Curso de Exame Andrológico e

Congelamento de Sêmen
Bovino

REALIZAÇÃO:

Parceiros:

VIÇOSA-MG
2010
Apresentação

Do ponto vista econômico, o desempenho reprodutivo em bovinos de corte é

aproximadamente cinco vezes mais importante do que o crescimento e pelo menos
dez vezes mais importante do que a qualidade da carne produzida. Da mesma forma,
na bovinocultura leiteira, a reprodução exerce um papel direto na produtividade leiteira
e no retorno econômico proveniente da venda de fêmeas de reposição. Desta forma,
um manejo reprodutivo adequado pode auxiliar na maximização da eficiência
reprodutiva e consequentemente na rentabilidade do setor de bovinocultura.

A avaliação andrológica dos reprodutores utilizados na monta natural é um

ponto de grande importância para o bom desempenho reprodutivo do rebanho. O
Exame Andrológico deve ser feito por um técnico experiente, realizando-se um exame
clínico, para avaliar a saúde geral dos reprodutores, buscando identificar fatores que
possam interferir com o desempenho reprodutivo dos touros (escore corporal, carga
parasitária, patologias e adaptabilidade ao ambiente).

Este curso tem por objetivo capacitar estudantes de veterinária e veterinários

formados, atuantes na área de pecuária bovina, a realizarem o exame andrológico e o
congelamento de sêmen bovino, para a orientação do manejo reprodutivo de
propriedades rurais de gado de corte e de leite.

Professores CPT Cursos Presenciais

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 SUMÁRIO

Exame Andrológico

1 -Introdução …..................................................................................................... 4

2 - Objetivos do exame andrológico …................................................................. 4

3 - Aspectos gerais da anatomia e fisiologia de machos bovinos ….................... 5

4 - Constituição do ejaculado do touro …............................................................. 23

5 -Principais patologias relacionadas ao aparelho reprodutor masculino …......... 24

6 - Material empregado para exame andrológico ................................................. 26

7 - Avaliação do Sêmen - Sequência de exame andrológico …........................... 27

Congelamento de Sêmen Bovino

1 - Introdução ….................................................................................................... 53

2 - Princípios de criopreservação do sêmen bovino …........................................ 53

3 - Cálculo para congelamento de Sêmen …........................................................ 54

4 - Exemplo de cálculo do volume do diluidor para congelamento ….................. 54

5 - Diluente e meios empregados para criopreservação ….................................. 56

6 - Exemplo de curva de resfriamento ….............................................................. 59

7 - Consequências do congelamento …............................................................... 60

8 - Recomendações para o congelamento de sêmen …....................................... 61

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1 - Introdução

A bovinocultura de corte e de leite são atividades fundamentais para a economia

nacional devido a sua função de fornecedora de produtos para a alimentação humana
e matéria-prima para a indústria, pela expressiva capacidade de geração de empregos,
e pela geração de divisas através da exportação. Mas apesar do Brasil ter maior
rebanho bovino comercial do mundo (cerca de 180 milhões de cabeças), encontramos
baixos índices de produtividade neste setor.

A eficiência reprodutiva é um dos fatores que mais interferem na produção de

animais zootécnicos, no entanto esta é extremamente dependente das condições
nutricionais e sanitárias. Do ponto vista econômico, o desempenho reprodutivo em
bovinos de corte é aproximadamente cinco vezes mais importante do que o
crescimento e pelo menos dez vezes mais importante do que a qualidade da carne
produzida (Trenkle & Wilham, 1977).

A avaliação da aptidão reprodutiva de um macho destinado a reprodução

fundamenta-se na observação da saúde geral, saúde hereditária, saúde genital,
capacidade de monta e capacidade fertilizante do sêmen.

2 - Objetivos do exame andrológico:

1) Avaliação para comercialização de reprodutores

2) Avaliação do potencial reprodutivo pré-estação de monta

3) Diagnóstico de ocorrência da puberdade

4) Seleção para precocidade sexual

5) Diagnóstico de sub ou infertilidade

6) Criopreservação de sêmen

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3 - Aspectos gerais da anatomia e fisiologia de machos bovinos

O sistema reprodutor masculino consiste em testículos circundados pela túnica

vaginal e pelos envoltórios testiculares, epidídimos, dutos deferentes, glândulas
acessórias (vesícula seminal, próstata e bulbo-uretral), uretra e pênis, circundado pelo
prepúcio.

Aparelho reprodutor masculino do macho bovino

Abreviaturas:
r - reto
a - ampola
vg - glândulas vesiculares
pg - glândula prostática
bu - glândula bulbo-uretral
sf - flexura sigmóide (“s” peniano)
caud.e.- cauda do epidídimo
cap.e. - cabeça do epidídimo
s - escroto
t - testículo
dd - ducto deferente
rp - mus. retrator do pênis

3.1 - Testículos

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 Os testículos ou gônadas masculinas localizam-se exteriormente no abdome
dentro do escroto, estrutura em forma de bolsa derivada da pele e fáscia da parede
abdominal. Cada testículo situa-se dentro do processo vaginal, extensão separada do
peritônio que passa através da parede abdominal pelo canal inguinal.

Os anéis inguinais interno e externo são as aberturas profunda e superficial do

canal inguinal. Além de permitir a passagem do processo vaginal e seus constituintes,
o canal inguinal também serve de trajeto a importantes vasos e nervos que suprem a
genitália externa. Os vasos sanguíneos e nervos atingem os testículos no cordão
espermático, que localizam-se dentro do processo vaginal o ducto deferente, que de
início acompanha os vasos, abandona-os no orifício do processo vaginal para juntar-se
à uretra.

3.2 - Funções dos testículos

a) Função endócrina
As duas funções importantes dos testículos são governadas pelos hormônios
gonadotróficos da hipófise. O hormônio folículo-estimulante está intimamente ligado
com o início da atividade dos túbulos seminíferos. O hormônio luteinizante (LH)
controla a atividade endócrina das células intersticiais. O hormônio sexual masculino
produzido pelas células intersticiais sustenta a ação do FSH sobre a
espermatogênese e é responsável pelo desenvolvimento das características sexuais
secundárias e pelo crescimento e integridade funcional do trato reprodutivo masculino.

b) Função exócrina
Os espermatozóides produzidos pelos testículos saem através de uma série de
canais eferentes que penetram no ducto tortuoso dos epidídimos, formando o ducto
deferente reto. Uma série de glândulas acessórias libera seu conteúdo, seja para o
interior dos ductos deferentes ou próximos da sua extremidade na porção pélvica da
uretra.
3.3 - Histologia do Testículo

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a) Túbulos seminíferos
Os túbulos seminíferos são túbulos tortuosos; revestidos por um epitélio
estratificado que consiste em dois diferentes tipos celulares básicos: células de
sustentação e células espermatogênicas.

b) Células intersticiais
As células intersticiais formam grupos bem vascularizados de células poliédricas
que ocupam os espaços entre os túbulos seminíferos.

c) Células de sustentação
As células de sustentação (células de Sertoli) são células piramidais e alongadas,
muitas vezes com contorno irregular, cujas bases largas repousam sobre a membrana
basal. O núcleo esférico, oval ou piriforme geralmente está localizado na parte larga da
célula e, muitas vezes, com pregas profundas em sua superfície; além disso, um
nucléolo excepcionalmente grande está presente. Os espermatozóides deixam os
testículos em uma importante secreção fluida. A composição desta secreção difere
bastante daquela do plasma sanguíneo da linfa. Existe uma importante barreira
sanguínea-testicular que efetivamente separa o epitélio seminífero da circulação geral.

Esta barreira é formada por células especiais da membrana basal dos túbulos e
por características especiais das células de sustentação. Junções intercelulares
singulares estão localizadas acima do nível das espermatogônias e subdividem os
túbulos num compartimento basal e outro apical. A barreira divide eficazmente dois
compartimentos dos testículos separando as espermatogônias mães da sua progênie.
A integridade da barreira sanguínea testicular é tida como importante para uma função
testicular normal. Ela serve para separar imunologicamente o epitélio germinativo do
resto dos tecidos orgânicos e qualquer lesão que prejudique sua eficácia resulta em
danos imunológicos para os testículos. Pressupõe-se que as células de sustentação
exerçam funções nutritivas, protetoras e de sustentação para as células
espermatogênicas.
Além disso, fagocitam espermatozóides em degeneração e corpos residuais
destacados das espermátides. Elas liberam os espermatozóides para o lume dos
túbulos seminíferos. São intermediárias na ação dos hormônios gonadotróficos sobre

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as células germinativas e participam na sincronização das ocorrências
espermatogênicas.

Desenho esquemático de corte do túbulo seminífero

d) Células espermatogênicas

Várias células espermatogênicas, representando fases diferentes no

desenvolvimento e diferenciação do espermatozóide, estão localizadas entre e sobre
as células de sustentação. A sequência de ocorrências no desenvolvimento dos
espermatozóides a partir das espermatogônias é conhecida como espermatogênese.
O processo de espermatogênese é subdividido em três fases: (1)
espermacitogênese, o processo durante o qual as espermatogônias desenvolvem-se
em espermatócitos; (2) meiose, a divisão de maturação dos espermatócitos da qual

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resultam as espermátides com número reduzido (haplóide) de cromossomos; e (3)
espermiogênese, o processo de transformação das espermátides em
espermatozóides,

- Espermacitogênese

A célula-fonte espermatogênica é uma célula diplóide conhecida como

espermatogônia. No touro as espermatogônias sofrem um total de seis divisões
mitóticas: três divisões A, uma divisão 1 e duas divisões B. A divisão de uma
espermatogônia-fonte (tipo A) resulta em uma célula-filha que é o começo de uma
série espermatogênica. A outra célula-filha torna-se uma nova célula-fonte. Ela
permanece inativa até que os descendentes da primeira célula-filha originem os
espermatócitos primários, em cuja ocasião ela divide-se e mais uma vez dá origem a
urna nova célula-fonte e uma célula que inicia uma série espermatogênica. Desta
forma, a continuidade das células-fonte e a espermatogênese ininterrupta são
garantidas.

Os espermatócitos primários são o resultado da última divisão mitótica das

espermatogônias do tipo B. No início de seu desenvolvimento, eles são semelhantes
às espermatogônias do tipo B. Subseqüentemente, desenvolvem-se nas maiores
células de toda a série espermatogênica. Estão localizados numa posição mais central
na parede do túbulo que as dos estágios anteriores.

- Meiose
Os espermatócitos primários passam pela fase inicial de meiose, denominada
primeira divisão da maturação. Os resultados desta divisão são os espermatócitos
secundários. Convém lembrar que a duplicação do DNA ocorre durante a intérfase;
assim, cada espermatócito primário possui um conjunto tetraplóide (duas vezes
diplóide) de material genético (cromátides).
A prófase da primeira divisão de maturação é subdividida nos estágios leptóteno,
zigóteno, paquíteno, diplóteno e de diacinese. Durante a fase leptóteno, os
cromossomos tornam-se dispostos em finos fios semelhantes a filamentos. No estágio
zigóteno, cromossomos homólogos formam pares (sinapse). Durante a fase paquíteno,

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os cromossomos contraem-se e tornam-se espessos e, ao final desta fase, começam a
se subdividir em duas cromátides.

