Revista Ciência Agronômica, v. 40, n. 1, p.

7-16, jan-mar, 2009

Centro de Ciências Agrárias - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE
www.ccarevista.ufc.br ISSN 1806-6690

Diversidade de bactérias de solo sob vegetação natural e cultivo de

hortaliças1

Diversity of bacteria of the soil under natural vegetation and vegetables cropping

Silvana Pompéia Val-Moraes2*, Maria José Valarini3, Raquel Ghini4, Eliana Gertrudes de Macedo Lemos5 e
Lúcia Maria Carareto-Alves6

Resumo - Os microrganismos do solo são componentes essenciais na manutenção do equilíbrio físico-químico e biológico do
mesmo e exercem importante função que inclui a degradação de resíduos de plantas e animais e a liberação de nutrientes na
cadeia alimentar. Este trabalho teve como objetivo comparar a microbiota de um solo com cobertura de mata (SMS) e outro
cultivado com hortaliças (SHC), supressivos ou não a Rhizoctonia solani. Foram feitas extrações do DNA total dos solos e
a partir dos mesmos, amplificação por PCR dos genes 16S rDNA, clonagem dos fragmentos e seqüenciamento dos genes do
RNA ribossomal. A análise dos resultados demonstrou que essa metodologia foi eficiente para avaliação de bactérias. No solo
supressivo de mata os filos mais encontrados pertencem aos das Acidobactérias, Verrucomicrobia e Actinobactérias e no solo
conducente cultivado com hortaliças a maioria pertence aos filos das Proteobactérias, Firmicutes e Bacteroidetes.
Palavras-chave - Solo conducente. Solo supressivo. Metagenoma. Rhizoctonia solani.

Abstract - The microorganisms are essential components in the maintenance of the biological and physicochemical balance
of the soil. They exert important function including the degradation of residues of plants and animals and the release of
nutrients in the alimentary chain. This work had as objective to compare the microbiota of a soil under bush covering (SMS)
and other cropped with vegetables (SHC), suppressive or not it Rhizoctonia solani. Total microbial community DNA was
extracted of soils, amplification for PCR of the genes 16S rDNA, inserted into pGEM®-T cloning vector and sequencing of
the genes of the ribosomal RNA. The analysis of the results demonstrated that this methodology was efficient for evaluation of
bacteria in ground. In the bush soil suppressive the microorganisms more found belonged to the phyla of the Acidobacterias,
Verrucomicrobia and Actinobacterias and in the soil cultivated with vegetables the biggest frequency was of organisms
pertaining to the phyla of the Proteobacterias, Firmicutes and Bacteroidetes.
Key words - Conducive soil. Suppressive soil. Metagenome. Rhizoctonia solani.

