filtro seletivo é a supressão de formas
de nitrogênio inorgânio. A partir daí, podemos ter outras variações,
como de pH, osmolaridade, adição de fungistáticos, etc., sempre
visando ao crescimento da bactéria-alvo a partir de amostras de plantas
e solo.
Além de água, a formulação de um meio de cultivo para bactérias
diazotróficas requer: uma ou mais fontes de carbono, um tampão
(geralmente o fosfato), sais que complementam as necessidades celulares
de crescimento tanto para macronutrientes como fósforo (P), potássio
(K), cálcio (Ca), magnésio (Mg), enxofre (S) etc., como para
microelementos como ferro (Fe), boro (B), zinco (Zn), sódio (Na) etc., e,
no caso de bactérias diazotróficas, o molibdênio é incluído, já que é
componente estrutural da nitrogenase, enzima responsável pela redução
do N gasoso. Além desses elementos, também pode-se fazer uso de
indicadores de viragem de pH, como o azul de bromotimol, vitaminas e
mistura de compostos orgânicos, como o extrato de levedura, extratos
de planta, caldo de cana-de-açúcar, entre outros. O equilíbrio químico
dessas soluções deve ser mantido de forma a favorecer a célula a
assimilar tais componentes, isto é, alta osmolaridade ou condições

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 270 Capítulo 10

extremas de cultivo (como mudança de pH, uso de fungistáticos e

antibióticos, entre outros) devem ser testadas para não restringir a
multiplicação. Soluções com grandes quantidades de açúcar aumentam
a osmolaridade da solução, mas podem ser úteis no caso de se procurar
microrganismos de hábitats específicos e mesmo extratos de plantas,
como uso do caldo de cana-de-açúcar (LGI-P) ou partes destas, como o
uso de batata inglesa cozida (meio batata) podem inserir compostos
ricos em diversas substâncias orgânicas comparáveis ao extrato de
levedura e alguns fatores de crescimento não especificados.
Os meios de cultivo são conhecidos pelas siglas e alguns deles
são conhecidos universalmente em virtude de sua abrangência, como
o caso do NB - caldo nutritivo (NB = Nutriente Broth), meio LB (Luria
Bertani) etc., e podem ser vendidos por diversos laboratórios.
A consistência do meio de cultivo é obtida por meio da adição de
agentes solidificantes como o agar-agar, que nada mais é que uma
gelatina. Meios sólidos, usados em placas de vidro chamadas Petri,
servem para visualização de colônias e, na forma semigelificada ou
semi-sólida, a concentração é reduzida em torno de dez vezes a da
usada nos meios sólidos. Vale ressaltar esse ponto, pois o meio semi-
sólido sem adição de nitrogênio é o pré-requisito básico que faz a
diferença na formulação dos meios de cultivo. Esses meios permitem
que a bactéria inoculada comece a se multiplicar numa condição ótima
de oxigênio dissolvido na solução, que é baixa (no fundo do tubo é
próxima a zero e vai aumentando conforme a distância da superfície),
permitindo a divisão celular dos microrganismos aeróbios, mas não inibe
a síntese ou manutenção da atividade da nitrogenase existente, que só
é funcional em anaerobiose (sem oxigênio).
Essa modificação do meio sólido para semi-sólido permitiu um
avanço no isolamento desses microrganismos a partir da década de
70 e até hoje as diversas formulações descritas são usadas para isolar
bactérias conhecidas e novas espécies, permitindo que a pesquisa da
fixação biológica de nitrogênio seja desenvolvida em diversos
institutos de pesquisa no mundo e facilitando a troca de informações
entre estas.

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