Nas preparações microscópicas, os espermatócitos primários são facilmente

identificados quando estão nesta fase da meiose. Durante a fase diplóteno, a
subdivisão de cada um dos cromossomos das duas cromátides está completada, mas
eles permanecem unidos através do centrômero. O Crossing-over ocorre nesta
ocasião. Subseqüentemente os cromossomos encurtam-se, alargam-se, espiralizam-
se e começam a se distanciar. A contração dos cromossomos é maior durante a
diacinese na medida em que continuam a se espiralizar e a distanciar-se cada vez
mais.

A metáfase, anáfase e telófase ocorrem rapidamente. Durante estas fases os

cromossomos são inicialmente dispostos na placa equatorial da célula para serem
distribuídos para as células-filhas, em cuja oportunidade eles se desespiralizam e se
alongam. Deve-se ter em mente que os espermatócitos secundários possuem um
conjunto diplóide de material genético. Os espermatócitos secundários, pequenos, que
restam desta primeira divisão de maturação estão mais centralmente localizados que
os espermatócitos primários.

Após algumas horas de intérfase, durante a qual não ocorre nenhuma duplicação
do material genético, os espermatócitos secundários sofrem a segunda divisão de
maturação, com uma curta prófase seguida por metáfase, anáfase e telófase, que são
essencialmente semelhantes às das divisões mitóticas. Durante esta divisão, metade
do conjunto diplóide de cromossomos dos espermatócitos secundários é distribuída
para cada uma das espermátides resultantes daquela divisão. Assim, estas células
possuem um conjunto haplóide de cromossomos.

- Espermiogênese

O processo através do qual as espermátides diferenciam-se em espermatozóides

envolve um determinado número de transformações nucleares e citoplasmáticas e é
conhecido por espermiogênese. As primeiras espermátides são pequenas células

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esféricas com um núcleo central e esférico. São menores que os espermatócitos
secundários e estão localizadas numa posição mais central no túbulo.

Durante sua maturação, as espermátides estão circundadas pelos processos das

células de sustentação. Uma das primeiras mudanças é o alongamento e achatamento
do núcleo, que se torna homogêneo e cromatofílico.

Durante a fase de Golgi da espermiogênese, grânulos pré-acrossômicos

aparecem nas vesículas de Golgi e eventualmente fundem-se para formar um único
grânulo acrossômico dentro da vesícula acrossômica. Durante a fase de capuz, tanto o
grânulo acrossômico como a vesícula movem-se no sentido do pólo anterior do núcleo,
Neste ponto o grânulo acrossômico achata-se, e é agora chamado de acrossoma. A
vesícula acrossômica cresce e cobre aproximadamente os dois terços anteriores do
núcleo no capuz da cabeça. Durante a fase acrossômica, a maior parte dos
acrossomos permanece localizada no pólo anterior do núcleo, e o restante espalha-se
no interior do capuz da cabeça. Neste ponto toda a estrutura é conhecida como capuz
acrossômico.

Durante a fase de maturação, os centríolos, que anteriormente se deslocavam no

sentido do pólo caudal da célula, onde o centríolo distal origina o flagelo, retornam ao
pólo caudal do núcleo com a base do flagelo. De uma especialização da membrana
celular, semelhante a um anel, na borda caudal do capuz acrossômico, microtúbulos
projetam-se caudalmente para formar a bainha caudal, uma estrutura temporária cuja
significação não é inteiramente compreendida. Ao mesmo tempo ocorre o
alongamento da espermátide. Concorrentemente, dois anéis, um pequeno e denso e
outro maior e menos denso, surgem ao redor do centríolo distal.

O centríolo distal e o anel maior desaparecem durante a maturação posterior, e o

pequeno anel (ânulo) desloca-se distalmente e marca a extremidade distal da parte
média do espermatozóide maduro. Concomitantemente com as mudanças citadas, a
bainha caudal desaparece e as mitocôndrias formam uma espiral na periferia da parte
média.

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 A peça de ligação forma nove colunas longitudinalmente orientadas ao redor dos
centríolos, ligadas distalmente às nove fibras longitudinais periféricas, às nove duplas
fibrilas do flagelo, Finalmente, faixas semicirculares formam a bainha fibrosa ao redor
das fibras caudais na parte principal do espermatozóide.

e) Espermatozóide
Ao microscópio óptico, o espermatozóide parece consistir em essencialmente
duas partes: cabeça e cauda. Ao microscópio eletrônico, a cauda é observada como
sendo ainda subdividida em colo, parte média, parte principal e parte terminal.

- Cabeça
O formato do núcleo determina o formato da cabeça do espermatozóide. que é
dependente da espécie e sujeito a grandes variações, O pólo anterior do núcleo está
coberto pelo capuz acrossômico, rico em mucopolissacarídeos, fosfatases ácida e
alcalina, lipoglicoprproteína e hialuronidase. Estas substâncias facilitam, de modo
variável, a penetração do espermatozóide no oócito. A base do núcleo é circundada
pelo capuz pós-nuclear, que consiste em proteínas fibrosas ricas em enxofre.

- Colo
O colo é uma estrutura relativamente curta e estreita, localizada entre a cabeça e
a parte média da cauda do espermatozóide. Consiste em um centríolo centralmente
localizado e nove fibras densas periféricas, longitudinalmente orientadas e contínuas
com as fibras externas da parte média.

- Peça intermediária
O centro da parte média possui a estrutura característica de um flagelo: duas
fibrilas centrais (microtúbulos) e nove duplas periféricas (microtúbulos) compondo o
complexo do filamento axial. Estão circundadas por nove fibras externas, que
gradativamente diminuem de espessura, longitudinalmente orientadas, e que estão
ligadas às fibras da peça de ligação. Estas, por sua vez, estão circundadas por
mitocôndrias dispostas de modo helicoidal. Uni engrossamento anular da membrana
plasmática da parte média marca o limite entre a parte média e a parte principal.

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- Peça principal
A parte principal é a parte mais longa da cauda do espermatozóide. O complexo
do filamento axial possui uma estrutura idêntica à da parte média e está circundado
pelas fibras externas, continuação daquelas da parte média. As fibras estão sujeitas às
variações no tamanho e formato e gradativamente diminuem de espessura no sentido
da extremidade da parte principal. Faixas semicirculares de proteínas estruturais numa
disposição helicoidal fundem-se a duas das fibras externas para formar a bainha
fibrosa periférica característica da parte principal.

- Peça terminal
A terminação da bainha fibrosa marca o início da parte terminal, que contém
apenas o complexo de filamentos axiais. Proximalmente na peça terminal, este
complexo possui sua característica disposição nove-mais-dois; distalmente, as duplas
periféricas são pouco a pouco reduzidas a simples fibrilas que terminam em vários
níveis.

- Produção espermática
A produção espermática diária por grama de testículo no touro é de cerca de 13 a
19 x 106. A produção espermática no touro aumenta com a idade de sete anos. Geral-
mente a produção é maior do que a quantidade expelida, conforme se verificou pela
contagem de espermatozóides colhidos em ejaculações.

f) Túbulos retos
Os túbulos retos ligam os túbulos seminíferos à rede testicular. Em todos os
mamíferos domésticos, a maioria dos túbulos seminíferos termina na vizinhança da
rede testicular; eles se continuam com os túbulos retos, que são curtos e possuem
percurso reto ou tortuoso. Os túbulos retos são revestidos por epitélio simples cúbico
ou pavimentoso. Freqüentemente, uma acumulação semelhante a um tampão de
células de sustentação projeta-se da parte terminal do túbulo contorcido para o interior
da parte inicial do túbulo reto.

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g) Rede testicular
Canais irregularmente anastomosantes, circundados por tecido conjuntivo frouxo
do mediastino testicular, representam a rede testicular. Ela é formada por um epitélio
simples cúbico ou um epitélio simples pavimentoso; no touro o epitélio pode ser
pseudoestratificado cúbico de duas camadas.

h) Envoltórios testiculares
O testículo, o epidídimo e a parte inicial do cordão espermático estão localizados
dentro de uma evaginação da parede abdominal ventral, conhecida como os
envoltórios testiculares. Eles consistem em escroto que é composto do tegumento e
das fáscias superficial e profunda, o músculo cremáster externo e sua fáscia de
cobertura, fáscia abdominal transversa camada parietal do peritônio.

A epiderme escrotal é relativamente delgada, com número variado de pêlos e

abundantes glândulas sebáceas e sudoríparas apócrinas. A derme no touro repousa
sobre a hipoderme, conhecida como a túnica danos. A camada superficial da túnica
dartos é composta de delgados filamentos de células musculares que penetram na
derme e unem-se às paredes dos vasos sanguíneos do escroto por tendões elásticos -
a camada profunda consiste em grandes filamentos de células musculares lisas e
fibras elásticas que se contraem sob estimulação térmica ou mecânica, resultando no
alongamento da pele escrotal.
O testículo está seguro à parede do processo vaginal ao longo da linha de sua
união epididimária. O epidídimo está intimamente aposto sobre a superfície testicular
e o ponto de origem dos ductos eferentes da rete testis situa-se sob a cabeça do
epidídimo plana e expandida.

i )Túnica vaginal
Quando o testículo é removido do escroto, a camada parietal da túnica vaginal
permanece unida ao escroto, enquanto a camada visceral, a cobertura peritonial do
testículo (e epidídimo), permanece intimamente associada à cápsula subjacente do
testículo, a túnica albugínea. A camada visceral da túnica vaginal consiste em um
mesotélio e uma camada de tecido conjuntivo que se une com a túnica albugínea.

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j) Túnica albugínea
A túnica albugínea é uma cápsula relativamente delgada, mas sólida, de tecido
conjuntivo denso irregular. Consiste predominantemente em fibras colágenas e
algumas fibras elásticas.

Túnica vaginal visceral

Túnica vaginal parietal

Testículo bovino apresentando revestimentos das túnicas vaginais visceral e parietal

l) Termo-regulação testicular
O testículo é irrigado com sangue da artéria testicular, que se origina da aorta
dorsal próximo à localização embrionária dos testículos. A artéria pudenda interna
irriga a genitália pélvica e ramificações deixam a pelve no arco isquiático para suprir o
pênis. A artéria pudenda externa deixa a cavidade abdominal através do canal inguinal
para suprir o escroto e o prepúcio.

Para um funcionamento eficaz, os testículos dos mamíferos devem ser mantidos

em temperatura inferior à do corpo. Características anatômicas dos testículos e do
saco escrotal permitem a regulação da temperatura testicular. A pele escrotal é
notavelmente falha em gordura, mas abundantemente dotada de glândulas
sudoríparas. O seu componente muscular (túnica dartos) propicia alterar a espessura
escrotal, assim como sua área de superfície, além de variar a proximidade de contato
dos testículos com o corpo do animal.

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 Em temperaturas frias, os músculos dartos se contraem, elevando os testículos,
ao mesmo tempo em que torna as paredes escrotais mais espessas e enrugadas. Em
temperaturas quentes os músculos relaxam, abaixando os testículos para o saco
escrotal penduloso e com paredes finas. As vantagens oferecidas por estes
mecanismos são favorecidas pela relação das veias e artérias.