* Autor para correspondência

1
Recebido para publicação em 28/11/2007; aprovado em 20/11/2008
2
Projeto financiado pela FAPESP/CAPES e parte da dissertação da primeira autora, 2003, FCAV/UNESP
Bióloga, Pós-doutoranda – Universitat de Barcelona-UB, Barcelona, ES, FCAV/UNESP, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n
– Jaboticabal –São Paulo – CEP: 14 .884-900, valmoraes.silvana@gmail.com
3
Eng. Agrônomo, Pesquisadora - Instituto de Zootecnia, APTA - SAASP, mjvalarini@iz.sp.gov.br
4
Eng. Agrônomo, Pesquisadora - Embrapa Meio Ambiente, raquel@cnpma.embrapa.br
5
Bióloga, Profa. Dra. FCAV/UNESP, egerle@fcav.unesp.br
6
Bióloga, Profa. Dra. FCAV/UNESP, lmcalves@fcav.unesp.br
 S. P. Val-Moraes et al.
Introdução
A sustentabilidade dos solos é ameaçada pela
degradação sendo os distúrbios nas comunidades vegetais
os primeiros sintomas visíveis, porém, freqüentemente a
desertificação de áreas é acompanhada ou precedida pela
perda das propriedades físico-químicas, biológicas e
microbiológicas dos solos (REQUENA et al., 2001).
Em relação às propriedades do solo a umidade (SAIT et
al., 2006), o pH e a quantidade de fósforo disponível podem
interferir na comunidade bacteriana (LINDSTRÖM et al.,
2004; RODRIGUES; FRAGA, 1999). O pH do solo interfere
diretamente na freqüência de Acidobactérias e a umidade do
solo favorece as Verrucomicrobia (SAIT et al., 2006).
Tão importantes quanto às características físico-
químicas do solo são os seus componentes biológicos,
ou seja, a diversidade genotípica e a atividade metabólica
dos microrganismos edáficos. Portanto, a recuperação
quantitativa e qualitativa de microrganismos a partir de
amostras ambientais é essencial para entender a função do
ecossistema (TAYLOR et al., 2002).
A diversidade de microrganismos no solo é
muito maior do que se imaginava, no entanto, devido as
grandes alterações realizadas pelas práticas agrícolas essa
diversidade pode ser perdida antes mesmo de tornar-se
conhecida (CURTIS et al., 2002). Ainda não existe uma
metologia universal capaz de cultivar e caracterizar a
maioria das bactérias presentes nos ecossitemas naturais
(RONDON et al., 1999a).
No entanto, com a utilização da metagenômica
existe a possibilidade de acessar os genes de bactérias de
um determinado ambiente independente de técnicas de
cultivo, através da extração de DNA diretamente do solo
com a construção de uma biblioteca metagenômica com
este genoma misto (PACE, 1997). Consequentemente pode
haver uma probabilidade de se conhecer mais rapidamente
a comunidade bacteriana local com a possibilidade de se
explorar novos recursos microbianos (RONDON et al.,
1999b, 2000).
O Domínio Bactéria há uma década compreendia
segundo Hugenholtz et al. (1998a, 1998b), 36 divisões
incluindo 12 divisões baseadas em seqüências 16S rRNA
de organismos cultivados descritas por Woese (1987),
e outras 12 divisões baseadas somente na análise de
seqüências do gene 16S rDNA isoladas diretamente do
meio ambiente (HUGENHOLTZ et al., 1998a), o que
indicava a possibilidade de se identificar por métodos
moleculares outros filos não cultiváveis (WARD et
al., 2003). Baseado em seqüência do 16S rRNA estão
descritas 53 divisões sendo que somente 27 são cultiváveis
(KELLER; ZENGLER, 2004), o que ressalta a importância
da utilização de técnicas moleculares.
8 Rev. Ciênc. Agron., v. 40, n. 1, p. 7-16, jan-mar, 2009
Para caracterizaçao genética de bactérias, têm sido
utilizado os ácidos ribonucléicos ribossomais (rRNA),
pois seus genes codificadores, o rDNA, apresenta alto grau
de conservação (PEREIRA et al., 2006; SILVEIRA et al.,
2006). Segundo, Silveira et al. (2006), o que possibilita
identificar vários representantes das comunidades
bacterianas com alguns gramas de solo. Alguns
dos filos mais estudados indicam a importância dos
microrganismos edáficos para a preservação do solo
(CANHOS 1997; HEDLUNG, 1997; HUGENHOLTZ et
al., 1998b; RODRIGUES; FRAGA, 1999; RONDON et
al., 1999b;), têm alto potencial industrial, entretanto, muitos
filos ainda são pouco estudados (BEER et al., 2002; LIU et
al., 2001; STACKEBRANDT et al., 1997).
O presente trabalho teve como objetivo comparar
os principais grupos de bactérias dos solos com cobertura
de mata nativa e em solo cultivado com hortaliças, através
de metodologias de metagenômica.
Material e métodos
A coleta do solo supressivo foi realizada em uma
mata situada na microbacia do Córrego Taquara Branca,
município de Sumaré (22° 49’ 13” S; 47° 16’ 08” W),
no estado de São Paulo e a supressividade dos solos
foi avaliada pelo método do crescimento do patógeno
(Rhizoctonia solani) nas amostras de solo segundo Ghini;
Zaroni (2001). O solo conducente com cultivo comercial
de hortaliças foi coletado na mesma microbacia. A coleta
seguiu o seguinte procedimento: doze amostras simples
ao acaso coletado em zigue e zague com profundidade
de 0 - 20 cm que depois de reunidas e homogeneizados,
resultaram em amostra composta. As análises dos solos
foram realizadas no Departamento de Solos e Adubos da
Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal,
como pode ser observado na Tabela 1.
As análises químicas de macronutrientes;
micronutrientes, e granulométrica com fracionamento
de areia foram efetuadas de acordo com o Programa de
Controle de Qualidade Análise de Solo - Sistema IAC.
(RAIJ et al., 2001).
Para a extração do DNA das comunidades
microbianas de cada solo (DNA metagenômico) foi
utilizado o Kit FastDNAR Spin Kit for Soil (Bio 101 -
catalog #6560-200). O DNA metagenômico foi usado em
cadeia da polimease de PCR para a amplificação do gene
16S rRNA, utilizando oligonucleotídeos específicos pA
(5’- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’) e pc5B
(5’-TAC CTT GTT ACG ACT T-3’). As reações de PCRs,
sequenciamento e análise dos amplicons foram feitas
segundo metodologia descrita por Pereira et al. (2006) e
Silveira et al. (2006).
 Diversidade de bactérias de solo sob vegetação natural e cultivo de hortaliças

Tabela 1 - Características químicas e físicas dos solos cultivado com hortaliças (SHC) e solo de mata (SMS).
Solo Conducente
Características Solo Supressivo de Mata
Hortaliças
pH (CaCl2) 4,8 5,6
matéria orgânica (g dmn-3) 50,0 56,0
P (mg dm-3) 14,0 280,0
K (mmolc dm-3) 1,6 5,0
Ca (mmolc dm-3) 31,0 83,0
Mg (mmolc dm-3) 12,0 15,0
H + Al (mmolc dm-3) 52,0 31,0
SB 44,6 103,0
T 96,6 134,0
V% 46,0 77,0
B (mg dm-3) 0,62 0,38
Cu (mg dm-3) 3,8 10,0
Fe (mg dm-3) 89,0 60,0
Mn (mg dm-3) 35,7 34,3
Zn (mg dm-3) 3,4 4,8
Argila 480,0 400,0
Limo 150,0 220,0
A. M. F (Areia muito fina) g kg-1 50,0 80,0
A. F. (Areia fina) g kg-1 200,0 210,0
A M. (Areia média) g kg-1 90,0 80,0
A.G. (Areia grossa) g kg-1 30,0 10,0
A.M.G. (Areia muito grossa) g kg-1 0,0 0,0
Total areia 370,0 380,0
Classe Textural Argilosa Argilosa

As seqüências foram analisadas inicialmente A diversidade genética foi calculada usando as

com os programas “Sequencing Analysis 3.4” e “Phred/
Phrap/Consed” (GORDON et al., 1998). Com o auxílio
do programa Contgen foram selecionados as seqüências
com mais de 400 bases e com qualidade Phred acima de
20. Essas seqüências foram comparadas com seqüências
do GenBank utilizando o programa BLAST (ALTSCHUL
et al., 1997).
O alinhamento das seqüências de DNA foi feito
com o auxílio do programa BioEdit (HALL, 2001) e
para a construção da matriz de similaridade foi usado o
algoritmo p-distance, com bootstrap de 3.000 repetições
(SWOFFORD et al., 1996). O método de distância
“neighbor-joining” (SAITOU; NEI, 1987) foi usado na
construção das árvores filogenéticas e para a visualização
gráfica das árvores foi utilizado o programa MEGA (versão
2.1) (KUMAR et al., 2001).
seqüências de DNA dos dois solos. Os valores da distância
genética foram calculados entre grupos de diferentes solos
e entre grupos de microrganismos obtidos do mesmo solo.
A distância genética entre os indivíduos do mesmo grupo
foi estimada pela média aritmética de todas as distâncias
de bases, e a distância genética entre grupos foi estimada
pelo modelo distâncias de bases entre dois grupos (NEI;
KUMAR, 2000). Estes valores foram calculados usando
a p-distância o método de distância “neighbor-joining”
(SAITOU; NEI, 1987) usando o software MEGA (2.1
versão) (KUMAR et al., 2001). A estimativa das distâncias
genéticas foi usada para avaliar a divergência genética
dentro e entre os grupos (NEI, 1972). O software Arlequin
foi usado para estimar a estrutura genética entre diferentes
grupos de solos e da diversidade genética intra-específica.
O significado das diferenças de bases em valores do índice
de fixação (FST) que determinam a média da diferenças