Em todos os animais domésticos, a artéria testicular é uma estrutura enrolada em

forma de cone, cuja base repousa no pólo cranial ou dorsal do testículo. Estas espirais
arteriais são enredadas pelo chamado plexo pampiniforme das veias testiculares. Esta
disposição proporciona um contra corrente pelo qual o sangue arterial que entra nos
testículos é resfriado pelo sangue venoso que os deixa seu curso do anel inguinal
interno até a superfície dos testículos; a temperatura sangüínea nas veias aumenta
similarmente entre os testículos e o anel inguinal externo. A posição próxima à
superfície testicular das artérias e veias tende a aumentar a perda direta de calor rins
testículos.

A posição dos testículos relativa ao coração, em uma região onde ocorre pouca
atividade muscular, promove um mecanismo realmente incomum de retorno
sangüíneo; o retorno venoso e promovido pelo íntimo contato entre artérias e veias.
Uma característica particular do suprimento sangüíneo dos testículos e no caso, mais
difícil de ser explicada, é a ausência de uma corrente pulsátil.

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m) Epidídimos
O epidídimo consiste em um longo ducto epididimário e em dútulos eferentes, que
ligam a rede testicular ao ducto epididimário. Está circundado por uma espessa túnica
albugínea de tecido conjuntivo denso irregular, coberta pela camada visceral da túnica
vaginal. No epidídimo são reconhecidas três partes anatômicas: a cabeça do
epidídimo, onde um número variável (6 a 20) de dútulos no ducto do epidídimo
forma uma estrutura plana aplicada sobre um pólo do testículo. Em seguida a
cabeça liga-se ao estreito corpo do epidídimo que termina no pólo oposto,
constituindo a cauda do epidídimo.

Cabeça do
epidídimo
Testículo

Ducto
deferente Corpo do
epidídimo
Cauda do
epidídimo
Túnica vaginal parietal

Testículo e porções do epidídimo bovino.

n) Ductos eferentes
Entre 12 e 25 dútulos eferentes originam-se da rede testicular. Sua disposição
mostra grosseiramente o formato de um cone com a extremidade apontando no
sentido da rede testicular. São forrados por epitélio pseudo-estratificado cilíndrico
ciliado. As células ciliadas ajudam a deslocar o espermatozóide no sentido do ducto
epididimário. As células não-ciliadas e dotadas de microvilos estão provavelmente
envolvidas como processos de reabsorção, enquanto outras possuem atividade
excretora. O dútulo eferente e as partes iniciais do ducto epididimário constituem a
cabeça do epidídimo.

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o) Ducto epididimário
O ducto epididimário possui um trajeto extremamente tortuoso e espiralado e
compõe o corpo e a cauda do epidídimo. A ocorrência de invaginações nas bases dos
microvilos e a presença de vesículas revestidas no citoplasma são indicativas de
atividade de reabsorção.

p) Ductos deferentes
O ducto deferente deixa a cauda do epidídimo sendo mantido em uma alça
separável do resto do cordão espermático. Possui uma parede muscular espessa e
sua porção terminal é provida de glândulas tubulares ramificadas. Ele penetra na
uretra pélvica pelo colículo seminal. No touro esta porção forma uma distinta ampola.
Estas apresentam paredes musculares que expelem o sêmen dos ductos deferentes
para dentro da uretra; este processo de emissão é apenas um dos componentes do
processo de ejaculação.

q) Glândulas acessórias
O ejaculado é constituído não só dos espermatozóides, mas também do fluido
produzido pelas glândulas acessórias masculinas. As glândulas vesiculares, a
próstata, e as glândulas bulbo-uretrais emitem as suas secreções dentro da uretra,
onde, por ocasião da ejaculação, são misturadas com a suspensão fluida de
espermatozóides e com as secreções ampolares dos ductos deferentes. Todas as
glândulas acessórias são essencialmente do tipo lobular-ramificado-tubular com
musculatura lisa proeminente no tecido intersticial.

r) Glândulas vesiculares
As glândulas vesiculares são glândulas compostas túbulo-alveolar ou tubular. O
produto secretor gelatinoso, branco ou branco-amarelado da glândula vesicular totaliza
aproximadamente 25 a 30% do total do ejaculado no touro. Ele é rico em frutose, que
serve como fonte energética para os espermatozóides ejaculados. Estão situadas
lateralmente às porções terminais dos ductos deferentes

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 Ducto deferente

Ampola

Glândulas vesiculares

s) Glândula prostática
A próstata circunda a uretra pélvica ao nível do colículo seminal. É uma glândula
composta, túbulo-alveolar (ruminantes) em que duas partes podem ser distinguidas: a
parte externa ou compacta (corpo da próstata), e a parte interna ou disseminada
(porção disseminada). A parte externa circunda inteiramente a parte pélvica da uretra
ou então cobre parte de sua superfície dorsal. A parte disseminada está localizada na
lâmina própria submucosa da uretra pélvica.
As partes secretoras e os ductos da próstata são circundados por tecido
conjuntivo frouxo contendo células musculares lisas, particularmente abundantes na
parte externa da glândula. Grandes trabéculas predominantemente musculares na
parte externa da glândula separam tanto a parte externa como a interna em lóbulos
individuais. A parte interna da próstata está circundada pelo músculo estriado uretral.

t) Glândulas bulbo-uretrais
São órgãos pares situados dorsalmente à uretra próximos à extremidade de sua
porção pélvica. No touro são quase ocultas pelo músculo bulbo-esponjoso. É uma
glândula composta, túbulo-alveolar no touro. No touro, curtos segmentos de ligação
unem as partes secretoras aos ductos coletores, que são forrados por epitélio simples
cúbico (às vezes também secretor). O produto de secreção mucoso e protéico da
glândula bulbo-uretral é descarregado antes da ejaculação nos ruminantes, onde
aparentemente serve para neutralizar o ambiente uretral e lubrificar tanto a uretra
como a vagina.
3.4) Avaliação das glândulas acessórias

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 Nas grandes espécies animais é possível a palpação das glândulas acessórias
por via retal. As glândulas vesiculares do touro são rapidamente detectáveis, situando-
se cada uma lateralmente à ampola; o corpo da próstata é palpado como uma
proeminência lisa e firme caudalmente ao colo da bexiga. As glândulas bulbo-uretrais,
devido à sua cobertura muscular, não são identificáveis no touro.

a) Uretra
A uretra masculina pode ser subdividida em parte pélvica que se estende da
bexiga urinária até ao nível onde a uretra penetra no bulbo do corpo esponjoso do
pênis, a parte bulbar e uma parte peniana que se estende da extremidade da abertura
bulbosa até a abertura externa da uretra. Em toda a sua extensão a uretra é
circundada por tecido cavernoso vascular. Toda a mucosa uretral forma pregas
longitudinais que se achatam ou desaparecem durante a ereção e a micção.

b) Pênis
O pênis é o órgão que atua como a passagem comum da urina e do ejaculado
sendo portanto parte do sistema urinário e também um órgão copulador. O pênis
consiste em raiz do pênis, corpo do pênis e glande. O corpo do pênis, que é composto
por duas estruturas eréteis: os corpos cavernosos do pênis, e está unido ao arco
isquiático pelos pilares do pênis na região da raiz. O corpo cavernoso do pênis
continua para o ápice do pênis, mais ou menos como um corpo cavernoso dorsal
emparelhado.

Glande

Processo
uretral Parte livre do
pênis

Uma espessa cobertura colágena (túnica albugínea) recobre os corpos

cavernosos e dela numerosas trabéculas, penetram no corpo cavernoso para manter

20
seu tecido cavernoso. Um par de músculos lisos retratores do pênis origina-se das
regiões sacra ou coccígea da coluna vertebral, sendo especialmente desenvolvidos em
ruminantes e suínos. Nestes animais, os músculos retratores do pênis são capazes de
controlar o efetivo comprimento do pênis por sua ação na flexura sigmóide. No touro,
os espaços cavernosos do corpo cavernoso do pênis são pequenos, com exceção nos
pedúnculos e na curvatura distal da flexura sigmóide.

c) Glande do pênis
Os tecidos subcutâneos da extremidade livre do pênis formam em algumas
espécies um corpo cavernoso bem desenvolvido. Este, porém, é escassamente
desenvolvido nos touros.

d) Prepúcio
O pênis está unido à parede abdominal ventral pelas fáscia superficial e profunda.
Lateral e ventralmente, ele está circundado por pele. A glande e a parte cranial do
pênis estão localizadas numa reflexão tubuliforme da pele, o prepúcio. A camada
externa reflete-se para o interior da abertura prepucial, constituindo a camada interna
do prepúcio e formando desta maneira uma estrutura tubular. O prepúcio pode ser
dividido em porções peniana e pré-peniana. A eversão do forro do prepúcio pode expor
o epitélio a lesões e infecções.

e) Ereção e Protrusão
O estímulo sexual provoca dilatação das artérias que suprem os corpos
cavernosos do pênis. O enrijecimento do pênis dos ruminantes é principalmente devido
ao músculo ísquio-cavernoso que bombeia o sangue dos espaços cavernosos dos
pedúnculos para o restante do corpo cavernoso do pênis por meio de espaços
cavernosos longitudinais especiais (canais da ereção).

A estimulação parassimpática promove o relaxamento das células musculares

lisas nas artérias helicíneas, resultando no aumento do fluxo sanguíneo nos espaços
do tecido erétil. O maior volume sangüíneo comprime as veias e subseqüentemente
diminui o fluxo de saída, eventualmente preenchendo os espaços do os tecido erétil
nos corpos cavernosos e esponjosos do pênis e na glande do órgão.

21
 Altos picos de pressões foram registrados nestes corpos cavernosos durante a
ereção em touros. A crescente pressão no corpo cavernoso produz considerável
alongamento do pênis bovino, com pouca dilatação. Quando o pênis do touro está em
protrusão, as porções peniana e pré-peniana do prepúcio ficam evertidas sobre o
órgão.

A penetração do pênis do touro dura cerca de dois segundos e o enrijecimento

após o desembainhamento, com freqüência ocorrem abruptamente assim que o
ligamento dorsal apical assegura sua ação de conservar o pênis reto. O recolhimento
do pênis para dentro do prepúcio dá-se após cessar a pressão nos espaços
cavernosos. A arquitetura fibrosa do corpo cavernoso o pênis na região da flexura
sigmóide tende a formar de novo a flexão, no que é auxiliada pelo encurtamento do
músculo retrator do pênis.

A contração das células musculares lisas da túnica albugínea, das trabéculas e

do tecido erétil faz com que o pênis volte ao estado flácido. Nos ruminantes e no
porco, o músculo retrator do pênis desempenha um papel essencial na retração do
pênis para dentro do prepúcio.

3.5) Resumo das Funções do Aparelho Reprodutivo Masculino

1) Produção de Gametas
2) Produção de Hormônio
3) Transporte de Gametas
4) Excreção de urina
5) Ejaculação

22
4) Constituição do ejaculado do touro

O ejaculado consiste no sêmen que é composto de parte sólida

(espermatozóides) e parte líquida (plasma seminal). Os espermatozóides são células
haplóides, atualmente especializadas, divididas, essencialmente, em: cabeça e cauda.
A cabeça é constituída por núcleos de DNA, densamente compactados, envolvidos em
sua extremidade anterior pelo acrossoma (uma dupla camada de membranas que
contém as enzimas hidrolíticas necessárias à fertilização). A cauda, dividida em quatro
partes (colo e peças intermediárias, principal e terminal), é composta por nove pares
de microtúbulos que envolvem dois filamentos centrais formando o axonema, que é
responsável pela motilidade espermática.