Rev. Ciênc. Agron., v. 40, n. 1 p. 7-16, jan-mar, 2009 9

 S. P. Val-Moraes et al.
de bases e de outros índices usados para verificar se os
grupos de microrganismos dos diferentes solos estavam
estruturados, e as diferenças da média entre grupos
de microrganismos foram calculadas usando a análise
da variação molecular (AMOVA). O teste de FST foi
usado para comparar a diversidade genética dentro
de cada grupo à diversidade genética total combinada
concordando a equação do FST = (FST = (θT - θW) / θT, onde
θT é a diversidade genética para todas as amostras e θW é a
diversidade genética em cada grupo (MARTIN, 2002). O
significado estatístico de FST foi avaliado aleatoriamente
atribuindo seqüências às populações e calculando o FST
para 3000 permutações. A média das diferenças de bases
foram estimadas e comparadas dentro de um grupo do
número de diferenças da seqüência entre um solo e outro
(SCHNEIDER et al., 2000). Para estimar a diversidade
genética dentro dos dois solos os índices foram calculados
usando o método de distância com modelo de substituição
do nucleotídeo p_distância. A média das diferenças de
bases e a diversidade do nucleotídeo foram calculadas
para cada solo. Também os índices moleculares como
o número de cópias do gene e os haplótipos, o número
total de loci, os loci válidos, os locais polimórficos e a
diversidade de nucleotídeos foram calculados para cada
série de dados.
As seqüências do gene 16S rRNA foram depositadas
e estão disponíveis no banco de dados GenBank (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov) através dos números de acesso
que constam nos relacionamentos filogenéticos deste
trabalho.
Resultados e discussão
Nos estudos da diversidade bacteriana do SMS
foram obtidas 98 seqüências válidas considerando mais
de 400 bases com qualidade Prhap >20, “score” >120 e
“evalue” -30. Das seqüências obtidas 29% apresentaram
homologias com seqüências que se encontravam
depositadas no GenBank como “environmental samples”;
ou seja, não apresentaram homologia com nenhum filo
bacteriano; outras 3,6% pertenciam ao filo Firmicutes;
3,6% Verrucomicrobia; 1,8% Proteobactéria; 12,8%
Actinobactéria; 3,6% Planctomycetes; 1,8% TM6; 1,8%
Bacteroidetes e 18,2% Acidobactérias. A partir da árvore
filogenética foi possível agrupar e caracterizar a maior
parte dos organismos que não apresentavam homologia
com nenhum filo.
Nos estudos da diversidade bacteriana do SHC
foram obtidas 96 seqüências válidas e 50% apresentaram
homologia com seqüências que estavam depositadas
no GenBank sem classificação alguma (62,8%), já as
Firmicutes representavam 15,7%; Chloroflexi 4,3%;
10 Rev. Ciênc. Agron., v. 40, n. 1, p. 7-16, jan-mar, 2009
Acidobactérias 1,4%; Actinobactéria 4,3%; Cyanobactéria
1,4%; Proteobactéria 7,2%. A partir da árvore filogenética
também foi possível agrupar e caracterizar a maior parte
dos organismos que não apresentavam homologia com
nenhum filo.
Neste trabalho foi através das análises das árvores
filogenéticas que se pôde determinar em qual grupo os
organismos não identificados pertenciam e estimar quais
os grupos mais abundantes observados em cada solo
estudado, deste modo foi feita uma análise dos principais
grupos encontrados no solo supressivo de mata e no solo
cultivado com hortaliças (Figura 1 e 2).
No entanto, nos respectivos solos, pôde-se observar
que alguns microrganismos não classificados não se
agruparam a nenhum filo bacteriano, 9,1% SMS e 14,3%
SHC. A maioria dos trabalhos envolvendo estimativas de
diversidade de bactérias no solo relata diferentes quantidades
de microrganismos que não podem ser agrupados a
nenhum filo conhecido, independentemente das técnicas
de análise utilizadas, o que indica a possibilidade de serem
novos filos incultiváveis pertencentes ao Domínio Bactéria
(WARD, 2003).
As Chloroflexi foram encontradas somente no SHC
e as Planctomycetes somente no SMS, esses têm sido os
filos bacterianos menos estudados (BEER et al. 2002; LIU
et al., 2001).
Das bactérias observadas no solo supressivo de
mata temos como mais freqüentes as Acidobactérias,
Actinobactérias, Verrucomicrobia. Analisando a
distribuição dos clones nos diferentes filos observou-
se que a grande maioria das seqüências na biblioteca
SMS 23,7%, foram agrupadas ao filo Acidobactéria. A
ocorrência desse filo está diretamente relacionada com o
pH do solo (SAIT et al., 2006). Havia mesmo a expectativa
de se encontrar uma porcentagem maior deste filo, pois o
solo desta área apresentava um pH mais ácido (Tabela 1).
As Acidobactérias foram reconhecidas como filo
há cerca de uma década e a ocorrência de seqüências
desse organismo em diversos estudos ambientais sugere
que estes microrganismos são componentes ecológicos
significativos em diversos ecossistemas, particularmente
em comunidades de solo (HUGENHOLTZ et al., 1998b).
Proposto em 1997, por Hedlund e colaboradores,
o filo Verrucomicrobia possui representantes amplamente
distribuídos na natureza, principalmente no solo. Vários
trabalhos relatam à presença desse filo em solos de
floresta, cultivados e solos áridos, em diferentes lugares do
mundo (BORNEMAN et al., 1996; DUNBAR et al., 1999;
RONDON et al., 1999). Este filo tem atualmente dois
gêneros e cinco espécies conhecidas, são exclusivamente
anaeróbios, sendo a maioria dos isolados foi encontrada em
ambientes aquáticos (RAPPÉ; GIOVANNONI, 2003).
 Diversidade de bactérias de solo sob vegetação natural e cultivo de hortaliças

58
61 SMS 52 AY694599.1 Acidobacteria
97
AF498753.1 Acidobacteria
SMS 45 AY694595.1 Acidobacteria Acidobacteria
SMS 102 AY694618.1 Acidobacteria
99 AY174198.1 Acidobacteria
7 SMS 62 AY694605.1 Acidobacteria Acidobacteria
85 SMS 66 AY694564.1 Acidobacteria
SMS 41 AY694592.1 Actinobacteria Actinobacteria
SMS 60 AY694603.1 Environmental sample
7
25 SMS 117 ay694603.1 Environmental sample
62 SMS 114 AY694621.1 Actinobacteria Actinobacteria
77 X68463.1 Actinobacteria
53 SMS 16 AY694623.1 Acidobacteria Acidobacteria
99 AF200699.1 Acidobacteria
AF431481.1 Acidobacteria
97
AJ536874.1 Acidobacteria
SMS 11 AY94573.1 Acidobacteria Acidobacteria
44 SMS 36 AY694588.1 Acidobacteria
45 SMS 91 AY694612.1 Holophaga sp
59 SMS 37 AY694589.1 Acidobacteria
99 SMS 43 AY694593.1 Acidobacteria
56
AF465650.1 Acidobacteria Acidobacteria
AF431483.1 Acidobacteria
76 SMS 13 AY694575.1 Verrucomicrobia
87 SMS 86 AY694610.1 Verrucomicrobia
94
14 99
SMS 94 AY694615.1 Verrucomicrobia Acidobacteria
SMS 61 AY694604.1 Verrucomicrobia
SMS 44 AY694594.1 Verrucomicrobia
2 100 AF465651.1 Verrucomicrobia
61
51 SMS 103 Acidobacteria Acidobacteria
AY174200.1 Acidobacteria
94 SMS 24 AY694581 Verrucomicrobia
71 SMS 113 AY694571.1 Verrucomicrobia
58 Y07576.1 Verrucomicrobia Verrucomicrobia
97 SMS 25 AY694582.1 Verrucomicrobia
58 SMS 118 AY694624.1 Verrucomicrobia
73 SMS 28 AY694584.1 Actinobacteria
94
65 SMS 29 AY69994585.1 Rhodococcus sp
94 AF420420.1 Actinobacteria
32
AF420422.1 Actinobacteria Actinobacteria
SMS 34 AY694692.1 Actinobacteria
10 SMS 56 AY694601.1 Actinobacteria
9 65 SMS 92 AY694613.1 Actinobacteria
SMS 97 AY694616.1 Firmicutes
95 SMS 85 AY694609.1 Firmicutes Firmicutes
100 AJ509007.1 Firmicutes
78
36 SMS 18 AY694578.1 Alphaproteobacteria
7 AF234719.1 Alphaproteobacteira Proteobacteria
20
SMS 122 AY694625.1 Alphaproteobacteria
SMS 93 AY694614.1 Alphaproteobacteria
100 SMS 49 AY694598.1 Actinobacteria
35
AF498683.1 Actinobacteria
73 X92696.1 Actinobacteria Actinobacteria
99
AF431546.1 Actinobacteria
98 SMS 116 AY694610.1 Actinobacteria
56
SMS 38 AY694590.1 Actinobacteria
SMS 12 AY694574.1 Candidate division TM6
7 SMS 27 AY694583.1 Candidate division TM6 TM6
32 SMS 63 AY694606.1 Candidate division TM6
100 SMS 76 AY694607.1 Candidate division TM6
98
SMS 39 AY694591.1 Candidate division TM6 TM6
SMS 30 AY694586.1 Environmental sample
100 SMS 55 AY694600.1 Environmental sample
100 SMS 19 AY694579.1 Planctomycetes
100 SMS 77 AY694608.1 Planctomycetes Planctomycetes
51 SMS 47 AY694596.1 Planctomycetes
100 AF467389.1 Planctomycetes
SMS 09 AY694572.1 Firmicutes Firmicutes
100 SMS 17 AY694577.1 Environmental sample
SMS 48 AY694597.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
100 SMS 21 AY694580.1 Plancotmycetes Planctomycetes
AF271313.1 Planctomycetes
100
SMS 57 AY694602.1 Firmicutes Firmicutes
99
AF537343.1 Firmicutes
83
99 SMS 87 AY694611.1 Holophaga sp Acidobacteria
AJ519364.1 Acidobacteria
96 SMS 115 AY694692.1 Actinobacteria Actinobacteria
100 X68464.1 Actinobacteria
AB055990.1 Archaea Root
0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00

Figura 1 - Relacionamento filogenético baseado na amplificação da região 16S rDNA através de PCR de amostras do solo SMS, a
árvore foi enraizada com a seqüência de Archaea