O plasma seminal é uma secreção composta de diversas substâncias oriundas

de várias fontes, glândulas acessórias ao trato reprodutivo (próstata, vesículas
seminais, glândulas bulbo-uretrais), testículos e epidídimos que fornece os nutrientes
para o metabolismo e motilidade dos espermatozóides. Entre as substâncias
encontradas, estão a frutose, sorbitol, ácido cítrico, inositol, glicerilfosforilcolina, sódio,
potássio, cálcio, magnésio e cloretos.

Também estão presentes constituintes antimicrobianos, imunoglobulinas e uma

variedade de substâncias hormonais incluindo andrógenos, estrógenos,
prostaglandinas. FSH, LH material semelhante a gonatrofina coriônica, hormônio do
crescimento, insulina, glucagon, prolactina, relaxina, hormônios liberadores da tireóide
e encetalinas. Além de propiciar um veículo líquido para transporte dos
espermatozóides, o plasma e uma fonte de fornecimento dos elementos necessários
ao desempenho deles, com destaque para a frutose e o ácido cítrico, especialmente,
quando considerada a monta natural. A quantidade do sêmen e, especialmente, o
número e a qualidade dos espermatozóides estão sujeitos a variações dentro de
amplos limites e são influenciados por numerosos fatores exógenos e endógenos. O
touro ejacula entre 1,7 e 9 ml de sêmen contendo aproximadamente um milhão de
espermatozóides por microlitro.

23
5) Principais patologias relacionadas ao aparelho reprodutor masculino

5.1) Hipoplasia testicular

Distúrbio congênito caracterizado por pouco, ou nenhum, desenvolvimento do

espermatogênico. É hereditário e causado por um gene autossômico de penetrância
incompleta, podendo ser uni ou bilateral e, dependendo da severidade do
acontecimento, pode levar o animal à esterilidade. Entretanto, a forma de
apresentação: bilateral severa não é tão comum e é, por si só, seletiva. As formas
parciais e menos severas são de mais difícil diagnóstico, mas de todo modo, os
animais acometidos devem ser excluídos de qualquer rebanho visto que a patologia é
completamente irreversível.

5.2) Degeneração testicular

Caracteriza-se por distúrbios ou parada, da espermiogênese devidos a atrofia
do epitélio seminal. Assim o animal que apresentava fertilidade normal, ou potencial
para isso, mostra uma queda em sua capacidade reprodutiva, podendo mesmo chegar
à esterilidade. Pode tanto ter causas endógenas como exógenas e a sua
reversibilidade depende da duração e intensidade da causa desencadeadora do
processo. Devemos considerar também a sensibilidade racial e individual, bem como,
a idade do animal afetado.

5.3) Disfunção do epidídimo

Ocorre devido ao desequilíbrio iônico, o qual modifica a pressão osmótica do

plasma epididimário e leva ao aparecimento de patologias espermáticas transitórias
(detectadas através do teste de exaustão) como, por exemplo, altas porcentagens de
defeitos de cauda, dag defect, head aglutination. Tais condições podem ser reversíveis
ou não para o animal, já que nem todos os defeitos observados são decorrentes da
estrutura dos espermatozóides e podem ser temporários, como somente decorrentes
de regime nutricional desequilibrado

24
5.4) Impotência Coeundi

É definida como a incapacidade ou dificuldade de cópula, mas a capacidade de

fertilização pode estar preservada. É uma alteração psicossomática originária das mais
diversas causas, desde a insuficiência da libido até injúrias físicas propriamente, como
por exemplo, lesões nos cascos ou na coluna vertebral, balonopostites, perturbações
centrais ou periféricas da ereção, infantilismo peniano, ect. A reversibilidade das
lesões depende da extensão do comprometimento e da possibilidade de remoção da
causa em tempo hábil.

5.5) Espermiogênese imperfeita

Sobre esta denominação estão incluídas as alterações espermáticas de origem

congênitas hereditárias, ou não que podem aparecer no espermiograma e nem sempre
são enquadráveis em outros diagnósticos já melhor estabelecidos, mas que são
extremamente repetitivas. Exemplos: knobbed sperm, outros defeitos de acrossoma,
da bainha mitocondrial.

25
6) Material empregado para exame andrológico
6.1) Coleta de sêmen (eletroejaculação)
● Eletroejaculador
● Tubos de 15 ml
● Tubos de 15 ml
● Haste para tubo de 15 ml
● Luva de palpação
● Capa de proteção para tubo de 15 ml
● Luva de procedimento
● Tesoura, detergente, papel

6.2) Coleta de sêmen (vagina artificial)

● Vagina artificial
● Tubos de 15 ml
● Camisa de látex
● Aquecedor de água
● Termômetro
● Gel lubrificante, detergente, papel
● Luva de procedimento

6.3) Avaliação do sêmen

● Microscópio
● Lâmina e lamínula
● Ponteira e pipetas
● Placa aquecedora
● Papel higiênico
● Corante (panótico)
● Formol salina
● Formolcitrato
● Tubos de 15 ml
● Câmara de Newbauer
● Óleo de imersão

26
7) Avaliação do Sêmen - Sequência de exame andrológico

- Identificação detalhada

- Anamnese indivíduo e rebanho

- Exame físico geral

- Exame clínico do sistema genital

- Espermograma

- Exames complementares

- Teste de Libido

- Diagnóstico e/ ou Conclusão

7.1) Identificação detalhada

a) Identificação do animal:

Nome, registro, espécie, raça, pelagem, nascimento, idade, peso/ escore corporal.

b) Identificação do proprietário

Nome, endereço, telefone, propriedade, endereço da propriedade, inscrição de

produtor.

7.2) Anamnese do indivíduo

Anamnese: deve relatar sucintamente, não apenas o motivo da realização do

exame, mas também, ocorrências relevantes sobre o animal: estado corporal, doenças
anteriores, tipo de utilização do reprodutor, tratamentos realizados, sistema de
alimentação, aspecto dos descendentes, etc.

27
7.3) Anamnese do rebanho

Informações importantes a serem levantadas: estado corporal e sanitário, tipo

de utilização do reprodutor, relação touro/ vaca, taxa de gestação, sistema de
alimentação, esquema de vacinações, esquema de controle de parasitas, manejo
(presença de fêmeas, outros machos), tipo de criação (extensiva/ semi-intensiva/
confinamento).

7.4) Exame físico geral

• Inspeção
• Condição nutricional
• Condição física geral
• Temperamento
• Aprumos (membros, pernas, pés/ cascos)
• Presença de ferimentos
• Presença de ectoparasitas
• Idade
• Simetria geral e ausência de sinais de doenças

7.5) Exame clínico do sistema genital

a) Órgãos externos

• Inspeção, palpação, ultra-sonografia

• Presença e dimensões
• Consistência
• Simetria
• Mobilidade
• Compatibilidade com idade e desenvolvimento corporal
• Medida da circunferência escrotal

28
b) Órgãos internos

• Palpação, ultra-sonografia
• Presença e dimensões
• Consistência
• Simetria

c) Escroto

• Examinar escroto e conteúdo

• Considerar condições da pele
• Mobilidade
• Sensibilidade
• Espessura
• Temperatura
• Circunferência escrotal

d) Testículos

• Forma, simetria e consistência

• Mobilidade
• Sensibilidade
• Temperatura

e) Medida da circunferência escrotal

A medida da circunferência escrotal tem sido recomendada e usada com

freqüência no exame andrológico por ser um procedimento de fácil execução, prático e
de alta repetibilidade, apresentando ainda alta correlação com a produção espermática
diária, associação positiva com caracteres de crescimento e precocidade sexual, com
alta herdabilidade e com correlação positiva com a libido.

29
 Medição da circunferência escrotal usando fita métrica

O perímetro escrotal mínimo aceitável varia de acordo com as sub-espécies,

raças e com a faixa etária em que se encontra o reprodutor. Para a subespécie Bos
taurus taurus estes parâmetro podem ser norteados conforme proposta da “Beef
Improvement Federation, 1994, de acordo com a tabela a seguir:

Tabela- Classificação de touros Bos taurus taurus baseada no perímetro escrotal

IDADE (meses) Muito bom Bom Questionável

12 - 14 > 35 30 - 35 < 30

15 - 20 > 37 31 - 37 < 31

21 - 30 > 39 32 - 39 < 32

Acima de 30 > 40 33 - 40 < 33

Beef Improvement Federation, (1994).

Para o Bos taurus indicus, a classificação de acordo com Fonseca (1997)

(predominanemente touros da raça nelore e particularmente para a raça nelore de
acordo com os dados de Lobo (1997) (comunicação pessoal) está expressa nas
tabelas a seguir.

Tabela- Classificação de touros Bos taurus indicus baseada no perímetro escrotal

30
 IDADE
Excelente Muito Bom Bom Questionável
(meses)
7 a < 12 21,0 19,5 < 21,0 17,5 < 19,5 < 17,5
12 a < 18 26,0 24,0 < 26,0 21,4 < 24,0 < 21,5
18 a < 24 31,5 28,5 < 31,5 26,0 < 28,5 < 26,0
24 a < 36 35,0 32,0 < 35,0 29,0 < 32,0 < 29,0

36 a < 48 37,0 33,5 <37,0 30,5 < 33,5 < 30,5

> 48 39,0 36,0 < 39,0 33,0 < 36,0 < 33,0
Acima de 60 >38 36 - 38 33 - < 36 < 33
Fonseca et al., 1997.

Tabela - Classificação de touros jovens (NELORE) criados a pasto, baseado no

perímetro escrotal

IDADE
Média Muito Bom Bom Questionável
(meses)
11 - 13 19,5 > 23,5 21,0 - 23,5 < 21,0

14 - 16 22,8 > 28,0 24,5 - 28,0 < 24,5

17 - 19 25,9 >31,5 28,0 - 31,5 < 28,0
20 - 22 28,2 > 33,5 30,0 - 33,5 < 30,0

23 - 25 29,8 > 35,0 31,5 - 35,0 < 31,5

26 - 28 31,3 > 36,0 32,5 - 36,0 < 32,5
29 - 31 32,2 > 36,5 33,5 - 36,5 < 33,5
> 31 35,2 > 40,5 37,0 - 40,5 < 37,0
Programa de Melhoramento Genético de Nelore – CNCP-Lôbo, R. B. (1997, com. pessoal)

Devido à importância deste parâmetro nas características reprodutivas e

produtivas de bovinos, Fonseca et al. (1997), elaboraram uma tabela onde os touros

31
são classificados de acordo com os parâmetros físico-morfológicos do sêmen e a
circunferência escrotal.