Rev. Ciênc. Agron., v. 40, n. 1 p. 7-16, jan-mar, 2009 11

 S. P. Val-Moraes et al.

58 SHC 94 AY694485.1 Bacteroidetes Bacteroidetes

33 SHC 150 AY694569.1 Environmental sample
SHC 116 AY694493.1 Alphaproteobacteria Proteobacteria
AJ247193.1 Proteobacteria Proteobacteria
AJ318173.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
SHC 109 AY694490.1 Environmental sample
SHC 96 AY694486.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
SHC 91 AY694483.1 Bacteroidetes
10 SHC 37 AY694451.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
98 SHC 89 AY694481 Bacteroidetes
75 SHC 31 Bacteroidetes
SHC 51 AY694458.1 Bacteroidetes
10 SHC 74 AY694470.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
20 SHC 88 AY6946949480.1 Bacteroidetes
SHC 26 AY694443.1 Betaproteobacteria Proteobacteria
0 SHC 44 AY694452.1 Acidobacteria Acidobacteria
8
38 SHC 23 AY694442.1 Alphaproteobacteria Proteobacteria
SHC 127 AY694498.1 Actinobacteria
62 SHC 14 AY694438.1 Actinobacteria Actinobacteria
73 AF234116.1 Actinobacteria
34
20
SHC 32 AY694448.1 Betaproteobacteria
SHC 135 AY694564.1 Betaproteobacteria Proteobacteria
SHC 97 Betaproteobacteria
0 15 SHC 78 AY694473.1 Environmental sample
AF283280.1 Actinobacteria Actinobacteria
1 SHC 47 AY694455.1 Environmental sample
18 SHC 121 AY694496.1 Actinobacteria Actinobacteria
SHC 75 AY694471.1 Betaproteobacteria Proteobacteria
38 SHC 108 AY694437.1 Environmental sample
SHC 46 AY694454.1 Environmental sample
0 SHC 13 AY694437.1 Bacillus sp Firmicutes
0 63
17 SHC 112 Firmicutes
6 SHC 122 Firmicutes Firmicutes
D78473.1 Firmicutes
3
SHC 132 Environmental sample
71 SHC 120 Firmicutes
12
AY150889.1 Firmicutes Firmicutes
SHC 33 Bacillus sp
SHC 72 AY674468.1 Firmicutes Firmicutes
19
SHC 138 AY694566.1 Betaproteobacteria Proteobacteria
SHC 77 AY694472.1 Environmental sample
81 SHC 05 AY694435.1 Bacillus sp Firmicutes
AB066347.1 Firmicutes Firmicutes
99
4 SHC 85 AY684478.1 Deltaproteobacteria Proteobacteria
75
SHC 87 AY694479.1 Deltaproteobacteria
96 SHC 84 AY694477.1 Bacteroidetes
SHC 83 AY694476.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
0 SHC 92 AY694484.1 Bacteroidetes
AF234716.1 Chloroflexi Chloroflexi
81 AF234686.1 Chloroflexi Chloroflexi
15 SHC 16 AY694440.1 Chloroflexi
SHC 55 AY694459.1 Deltaproteobacteria Proteobacteria
20
94 SHC 119 AY694495.1 Chloroflexi Chloroflexi
89 SHC 130 AY694499.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
65 SHC 30 AY694446.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
SHC 103 Environmental sample
SHC 118 AY694494.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
23 SHC 56 AY694460.1 Bacteroidetes
38 SHC 69 AY694452.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
43 SHC 110 AY694491.1 Bacteroidetes
96 AY038778.1 Bacteroidetes
24
SHC 102 AY694488.1 Chloroflexi Chloroflexi
SHC 45 AY694453.1 Bacillus sp Firmicutes
4
SHC 18 AY694441.1 Tsukamurella sp Actinobacteria
SHC 62 AY694463.1 Firmicutes
18 SHC 65 AY694463.1 Firmicutes Firmicutes
85 SHC 140 AY694567.1 Paenibacillus sp
SHC 133 Environmental sample
SHC 68 AY694465.1 Firmicutes Firmicutes
85 SHC 134 AY694563.1 Cyanobacteria Cyanobacteria
98
SHC 61 AY694462.1 Firmicutes
50
SHC 11 AY694436.1 Bacillus sp Firmicutes
SHC 152 AY694470.1 Firmicutes
SHC 125 ay694497.1 Deltaproteobacteria Proteobacteria
89 SHC 100 AY694487.1 Firmicutes
78 SHC 70 AY694467.1 Firmicutes Firmicutes
62 SHC 79 AY694474.1 Firmicutes
SHC 27 AY694444.1 Gordonia sp Actinobacteria
84 AY694461.1 Bacteroidetes Bacteroidetes
95 SHC 02 AY694434.1 Roseiflexus sp Chloroflexi
90 AB041226.1 Chloroflexi
SHC 50 AY694567.1 Deltaproteobacteria Proteobacteria
AB055990.1 Archaea Root
0.2 0.1 0.0

Figura 2 - Relacionamento filogenético baseado na amplificação da região 16S rDNA através de PCR de amostras do solo SHC, a
árvore foi enraizada com a seqüência de Archaea