Classificação andrológica de touros zebuínos, com base na circunferência escrotal e

características
TABELA 3: Classificação físico-morfológicas
andrológica de touros do sêmen.com base na
zebuínos,
circunferência escrotal características físico-morfológicas do sêmen

Classificação
Parâmetros
Excelente Muito Bom Bom Questionável

Motilidade espermática
Vigor 5 4–5 3–4 <3
Motilidade progressiva (%) 75 60-70 30-60 < 30
Pontos outorgados 21-25 16-21 10-16 < 10

Morfologia Espermática
Defeitos maiores (%) 5 5-10 10-20 > 20
Defeitos totais (%) 10 10-15 15-30 > 30
Pontos outorgados 30-35 25-30 15-25 < 15

Circunferência Escrotal (cm)

Idade em meses
07-12 21,0 19,5-21,0 17,5-19,5 < 17,5
12-18 26,0 24,0-26,0 21,5-24,0 < 21,5
18-24 31,5 28,5-31,5 26,0-28,5 < 26,0
24-36 35,0 32,0-35,0 29,0-32,0 < 29,0
36-48 37,0 33,5-37,0 30,5-33,5 < 30,5
> 48 39,0 36,0-39,0 33,0-36,0 < 33,0
Pontos outorgados 35-40 25-36 15-25 < 15
Total de Pontos* 86-100 66-86 40-66 < 40

Fonseca et al. (1997)

f) Epidídimos e cordões espermáticos

Simetria, forma, volume, posição, consistência, mobilidade

g) Prepúcio

Óstio prepucial, mucosa, posição, integridade!

h) Pênis

Forma, tamanho, exposição/ retração, integridade, mal-formações.

32
i) exemplos de algumas patologias penianas:

Hematoma prepucial Abscesso prepucial

Fibropapiloma Frênulo persistente

j) Glândulas anexas

Simetria, forma, volume, tamanho, posição, consistência

7.6) Espermograma

Conjunto de avaliações realizadas no sêmen que visa determinar a viabilidade

do mesmo para a fecundação. É dividido em duas etapas. Avaliação das
características físicas e morfológicas do sêmen. A primeira etapa para o
espermograma é a coleta de sêmen.

a) Métodos de coleta de sêmen - Eletroejaculação

É o método mais comumente utilizado quando o animal não aceita a vagina

artificial ou outros. Na eletroejaculação bifásica, o sêmen e o plasma seminal são

33
liberados através da contração dos músculos uretrais, na uretra. Na eletroejaculação,
em geral, é eliminado primeiramente o plasma seminal ou pré-ejaculado que é menos
denso. Entretanto, o importante no exame seminal é a fração de densidade maior, rico
em espermatozóides.

O sêmen é coletado em tubos graduados e aquecidos a 38ºC, para se evitar o

choque térmico, e protegidos das patas dos animais. O sêmen em contato com pêlo
prepucial pode sofrer queda de motilidade por causa do choque térmico. O sêmen
obtido através do eletroejaculador mostra uma concentração menor e volume maior,
devido ao plasma seminal, quando comparado ao colhido através da vagina artificial,
mas apresenta, após o congelamento, boa qualidade e fertilidade semelhante aos
obtidos por outros métodos de coleta.

Coleta de sêmen com o uso de equipamento de eletroejaculação

b) Uso da Vagina Artificial

É o método em que o ejaculado mais se aproxima do depositado na vaca no ato

da monta. Este método permite que o touro sirva naturalmente, possibilitando a
avaliação do comportamento sexual. Muitas vezes é necessária uma fêmea em cio,
contida, para estimular o reprodutor a montar. No entanto, este método só é praticável
com touros dóceis e bem manejados ou treinados para esta finalidade.

Alguns touros só montam após observarem outros montarem em fêmeas

contidas. O zebuíno exige mais paciência devido ao seu temperamento. Geralmente,
para exame de sêmen, esperam-se alguns minutos (15-30 minutos) para o touro se
manifestar e subir na fêmea antes de se optar por um outro método de coleta.

34
 Coleta de sêmen com uso de manequim e vagina artificial

A vagina artificial, quando fria, prejudica a ejaculação do touro, e, quando muito

quente, pode afetar o pênis e provocar estresse, apesar de, às vezes, ser coletado
somente com temperaturas acima de 50ºC. A lubrificação deve ser com vaselina
estéril.

Antes da coleta, o touro deve sofrer higienização dos membros, posteriores e

anteriores, e do prepúcio. No momento da coleta, o pênis é que deve ser conduzido à
vagina artificial, e não a vagina ao pênis. Uma só coleta seria suficiente para o exame
andrológico imediato, porém, conhecimento mais perfeito do touro só é possível com
duas ou três coletas. Um touro, através da vagina artificial, pode ter sêmen coletado
até diariamente em casos especiais, porém duas vezes por semana é o suficiente para
manter a produção espermática normal sem queda da concentração espermática.

c) Massagem das vesículas seminais e ampolas dos dutos deferentes

Na impossibilidade da utilização do eletroejaculador ou vagina artificial para

coletar o sêmen, pode-se obter uma amostragem através da massagem dos órgãos
genitais internos, vesículas e ampolas dos dutos deferentes. No entanto, este é um
método muito limitado para a obtenção de inseminação artificial de esperma, apesar
de o sêmen ser mais concentrado do que o obtido na eletroejaculação.

A coleta deve ser realizada com os mesmos cuidados que na eletroejaculação,

tanto na preparação do animal como no ato de coletar. A primeira fração obtida é
secreção glandular e é seguida de esperma rico em células.

35
d) Cuidados no manuseio do sêmen:
Para que o sêmen seja avaliado sem alterações de suas características,
preservando sua condição sanitária e viabilidade espermática, devemos ter o cuidado
de manter as amostras a 37-38°C, utilizando apenas material limpo, seco e pré-
aquecido, na ausência de substâncias tóxicas, evitando a contaminação por água e a
ação de raios solares.

e) Características físicas do ejaculado

- Volume
O volume do ejaculado pode ser medido diretamente no tubo de coleta, de
forma simples, ou pesando-se o material e determinando-se o seu volume pela
densidade. Instrumentos de precisão (provetas e pipetas) também podem ser
utilizadas quando se deseja mais precisão na medição do volume.

Fatores que afetam o volume seminal

O ejaculado bovino varia de 1 a 15 ml, podendo ocorrer variação de ordem individual,
ou ainda de acordo com o método de coleta, frequência de ejaculação, idade,
estimulação antes da ejaculação, estação de monta, condições clínicas, etc.

- Aspecto (cor e aparência)

A cor do sêmen pode variar do cinza ao amarelo passando pelo branco.

Algumas alterações na cor podem indicar contaminação ou caracterizar patologias ex:
vermelhada (sangue vivo), marrom (sangue hemolisado), cinza escuro (sujeira).

36
 Amostras de sêmen com diferentes colorações

Aparência
A aparência do sêmen pode variar de acordo coma concentração espermática,
de cremosa a aquosa.

1. Cremoso: mais de 1 bilhão de Sptz/ ml.

2. Leitoso: 500 milhões a 1 bilhão de Sptz/ ml.
3. Opaco: 200 milhões a 500 milhões Sptz/ ml.
4. Translúcido/ aquoso < 200 milhões Sptz/ ml.

Osmolaridade: normal 290 – 310 mOsm

pH: normal 6,9 – 7,7

Turbilhonamento ou movimento de massa

O turbilhonamento é o movimento de massa espermática, em forma de ondas,

classificado de 0 a 5, de acordo com sua intensidade. Avalia-se colocando uma gota
de sêmen recém colhido em uma lâmina aquecida e observando-se o movimento de
massa em microscopia óptica comum, em aumento de 40x ou 100 vezes. O
turbilhonamento varia em função do vigor, concentração e da motilidade espermática.

37
Classificação do turbilhonamento

5 = deslocamento intenso com ondas espessas;

4 = ondas com rápidos movimentos;
3 = ondas aparentes, com movimentos moderados;
2 = ondas em movimentos pouco perceptíveis;
1 = não tem ondas, células móveis

Motilidade
A motilidade progressiva é o movimento retilíneo dos espermatozóides. É
determinada em porcentagem de células com tal movimento. Avalia-se colocando uma
gota de sêmen recém colhido em lâmina aquecida, sob lamínula e observando-se em
microscopia óptica comum em um aumento de 400 vezes. Além da motilidade
progesssiva, outros padrões também podem ser encontrados: circular, retrógrado ou
estacionário

Vigor
O vigor é a intensidade de movimento dos espermatozóides. É classificado de 0
a 5 de acordo com a sua intensidade. Avalia-se na mesma ocasião que a motilidade
progressiva. A avaliação é dada por notas de 1 a 5:

Classificação do vigor
5 = células deslocam-se no campo do microscópio em alta velocidade e mais de 80%
das células móveis apresentam motilidade progressiva;
4 = as células movimentam-se rapidamente e apenas 60% a 80% das móveis
apresentam motilidade progressiva;
3 = o movimento progressivo existe em cerca de 40% a 60% dos espermatozóides já
com alguns rápidos, outros lentos, utilizando os movimentos de flagelo;
2 = movimentos lentos em 20% a 40% das células com número razoável que se
movimentam em círculo e oscilatoriamente;
1 = o deslocamento dos espermatozóides é muito lento e predominam os movimentos
circulatórios, oscilatórios e retrógrados

38
Concentração:

A concentração espermática é definida pelo número total de espermatozóides

por ml de sêmen. A concentração pode ser obtida pelo uso de um hemocitômetro
(câmara de Neubauer) ou equipamento específico para determinação da
concentração, denominado espectrofotômetro.

No espectrofotômetro é feita a leitura da concentração em transmitância (T) na

faixa de 550 nm de comprimento de onda em espectrofotômetro. Em seguida,
comparado o resultado numa tabela previamente preparada, através de equação de
regressão de uma amostra de sêmen de concentração conhecida.

É o método mais utilizado em laboratórios especializados. A concentração é de

extrema importância para determinar a capacidade produtiva de sêmen do animal,
estimar número de fêmeas que poderão ser cobertas pelo reprodutor e ainda para
efeito de diluição de sêmen e determinação do número de doses de sêmen que
poderão ser produzidas com um ejaculado.

Fatores que afetam a concentração:

• estação
• frequência de ejaculação
• tamanho testicular
• idade
• fatores nutricionais, etc

39
Contagem Espermática em Câmara de Neubauer-hemocitômetro

1. Homogeneização da amostra

2. Diluição: 20 μl de sêmen, em 4 ml de água (diluição final de 1:200).

3. A amostra é colocada no hemocitômetro, aguarda-se 5 minutos e é realizada a

contagem dos espermatozóides em cinco quadrados maiores, num sentido diagonal,
desde a parte superior esquerda à inferior direita da superfície quadriculada da
câmara.

4. Devem ser considerados os espermatozóides contidos em cada quadrado e também

aqueles que se encontram na linha que forma o ângulo superior direito do quadrado a
ser contado.

5. A contagem deve ser feita nos dois lados da câmara e o resultado será a média dos
dois lados. A concentração dos espermatozóides por mililitro, no ejaculado, será o
número obtido na câmara multiplicado por 10.000.000 na diluição de 1:200.

Fórmula para determinar a concentração inicial

Nº sptz/ mm3 = Nº sptz x fator de dil. x fator de correção da câmara (4000) = n x 10.000
80 (n º quadrados contados em 5 quad. grandes)

Câmara de Newbauer com espermatozóides

40
- Características morfológicas dos espermatozóides

Para a avaliação das características morfológicas, podem ser adotados dois

procedimentos:

Primeiramente, execução de, pelo menos, 2 esfregaços puxados em lâminas

limpas e a 37°C, para posterior coloração, aliada à mistura de algumas gotas do
sêmen em aproximadamente 1 ml de formol- salina- tamponada com algumas gotas do
sêmen, para o exame completo em microscopia de contraste de fase.

No primeiro caso, os esfregaços preparados, que tanto podem ser corados pelo
método de Williams ou pelo corante panótico e são submetidos à microscopia
convencional, em aumento de 1.000 vezes, sob imersão. Após uma visualização global
das células presentes na lâmina, devem ser contadas, no mínimo 200 células para
estabelecimento de percentual entre aquelas normais e as que apresentam defeitos,
de forma ou estruturais. Entretanto, nesse exame são especificados apenas os
defeitos de forma, subdivididos em maiores e menores, quais sejam: maiores
(subdesenvolvido, cabeça isolada patológica, estreito na base, piriforme, pequeno
anormal, contorno anormal e formas teratológicas), menores (cabeça delgada,
pequena normal, gigante, curto- largo e abaxial - reto - abaxial - oblíquo).

O outro método para a avaliação das patologias emprega a microscopia de

contraste defase. Nesse tipo de exame após homogeneização do material, coloca-se
uma gota entre lâmina e lamínula suavemente pressionada, fixam-se as bordas da
lamínula com esmalte cosmético e leva-se ao microscópio específico em aumento de
1.000 vezes sob imersão. Da mesma forma que na microscopia convencional, após
uma visualização das células contidas na preparação são contadas no mínimo 200
células e estabelecido o percentual entre as normais e as com defeitos de forma
visualizados.

Os defeitos estruturais também se dividem em maiores e menores, sendo os

maiores (defeitos de acrossoma, gota citoplasmática proximal, "pouch formation",
pseudogota, "corskscrew", outros defeitos de peça intermediária e cauda fortemente

41
dobrada ou enrolada) e os menores (acrossoma desprendido, gota citoplasmática
distal, cauda dobrada incluindo gota presa, cauda enrolada e cabeça isolada normal).

Como são duas contagens para se obter o percentual de anormalidades do

sêmen soma-se o total de defeitos maiores com o total de defeitos menores
especificados, tanto de forma (lâmina corada) quanto de estrutura (contraste de fase).

Mas, é bom ressaltar que a totalização do resultado pode ultrapassar os 100%,

porquanto há defeito que pode aparecer concomitante a outro e ser duplamente
quantificado, porém a margem de ocorrência não é significativa.

Quanto ao segundo procedimento que pode ser adotado, como se restringe

apenas à identificação/ contagem em contraste de fase, todos os defeitos acima
descritos, tanto de forma quanto estruturais, são especificados apenas como defeitos
maiores ou menores. Isso simplifica o processo e possibilita maior segurança tendo em
vista o menor risco da ocorrência de defeitos de técnica, a melhor visualização
oferecida pelo tipo de microscopia e a impossibilidade de quantificação dupla de uma
célula acometida por mais de um defeito.

Outros elementos podem ser ocasionalmente, encontrados no sêmen

destacam-se a presença de medusas, células primordiais, células gigantes, leucócitos,
hemácias e células epiteliais. Cada um desses elementos contém indicativo próprio
que, associados às demais observações anteriores, podem conduzir a um ou mais
seguro diagnóstico e prognóstico sobre a aptidão reprodutiva (atual e futura) do
animal.

- Patologia espermática - classificação dos defeitos

As anormalidades morfológicas são classificadas, segundo Blom (1973), com

base na importância dos defeitos e seus efeitos na fertilidade, em: defeitos maiores e
defeitos menores.

42
Defeitos maiores

Os defeitos maiores são consequências de anomalias ao nível do testículo e

epidídimo, e podem comprometer seriamente a fertilidade. Os defeitos classificados
em maiores são: subdesenvolvido, formas duplas, “knobbed sperm”, decapitados,
“diadema” (“pouch formation”), piriforme, estreito na base, contorno anormal, cabeça
pequena anormal, cabeça isolada anormal, “corkscrew”, defeitos da peça
intermediária, gotas proximais, pseudo-gotas, cauda fortemente dobrada e enrolada,
“dag defect”.

Os defeitos de cabeça, "pouch formation", "diadema", "knobbed sperm", de peça

intermediária e caudas fortemente enroladas, têm origem no epitélio seminífero
(degeneração) e indicam uma espermatogênese imperfeita. No entanto, os defeitos de
cabeça diminuem à medida em que passam do duto deferente ao ejaculado, porque
alguns são fagocitados ao longo da via excretora. Os defeitos de cauda, ao contrário,
aumentam e podem ser encontrados nos dutos deferentes.

As anomalias de acrossoma também podem ser observadas em esperma de

touros normais e nos jovens no período da puberdade. No entanto, os defeitos de
acrossoma, da peça intermediária e da cauda são considerados como de origem
genética.

Uma alta incidência de gota citoplasmática proximal pode indicar imaturidade

em touros jovens até 36 meses de idade no Nelore (Fonseca et al. 1975), e hipoplasia
testicular.

O estresse de calor é um dos fatores que causam aumento nas anomalias

espermáticas com menor intensidade nos zebuínos (Colas 1980). Dependendo da
duração do efeito no testículo, 6 a 14 horas, após 3 a 4 semanas já inicia o
aparecimento de anomalias de cabeça, peça intermediária, cauda e gotas proximais.

43
Defeitos menores

São denominadas menores, as anomalias espermáticas menos importantes,

talvez não ligadas diretamente a processos patológicos dos testículos (Rao 1971). Os
defeitos menores, segundo Blom (1973) são: cabeça delgada, pequena, larga, gigante
e curta, cabeças isoladas normais, destacamento de acrossoma, abaxial, gota distal,
cauda dobrada e enrolada.

Parte destes defeitos (gotas distais, cabeças decapitadas e cauda dobrada) são
adquiridos durante a passagem pelo duto deferente ou durante a ejaculação e
apresentados por touros com fertilidade normal.

Geralmente, o espermatozóide perde a gota citoplasmática distal durante o

processo de ejaculação. Muitas vezes 0s choques térmicos no ato da coleta, além da
manipulação, podem dar origem a caudas dobradas e caudas enroladas.

Os defeitos menores não devem ultrapassar um total de 20% do total porque

reduzem a fertilidade (Rollinson 1951). No entanto, em certas condições de realização
do exame, determinados defeitos como cauda dobrada ou enrolada não devem
constituir critério de condenação de um touro, devendo ser realizados outros exames.

Total de defeitos

O total de anormalidades de células espermáticas num ejaculado é formado

pelos resultados de defeitos maiores e menores contados separadamente.

Rollinson (1951) observou que touros subférteis apresentavam de 21% a 41%

de anomalias espermáticas e os estéreis, acima de 41%. Segundo Gamcik (1966),
31,6% de alterações espermáticas provocam distúrbios de fertilidade. Nos touros
normais, a média não ultrapassou 13, 5%.

O total de anormalidades, de acordo com o Ministério da Agricultura, não deve

ultrapassar 30% numa contagem de, no mínimo, 200 células (Deschamps & Pimentel
1979).

44
45
 Decaptado Macrocefali Microcefalia
a

Piriforme Redondo c/ Cabeça

Piriforme cauda dupla
com gota redonda
Fonte:
http://www.wisc.edu/ansci_repro/lab/procedures/sperm/bovine_abnormals.html

46
A) Cauda enrolada com gota, B) Cauda enrolada dupla, C) Defeito “Dag”, D) Edema de
peça intermediária, E) Cauda Filamentosa, F) Cauda dupla, G) Peça interm. em saca-
rolha com gota citop. Proximal, H) Peça interm. em saca-rolha

7.6) Exames complementares

a) Porcentagem de espermatozóides vivos:

Avalia-se através da contagem de espermatozoides em esfregaço corado pela

eosina. Determina-se a porcentagem de células não coradas, que são os
espermatozóides que estavam vivos por ocasião da adição do corante. Avalia-se
colocando uma gota de sêmen e duas do corante eosina em lâmina aquecida. Após a
mistura do corante ao sêmen espera-se 30 segundos e confecciona-se um esfregaço
fino, que deve ser seco rapidamente.

47
b) Testes funcionais
1) Teste de penetração em ovos de hamster livres da zona pelúcida
2) Fertilização in vitro

Nestes exames avalia-se a fertilidade do sêmen pela capacidade de penetração

oocitária e fertilização in vitro.

c) Teste hiposmótico

Espermatozóides colocados em meio < 90 mOsm , aumento de volume da

cabeça e deformação da cauda, alta correlação com motilidade, penetração em
ovócitos

d) Avaliação da Integridade da membrana plasmática

Uso de corantes marcadores específicos e corantes fluorescentes:

lectinas + fluorocromo
anticorpos + fluorocromo
carboxifluoresceína (permeável) + iodeto de propídio (não permeável)

7.7) Teste de Libido

O teste de libido proposto para zebuínos por Pineda et al., 1997, relaciona o
comportamento sexual do touro com o tempo de observação e quando associado à
medida da circunferência escrotal pode ser utilizado como ferramenta para determinar
a capacidade de monta do touro e assim, a relação touro/ vaca recomendada. Isso
favorece o redimensionamento do rebanho, permitindo aos mais aptos a oportunidade
de gerar maior número de descendentes e a um custo menor, devido à otimização da
utilização dos touros.

48
a) Avaliação do comportamento sexual do
TABELA 4: Avaliação decomportamento
touros zebuínos (Pineda et al. 1997)
sexual de touros zebuínos

Nota Conduta Sexual Pontuação

0 O touro não mostrou interesse sexual pela vaca. Apático Questionável

1 Identificou a vaca em cio (cheirou a vulva) Questionável
2 Cheirou a vulva da vaca e perseguiu-a insistentemente Questionável
3 Intenção de monta sem salto, com mugido, deslocamento ou Questionável
masturbação
4 Tentativa de monta sem o pênis exposto Bom
5 Uma tentativa de monta com o pênis exposto Bom
6 Duas ou mais tentativas de monta com o pênis exposto Bom
7 Uma ou mais montas incompletas sem pênis exposto Muito Bom
8 Uma ou mais montas incompletas com pênis exposto Muito Bom
9 Uma monta completa Excelente
10 Duas montas completas, seguidas ou não por interesse sexual, Excelente
incluindo tentativas de monta, montas incompletas e novos
serviços

Determinação da relação touro/ vaca

TABELA 5: Determinação da Relação Touro / Vaca

Teste 2
Excelente Muito Bom Bom Questionável
Teste 1
Excelente 80 70 60 50

Muito Bom 60 55 50 40

Bom 50 45 40 30

Questionável 40 30 25 15

Teste 1 – teste de avaliação físico-morfológica do sêmen e circunferência

escrotal
Teste 2 – teste de avaliação do comportamento sexual

49
Padrões seminais desejáveis para efeito de seleção de touros para monta
natural:

Motilidade progessiva: > 70%

Vigor: >3
Mov. de massa: >3
Total esperm anormais < 30%

7.8) Diagnóstico e/ ou Conclusão

O resultado final do exame andrológico deverá ser feito de acordo com dados
obtidos dos exames e com as informações coletadas na anamnese do animal.
Podemos classificar os animais inicialmente em 3 categorias, a saber:

a) Animais aptos à reprodução: aqueles que apresentam-se em plena saúde

física e com excelente resultado nos exames realizados, sem alterações significativas
que possam comprometer sua capacidade reprodutiva.

b) Animais questionáveis: aqueles que apresentaram bons resultados nos

exames, porém com valores próximos ou ligeiramente abaixo dos limites aceitáveis, ou
ainda que apresentaram alguma patologia física, passível de tratamento, ou ainda
animais muito jovens. Para estes animais, recomenda-se o tratamento indicado e a
repetição do exame após 60 dias.

c) Animais inaptos: aqueles que apresentaram resultados insatisfatórios no

exame andrológico, alterações patológicas de recuperação lenta ou irreversíveis,
doenças de caráter hereditário ou em condições físicas incompatíveis para bons
resultados de reprodutivos.