12 Rev. Ciênc. Agron., v. 40, n. 1, p. 7-16, jan-mar, 2009

 Diversidade de bactérias de solo sob vegetação natural e cultivo de hortaliças
Lindström et al. (2004) investigaram os fatores
que afetam a composição de bacterioplâncton em
diferentes profundidades, em um lago na Suécia com
diferentes tratamentos de fósforo (P), e concluíram a alta
disponibilidade desse composto favoreceu a população
deste grupo. No entanto, neste trabalho foi observado que
a quantidade de fósforo disponível no SHC era de 95%
a mais do que no SMS (Tabela 1), e sugere que outros
componentes podem interferir e favorecer a existência
do filo, pois não foram obtidos nenhum representante do
mesmo no SHC. É possível associar a grande freqüência
de Verrucomicrobia à temperatura do solo, por se tratar
de solo de mata está sempre protegido pela vegetação
mantendo assim uma temperatura mais estável em relação
a um solo cultivado (SAIT et al., 2006).
As Actinobactérias são Gram-positivas com alto
Teor de G + C, compreende o grupo dos organismos
da família Actinomycetales e gêneros relacionados
(STACKEBRANDT et al., 1997). O grupo Actinobacteria
é considerado muito importante, devido a sua característica
de produção de diversos antibióticos e deste modo podem
controlar diversos grupos bacterianos e, provavelmente,
tem um papel importante no SMS. Nesse solo houve a
ocorrência de uma nova divisão TM6, que só pôde ser
conhecida graças às técnicas moleculares (KELLER;
ZENGLER, 2004).
No SHC a maior freqüência de bactérias foi
do grupo Firmicutes, Bacteroidetes e Proteobactérias.
As Firmicutes são bactérias Gram-positivas com
baixo teor de G + C e são separadas em dois grandes
grupos filogeneticamente distintos, cujos organismos
podem ser, de maneira geral, discriminados de acordo
com o teor de guanina e citosina (G + C) no DNA.
O gênero Bacillus pertencente a esse filo foi descrito
como bactérias com grande potencial de solubilização
de fósforo nos solos (RODRIGUES; FRAGA, 1999).
O grande número de representantes desse filo pode
estar diretamente ligado à alta concentração de fósforo
encontrado no SHC (Tabela 1).
Já as Proteobactérias apresentam grande diversidade
de morfologia celular e fisiologia. As estratégias para
obtenção de energia são várias, incluindo organismos com
metabolismos quimiolitotrófico, quimiorganotrófico e
fototrófico, além de outras vias metabólicas especializadas
em organismos adaptados a nichos diversos (CANHOS
et al., 1997). Conforme descrito por Requena (2001)
que alterações nos solos ameaçam a sustentabilidade
ocorrendo distúrbios nas comunidades vegetais, também
altera as comunidades bacterianas.
Maiores esforços para ampliar o conhecimento sobre
a diversidade microbiana e filogenia de microrganismos
Rev. Ciênc. Agron., v. 40, n. 1 p. 7-16, jan-mar, 2009
são fundamentais para a exploração de novos organismos
de interesse ambiental e industrial.
O índice de diferenciação genética entre as duas
comunidades bacterianas (SMS e SHC), calculado por Fst
foi significativa (Fst = 0,03157, para P < 0,05), sugerindo que
valor relativamente baixo seja porque as duas comunidades
são estruturalmente distintas. Um dado interessante foi à
existência de uma maior diversidade genética individual e
também entre as comunidades estudadas. Os resultados da
variação genética intra-populacional calculados pelo teste
AMOVA apresentaram uma média de 96,84, ou seja, há
uma grande variabilidade de organismos dentro de uma
mesma comunidade. Resultado semelhante foi obtido por
Silveira et al. (2006) analisando microrganismos do solo
sob arboreto de Eucalyptus sp.
O software Arlequim analisou 2.143 pares de bases de
cada clone em ambos os solos calculando também a média das
diferenças entre pares de bases, valores que foram de 98,17
e 364,78 para as bibliotecas SMS e SHC, respectivamente.
Já o número de nucleotídeos polimórficos apresentou valores
de 677 e 2.143 nas bibliotecas SMS e SHC, respectivamente.
Estes valores indicam a existência de uma maior diversidade
genética na área SHC em relação ao SMS.
O SMS foi considerado como um solo sob vegetação
natural, sem trato cultural, que apresenta comunidades
bacterianas mais adaptadas ao meio ambiente, ou seja, um
sinergismo maior e diversidade menor quando comparada
com área sob cultivo de hortaliças, entretanto, com esse
plantio o ecossistema sofreu uma alteração, aumentando a
sua dinâmica populacional e conseqüentemente o aumento
da diversidade bacteriana.
A distância genética entre o SMS e o SHC
apresentou o valor intermediário (0,361). Em relação aos
filos a distância genética mais baixa dentro dos grupos foi
observada para Verrucomicrobia-SMS (0,093), e o mais
elevado para Firmicutes-SHC (0,458), os outros grupos
apresentaram distâncias intermediárias, destacando-se
para Acidobactéria SMS (0,176) e Proteobactéria SHC
(0,305) (Tabela 2A; 2B; 2C).
Podemos observar na Tabela 1 que o solo SMS
apresentou baixo teor de nutrientes disponíveis quando
comparados com o solo SHC, fazendo uma relação entre
a quantidade de Acidobactérias encontradas essas foram
maiores em relação ao SHC, já no SHC a quantidade
de Proteobactérias foi mais expressiva. Resultados
semelhantes foram observados por Smit et al. (2001)
sugerindo que a razão entre o número de Proteobactéria
e Acidobactéria serve como indicativo da condição
nutricional do solo, considerando as Proteobactérias com
alto potencial de crescimento e as Acidobactérias com
baixo potencial de crescimento, mas com alta capacidade
de competir por substratos.
13
 S. P. Val-Moraes et al.

Tabela 2 - Distância genética dentro dos grupos de solos e Tabela 3 - Distância genética entre os solos e valores da
de Filos diversidade

Distância genética Soma dos Variação da

A. Solo A. Solo
dentro dos solos quadrados porcentagem
SMS 0,245 Entre as 2,018 3,16
SHC 0,361 populações
B. Solo SMS SHC Dentro das 92,949 96,84
populações
SMS
B. Solo SMS SHC
SHC 0,312
SMS 0,00000
Distância genética
C. Filo SHC 0,03157 0,00000
dentro dos Filos
FST 0,06157
1-Firmicutes-SMS 0,426
C. Índice SMS SHC
2-sem classificação-SMS 0,356
Seqüências 98 96
3-Acidobactéria-SMS 0,176 usadas
4-TM6-SMS 0,179 Haplótipos 55 70
5-Verrucomicrobia-SMS 0,093 Haplótipos 0 0
6-Actinobactéria-SMS 0,167 compartilhados
7-Proteobactéria-SMS 0,137 Total de loci 2.143 2.143
8-Bacteroidetes-SMS n/c Loci 677 2.143
9-Planctomycetes-SMS 0,299 polimórficos
10-Bacteroidetes-SHC 0,224 Diversidade de 0,9472 +/- 0,9897 +/- 0,0038
nucleotídeos 0,0165
11-sem classificação-SHC 0,365
Distância média 171,690933 +/- 364,78885522+/-
12-Acidobactéria-SHC n/c
de bases 0,252487 0,170222
13-Proteobactéria-SHC 0,305
14-Firmicutes-SHC 0,458
15-Actinobactéria-SHC 0,118
Conclusão
16-Chloroflexi-SHC 0,355
17-Cyanobactérias-SHC n/c A metodologia foi eficiente para identificar as
comunidades bacterianas presentes nos solos e a ocorrência
de várias seqüências que não foram agrupadas a nenhum
filo, sugere as existências de novos filos.
Com o índice de fixação (FST), que calcula a
média da diferenças de bases e de outros índices, podemos
verificar que a estrutura da população dos solos foi afetada
pelo cultivo, com o impacto principal causado pela cultura Referências
de hortaliças o valor elevado de FST, 0,03157 (Tabela 3B). ALTSCHUL, S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new
A diversidade genética mais elevada foi distribuída dentro generation to protein database search programs. Nucleic Acids
dos grupos (96,84) e uma parcela menor entre os grupos Research, v. 25, n. 17, p. 3389-3402, 1997.
foi de (3,16) (Tabela 3A). BEER, M. et al. Phylogenic of the filamentous bacterium
A média das diferenças de bases e o número de Eikelboom type 1851, and design and application of a 16S
rRNA targeted oligonucleotide for its in situ identification in
locais polimórficos para o solo do SHC apresentam os activated sludge. FEMS Microbiology Letters, v. 207, n. 02,
valores mais elevados (Tabela 3C), indicando que este p. 179-183, 2002.
solo foi muito impactado pela cultura. O solo SMS que
BORNEMAN, J.; SCKROCH, P. W.; O’ SULLIVAN, K.
tem menos haplótipos representados por mais de uma
M. Molecular Microbial diversity of an Agricultural Soil in
seqüência (98 seqüências e 55 haplótipos) já no solo SHC Wisconsin. Applied and Environmental Microbiology, v. 62,
(96 seqüências e 70 haplótipos). n. 06, p.1933-1943, 1996.

14 Rev. Ciênc. Agron., v. 40, n. 1, p. 7-16, jan-mar, 2009

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