A classificação dos animais avaliados também pode ser feita em uma escala de
pontuação, correlacionando-se os valores obtidos no exame andrológico com os
valores dos exames do teste de libido e circunferência escrotal, definindo-se a
proporção do número de fêmeas por macho na estação de monta.

50
 CERTIFICADO DE EXAME ANDROLÓGICO Data do exame: ___/___/___

Nome do reprodutor: Espécie: RGD: Raça:

Data de nascimento: Idade: Peso/ EC:

Proprietário:
Endereço:
Exame geral/ palpação:

Espermograma: Método de coleta: Atividade sexual:

Mov. de Mot. % Vigor

Idade CE (cm) Vol (ml) Cor Conc
massa (0-5) (0-100) (0-5)

Patologias:
Acrosoma Decaptação

GPP Cauda dob. ou enr

Defeitos
Subdesenvolvida menores Peça interm.
Cauda enr. na cabeça GPD
Cabeça isolada patologia

Estreita na base
Piriforme
Defeitos
maiores Pequena normal
TOTAL
Contorno anormal
Pouch formation Defeitos
Formas duplas menores

Def. membrana celular Defeitos

Edema peça intermediaria maiores

Cauda fort. Enrolada Defeitos

totais
Cauda dobrada c/ GPD

Conclusão______________

Data: ____/____/________ Ass. Veterinário responsável

51
Preparo de reprodutores para estação de monta

Os reprodutores a serem utilizados na estação de monta devem ser

previamente avaliados (exame andrológico) e passarem por um período de adaptação
antes do início da estação de monta propriamente dita.

Deve ser verificada a condição de escore corporal para que o animal entre na
estação não excessivamente obeso, que poderia prejudicar sua capacidade de monta
nas fêmeas, nem excessivamente magro, pois o animal perderá peso durante o
período que fica com as fêmeas, detectando cio e realizando as coberturas.

Todo animal proveniente de outra propriedade deveria também passar por um

período de quarentena antes de ser colocado com os animais da propriedade e ser
verificado se todos os exames sanitários e vacinações estão em dia. Caso contrário é
necessário que sejam feitos os procedimentos de manejo sanitário indicado, incluindo
o controle de endo e ecto parasitas.

Por fim, ao ser colocado com os demais animais, é interessante observar como
este animal se comporta em relação ao restante do rebanho, pois ele deverá ser
incorporado na nova estrutura social e sua capacidade de monta pode estar
relacionada à sua posição de dominância dentro do lote.

Caso surjam dívidas com relação à capacidade reprodutiva do animal, um novo

exame físico e andrológico poderá ser realizado ainda dentro da estação de monta,
para se evitar a redução de prenhezes por eventuais distúrbios de fertilidade do animal
que possam vir a ocorrer durante a estação.

52
Congelamento de Sêmen Bovino

1 - Introdução
O objetivo da congelação de sêmen é a produção de um banco de células
espermáticas utilizadas para biotécnicas da reprodução, o que é uma importante
ferramenta para potencializar uma genética

2 - Princípios de criopreservação do sêmen bovino

A moderna industria bovina em todo mundo é baseada na utilização da
inseminação artificial (IA) com sêmen congelado (AIRES et al., 2003). O sucesso na
concepção e nos benefícios econômicos desta técnica depende da viabilidade do
sêmen criopreservado para fertilização do ovócito (WATSON, 1999) .
Apesar da criopreservação de sêmen ser uma metodologia amplamente
utilizada, a mesma tem uma participação deletéria durante o processo de congelação e
armazenamento do material biológico, por não ser uma metodologia ideal e que
minimize os efeitos prejudiciais ao sêmen (PAPA et al., 2002).

2.1) Objetivos da Criopreservação de sêmen

A criopreservação de sêmen busca a suspensão do metabolismo espermático e

a manutenção do potencial fertilizante por um período de tempo prolongado

2.2) Etapas da Criopreservação:

1) Diluição
2) Resfriamento
3) Congelamento
4) Armazenamento
5) Descongelamento

53
3 - Cálculo para congelamento de Sêmen

Dose inseminante: 200 milhões em 200 microlitros (200.000.000 em 200 microlitros)

Conc. Final desejada = 1.000.000.000 sptz/ ml = 1x 109 sptz/ ml

- Determinar a concentração de sptz viáveis.

Fórmula para determinar a concentração inicial

Nº sptz/ mm3 = Nº sptz x fator de diluição. x fator de correção da câmara (4000)
N º quadrados contados em cada retículo (80 = 5 quad. Grandes)

4) Exemplo de cálculo do volume do diluidor para congelamento

4.1) Determinação da concentração espermática inicial

Por exemplo, em uma diluição de 1:200, que foram contados 90 sptz:

Nº de sptz/ mm3 = 90 x 200 x 4000 = 900.000 sptz/ mm3

80
Para encontrar a concentração em sptz/ ml, basta multiplicar o resultado por 1.000 =

Nº de sptz/ ml = 900.000 sptz x 1000= 900.000.000 sptz/ ml

Resultado: concentração espermática final = 9 x108 sptz/ ml

54
4.2) Determinação do volume de diluidor a ser usado

Para se determinar o número de doses a serem congeladas, é necessários saber

previamente:

Volume da palheta
Dose inseminante desejada
Volume do ejaculado
Concentração do ejaculado
% viáveis no ejaculado (motilidade)

- Determinação do volume de diluidor a ser usado

Exemplo:
Volume palheta = 0,5 ml
Dose inseminante = 20 milhões (sptz viáveis no congelamento)
Volume ejaculado 4 ml
Concentração = 850 milhões sptz/ ml
Motilidade = 90%

90% x 850 = 765 milhões sptz viáveis/ ml

765 milhões sptz x 4ml = 3060 = 3,06 bilhões de sptz viáveis totais

3,06 bilhões / 20 milhões = 153 doses inseminantes

153 x 0,5 ml = 76,5 ml de sêmen + diluidor

Resultado final = 4 ml de sêmen + 72,5 ml de diluido

55
5) Diluente e meios empregados para criopreservação

5.1) Funções do Diluente:

A) Aumentar o volume final
B) Nutrição
C) Proteção contra formação de gelo
D) Equilíbrio osmótico
E) Efeito tampão
F) Antibiótico

5.2) Composicão básica do meio diluente

De acordo com Vishwanath & Shannon (2000) para um meio diluente ser
completo e eficiente algumas substâncias são necessárias na sua composição:
- substâncias iônicas e não iônicas que mantém a osmolaridade;
- lipoproteínas ou material de alto peso molecular que previne o choque frio,
como a gema de ovo ou leite;
- glicerol, propanediol, ou dimetilsulfoxide (DMSO) como agentes crioprotetores
intracelular;
- glicose ou frutose como fonte de energia;
- outros aditivos como enzimas e antibióticos.

As células espermáticas necessitam para sua sobrevivência ao processo de

congelação de um ou mais agentes crioprotetores, que são classificados como
agentes crioprotetores não penetrantes (extracelulares) e agentes crioprotetores
penetrantes (intracelulares) (MAZUR, 1980).

56
Meio de congelamento de sêmen bovino: Botu-bov (Fração 1 e 2).Crioprotetores
não-penetrantes

O mecanismo de ação dos agentes crioprotetores não penetrantes baseia-se na

proteção dos espermatozóides contra os efeitos osmóticos durante o processo de
congelação, promovendo um meio hipertônico que induz a saída de água das células
levando a desidratação, ou seja, eles agem no meio extracelular, reduzindo assim a
possibilidade da formação de cristais de gelo intracelular. Estes são representados
pelos açúcares, lipoproteínas da gema do ovo e proteínas do leite. (AMANN &
PICKETT, 1987).

5.3) Crioprotetores penetrantes

Os crioprotetores penetrantes são substâncias que tem a capacidade de

proteção intracelular das células espermáticas. O mecanismo de ação destes
crioprotetores baseia-se em estruturas que promovem ligações de hidrogênio com as
moléculas da água. Estas ligações mudam a orientação da molécula da água nos
cristais de gelo, criando um ambiente menos nocivo para as células. Os crioprotetores
penetrantes utilizados em meios diluentes para congelação de sêmen em animais
domésticos são: os álcoois, etanol, etilenoglicol, glicerol, metanol e polietilenoglicol (DE
LEEUW et al., 1993).

57
5.4) Exemplo de fórmula de diluidor

Tris convencional Fração A Fração B

Tris 3,028g 3,028g
Ácido cítrico 1,675g 1,675g
Glicose 0,18g 0,18g
Água destilada qsp. 80ml 66ml
Gema 20ml 20ml
Penicilina 0,031g 0,031g
Estreptomicina 0,05g 0,05g
Glicerol --------- 14ml
OEP --------- 1ml
Volume da solução 100ml 100 ml

5.5) Procedimento de congelamento em duas frações

1. Calcular o volume de diluente (fração 1 e 2)

2. Adicionar a fração 1 ao sêmen à temperatura ambiente. Testar a amostra
3. Colocar para resfriar lentamente até 4ºC no prazo de 1,5 a 2 horas. Testar a
amostra.
4. Colocar separadamente a fração 2 para resfriar até 4º C.
5. Ao completar o período inicial, adicionar a fração 2 lentamente à temperatura de
4ºC. Testar a amostra.
6. Manter por 4 horas à 4º C para estabilização. Testar a amostra.
7. Envasar e colocar em vapor de nitrogênio (a 10 cm do nível de N2) por no
mínimo 15 minutos (testar a amostra)
8. Mergulhar em nitrogênio
9. Raquear identificar. Armazenar no botijão (testar a amostra)

58
5.6) Procedimento de congelamento em uma fração

1. Calcular o volume de diluidor

2. Adicionar o diluidor ao sêmen à temperatura ambiente. Testar a amostra
3. Envasar o sêmen nas palhetas previamente identificadas
4. Colocar na máquina de congelamento e seguir as recomendações do manual de
instruções da máquina
5. Mergulhar em nitrogênio
6. Raquear identificar. Armazenar no botijão (testar a amostra)

Máquina de congelamento Congelamento “artesanal em caixa de isopor

6) Exemplo de curva de resfriamento:

59
7) Consequências do congelamento:

- Danos físicos ou funcionais

- Diminuição da fertilidade se comparado ao sêmen fresco
- Motilidade é mais bem preservada que a integridade acrossomal
- Lesões de membranas (plasmática e acrossomal)
- Membrana passa do estado líquido a gel (ác. graxos se ordenam
paralelamente, formando estrutura rígida)
- 40-50% dos espermatozóides têm danos mitocondriais (condensação e perda
de material)

7.1) Avaliação das características físicas seminais

Padrões de Julgamento de Sêmen Doadores
(portaria SDR-26; 05/ 09/ 1996)

7.2) Sêmen congelado:

Será considerado fora do padrão quando apresentar as seguintes
características após a descongelação (de 35 a 37º C/ mín 30 seg.ou conforme
recomendação do estabelecimento produtor):

Volume da dose < 0,25 ml

Motilidade progressiva < 30%
Vigor < 3

Para doses com 10 x 106 de espermatozóides com motilidade progressiva:

Defeitos totais: > 30%
Defeitos maiores: >20%

Para doses com 6 x 106 a < 10 x 106 de espermatozóides com motilidade

progressiva:
Defeitos totais: > 20%
Defeitos maiores: > 10% (CBRA, 1998).

60
8) Recomendações para o congelamento de sêmen

1) Usar meios novos ou previamente testados

2) Não recongelar meios comerciais
3) Utilizar material preferencialmente estéril
4) Congelar apenas sêmen de boa qualidade
5) Avaliar amostras em cada etapa do congelamento
6) Evitar mudanças bruscas de temperatura
7) Identificar corretamente as palhetas congeladas
8) Descongelar corretamente

Bom trabalho e boa Sorte!

Equipe CPT Cursos Presenciais

61
9 - Bibliografia

Aires, V.A.; Hinsch, K.D.; Schoesser, F.M. et al. In vitro and in vivo comparison of egg yolk-based and
soybean lecithun-based extenders for cryopreservation of bovine semen. Therio., v.60, p.269-279,
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Banks, W. J. Histologia Veterinária Aplicada. 2ª. ed, Manole., 1992. 629 p.

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De Leeuw, F.E.V., De Leeuw, A.M., Den Daas, J.H.G.,Eij, A.J. et al. Effects of various cryoprotective
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Dellman, H.-D. and Brown, E.M. Histologia Veterinária, ed. Guanabara Koogan, 1982. 397 p.

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Hafez, E.S.E. Reprodução Animal. 4ª ed. São Paulo: Manole, 1982.720p.

Ishwanath, R.; Shannon, P. Storage of bovine semen in liquid and frozen state. Anim. Repord. Sci.,
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Papa, F.O., Zahn, F.S., Della´quaJr., et al. Utilização do diluente MP50 para criopreservação de sêmen
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Sisson, S.; Grossman, J.D. and Getty, R. Anatomia dos Animais Domésticos, ed. Guanabar Koogan,
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Watson , P.F. Cooling of spermatozoa and fertility capacity. Reprod. Dom. Anim., v.31, p. 135-140,1999.

62
10 - ANEXOS

Soluções

1)Solução de Citrato 2,9 %

Citrato de sódio............................................2,9 g
Água deionizada q.s.p..................................100 ml

2) Solução de Formol-citrato
Sol. de citrato de sódio a 2,9 %........................96 ml
Formol comercial...............................................4 ml

MÉTODOS DE COLORAÇÃO

MORFOLOGIA ESPERMÁTICA

Coloração com fuccina/ fenol

Método que pode ser utilizado no campo, imediatamente após a coleta do sêmen.
Constitui-se de:

a) 2 ml de citrato de sódio a 2,9%;

b) preparo de fuccina: 4 g de fuccina básica + 278 ml de H2O + 22 ml de fenol;
c) 0,01 ml de sêmen.

Preparo do esfregaço nol de campo:

1) 8 a 10 gotas de corante em 2 ml de citrato de sódio a 2,9%;
2) 3 gotas do sêmen;
3) esperar por 20 minutos;
4) fazer o esfregaço;
5) olhar no microscópio

63
Coloração com vermelho congo

Preparo do corante:
1) solução saturada de vermelho congo;
2) solução aquosa de violeta de genciana 0,5%.

Preparo da lâmina:
1) fazer esfregaço;
2) secar ao ar;
3) corar de "0 a 1" minuto, em solução saturada de vermelho congo;
4) lavar em água corrente, delicadamente, para tirar o excesso do corante (lado
contrário do esfregaço);
5) secar;
6) contra corar de 5 a 30 segundos, em solução aquosa de violeta de genciana;
7) secar naturalmente;
8) examinar sob imersão no microscópio.

Coloração com eosina-nigrosina

Preparo do corante:
1) eosina 1%, em solução isotônica;
2) nigrosina 5%, em solução isotônica;
3) citrato de sódio 3%, em água destilada misturar, agitar.

Preparo da lâmina:
1) aquecer o corante à temperatura do sêmen;
2) uma (01) gota do sêmen e uma (01) gota do corante;
3) fazer o esfregaço;
4) secar;
5) leitura no microscópio.
Pode ser utilizada somente eosina sem a nigrosina, porém com um filtro azul no
microscópio ou com o sistema de contraste de fase.

64
Corante de Williams modificado (Lagerlof 1934)

Preparo do corante:
1) solução estoque: 10 g fuccina + 100 ml álcool a 96° GL;
2) solução corante: 10 ml solução estoque + 100 ml fenol 5%;
3) solução álcool e eosina azulada ou eosina blaulich (25 ml de álcool e colocar eosina
até o ponto de viragem-saturação):

0,5% = 0,5 g de eosina para 25 ml de álcool;

1,0% = 1,0 g de eosina para 25 ml de álcool;
1,5% = 1,5 g de eosina para 25 ml de álcool.

4) solução corante final: 100 ml da solução "2" + 50 ml da solução "3".

Guardar a solução corante final por 14 dias antes de usar.

Preparo da lâmina:
1) fazer esfregaço;
2) fixar lâmina, leve flambagem;
3) álcool absoluto, 4 min.;
4) cloramina T 0,5%, 1 ou 2 min.;
5) lavar em H20 destilada;
6) lavar em álcool 96° GL;
7) corante de Williams, 1 a 2 min. (média 1,5 min.);
8) lavar em água corrente (jato fraco);
9) secar no ar;
10) leitura no microscópio sob imersão.

COLORAÇÃO PARA VIVOS E MORTOS

(Contar 200 a 500 células entre vivas e mortas). A células mortas são coradas.

65
po

Eosin fast green

Preparo do corante: fast green 2 g + eosin B (blue) 8 g + fosfato buffer 100 ml

(buffer: 22 mg Na2HPO4 em 500 ml H20 destilada + 8,5 mg KH2P04 em 500 ml H20

destilada).
Ajuntar, aquecer, filtrar. Validade da solução: de 4 a 5 anos.
(sugestão).

Preparo da lâmina:

Uma (01) gota de sêmen + uma (01) gota de corante.

Eosina e nigrosina

Para o preparo do corante seguir as indicações do item 1.3 e para o preparo da lâmina
o item anterior.

66
Empresas Parceiras:

A PECGEN Embriões é uma empresa de prestação de serviços veterinários em

reprodução de bovinos, ovinos e caprinos, empregando modernas tecnologias, como a
Inseminação Artificial (IA), Ultra-sonografia (US), Transferência de Embriões (TE) e
Fertilização in vitro (FIV), além de prestar orientações técnicas e realizar palestras e
cursos na área de produção animal.

Sediada em Campos-RJ, coloca-se à disposição dos clientes em todo território

nacional, com respectivas despesas de deslocamento e diárias a combinar.

Endereço:

Rua Barão de Miranda 70, Parque São Caetano,

Campos dos Goytacazes - RJ. CEP: 28030-265

Para maiores informações, entre em contato :

Luis F. Matos - Sócio-gerente

(22) 8821-2058 / (31) 8771-2022

pecgenembrioes@yahoo.com.br

www.pecgenembrioes.com

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 "Reproduzindo o presente e inovando o futuro."

A Tecnopec, fundada em 1995, nasceu da necessidade do mercado veterinário

brasileiro de ter produtos inovadores, de alta qualidade técnica com indicações de uso
testadas e comprovadas cientificamente.
Com sede na cidade de São Paulo, a Tecnopec, empresa 100% nacional,
firmou importantes parcerias, estudando cada possibilidade de inovação para o
tratamento e melhora do desempenho reprodutivo de animais de diversas
espécies, realizando pesquisas científicas com Universidades e Instituições de
Pesquisa e Ensino do Brasil e do Exterior.
A Tecnopec é uma empresa que sempre trabalha focada nas necessidades de
seus clientes. No campo ou na cidade, com criadores ou revendas, veterinários ou
estudantes, produtores de corte e de leite. Procura estar sempre em contato direto
com todos seus parceiros, das mais diversas formas. Pensando assim mais uma vez
saímos na frente e criamos o Site do Produtor, uma ferramenta moderna e prática para
quem busca informações numa linguagem de fácil entendimento, adicionalmente ao já
conhecido Site do Veterinário que desde o início, tem sido fonte de consulta para
vários profissionais e estudantes de reprodução animal.
A linha de produtos foi desenvolvida com a mais alta tecnologia para trazer
melhor saúde, melhor qualidade e melhor produtividade ao seus animais.
Com equipe altamente especializada e treinada, a Tecnopec oferece a você,
atendimento profissional e especializado, desde a indicação de uso dos produtos, até a
máxima eficiência de atendimento, entrega e acompanhamento pós-venda.

Tecnopec
Rua Emílio de Sousa Docca, 480
Vila Sta. Catarina - 04379-020
São Paulo - SP
Tel: 11 5671-7070

www.tecnopec.com.br

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 Fundada em 1991, a NUTRICELL é uma empresa de tecnologia veterinária que
fornece produtos de excelente qualidade para transferência de embriões e cultura de
células, tendo como principais clientes laboratórios de pesquisas, laboratórios de
genética, indústria farmacêutica e indústria veterinária. Disponibiliza também para o
setor agropecuário aparelhos de ultra-sonografia, congeladores de células, lupas e
microscópios, além de contribuir ativamente com a realização de cursos de
especialização, simpósios e congressos. Na área de reprodução animal somos líderes
no Brasil na distribuição de meios para transferência de embriões e FIV.

A NUTRICELL oferece as melhores soluções em meios de cultura que garantem

a conservação das condições fisiológicas normais dos embriões mantidos fora do útero
animal, graças à excepcional qualidade de seus produtos.

Os meios disponibilizados pela NUTRICELL suprem a maioria das

necessidades nutricionais do embrião, proporcionando resultados constantes e
superiores aos meios tradicionais, o que representa um avanço considerável neste
segmento.

Nutricell Nutrientes Celulares

Rua Dimas de Toledo Piza, 521
Jd. Nossa Sra. Auxiliadora
Campinas - SP
CEP 13075-570
Tel: 19 3243-8622

www.nutricell.com.br

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 A TK Equipamentos para Reprodução, tem em sua raiz o compromisso com a
inovação, a excelência e a responsabilidade. Valores que revelam sua filosofia de
trabalho baseada no respeito e no compromisso com a sociedade em que ela atua.

Localizada em Uberaba MG, a TK foi a pioneira no Brasil no desenvolvimento e

produção de máquinas portáteis para reprodução animal. Pioneirismo que hoje lhe
rende mais de 10 anos de experiência, uma equipe sólida e diferenciada, e clientes em
diversos países, com destaque para os do Mercosul.

A TK destaca-se no mercado nacional por seu pioneirismo e por oferecer uma

completa linha de produtos de eficiência e qualidade indiscutíveis, todos desenvolvidos
em parceria com os maiores centros de pesquisa e desenvolvimento do Brasil: USP,
UFMG, UNESP e EMBRAPA/CERNAGEN; etc.

O resultado deste trabalho você vê no pasto, com um alto índice de fertilidade no

rebanho, com aumento na produtividade e com um retorno garantido para o seu
investimento. Invista em equipamentos para reprodução TK. O melhor caminho para
resultados positivos!

R. Aparecida H. Bastos, 181

Bairro Boa vista
Cep 38072-460
Uberaba MG
Fone/Fax (34) 3322-4348
tk@tkreproducao.com.br

www.tkreprodução.com.br

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