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com

|INVESTIGAÇÃO

Múltiplas aplicações de um sistema transitório

CRISPR-Cas9 acoplado com eletroporação (TRACE) no
Cryptococcus neoformansComplexo de Espécies
Yumeng Fan e Xiaorong Lin1
Departamento de Microbiologia, Universidade da Geórgia, Atenas, Geórgia 30602
IDs ORCID: 0000-0003-4975-3751 (YF); 0000-0002-3390-8387 (XG)

ABSTRATOCryptococcus neoformansé um patógeno fúngico que ceifa centenas de milhares de vidas anualmente. Manipulação genética
direcionada através da transformação biolística emC. neoformansimpulsionou a investigação deste patógeno clinicamente importante no nível
molecular. Embora cara e ineficiente, a transformação biolística continua sendo o principal método para editar oCryptococcus genoma, pois
DNAs estranhos introduzidos por outros métodos, como eletroporação, não são predominantemente integrados ao genoma. Embora a maioria
dos DNAs introduzidos por transformação biolística seja herdada de forma estável, a eficiência da transformação e a taxa de integração
homóloga (-1-10%) são baixas. Aqui, desenvolvemos umTra conscienteC RISPR (repetição palindrômica curta agrupada regularmente
interespaçada)-Cas9 acoplado comE sistema de eletroporação (TRACE) para manipulações genéticas direcionadas noC. neoformans complexo
de espécies. Este método aproveitou a integração eficiente do genoma devido a quebras de fita dupla criadas em locais específicos pelo
sistema transiente CRISPR-Cas9 e a alta eficiência de transformação da eletroporação. Demonstramos que o TRACE pode gerar eficientemente
mutantes precisos de deleção de um único gene usando oADE2locus como exemplo. Este sistema também pode deletar vários genes em uma
única transformação, como é evidente pela geração bem-sucedida de genes quádruplos.mfuma1D2D3D4Dmutantes. Além de gerar mutantes
de deleção gênica, complementamos aade2Dmutante integrando um tipo selvagemADE2alelo na região de “porto seguro” (SH2)via
recombinação homóloga usando TRACE. Curiosamente, os DNAs introduzidos podem ser inseridos em um sítio genético designado sem
nenhuma sequência homóloga, abrindo inúmeras outras aplicações. Esperamos que o TRACE, uma abordagem de edição de genes eficiente,
versátil e econômica, acelere muito a pesquisa neste campo.

PALAVRAS-CHAVECryptococcus neoformans;eletroporação; transformação biolística; CRISPR-Cas9; ruptura do gene; complementação gênica; integração ectópica;
quebra de fita dupla; família de genes

C RYPTOCOCCUS neoformansé um patógeno ambiental

onipresente que ceifa centenas de milhares de vidas
anualmente (Parket ai.2009; Perfeitoet ai.2010; Marromet ai.
2012; Rotheet ai.2013; Armstrong-Jameset ai.2014; Chaiwarith
et ai.2014; Gaskellet ai.2014; Idnurm e Lin 2015; Perfeito e
Bicânico 2015). oC. neoformansO complexo de espécies
contém o sorotipo A, o sorotipo D e o híbrido AD, sendo o
sorotipo A responsável pela grande maioria da criptococose
Copyright © 2018 pela Genetics Society of America doi:
https://doi.org/10.1534/genetics.117.300656
Manuscrito recebido em 20 de dezembro de 2017; aceito para publicação em 7 de fevereiro de 2018;
publicado no início on-line em 14 de fevereiro de 2018.
O material complementar está disponível online emwww.genetics.org/lookup/suppl/doi:10.
1534/genética.118.300656/-/DC1.
1Autor correspondente: Departamento de Microbiologia, Universidade da Geórgia, 206
Edifício de Ciências Biológicas, 120 Cedar St., Atenas, GA 30602. E-mail:
xiaorong.lin@uga.edu
casos (Casadevall e Perfect 1998; Lin e Heitman 2006). As últimas duas
décadas viram um grande progresso em nossa compreensão da
biologia e patologia criptocócica, em grande parte devido à
capacidade de modificar geneticamente esse patógeno eucariótico
por meio de mutagênese direcionada desde o início da década de
1990 (Edman e Kwon-Chung 1990; Toffalettiet ai.1993).
A eletroporação foi relatada pela primeira vez em 1990 para gerar
mutantes de deleção de genes em cepas de sorotipo D usando
marcadores de seleção auxotróficos (Edman e Kwon-Chung 1990). Al-
embora a eletroporação possa render centenas a milhares de
transformantes por transformação, a grande maioria dos
transformantes são instáveis devido à não integração do DNA
introduzido (frequentemente, 0,1% dos transformantes são estáveis)
(Edman 1992; Varmaet ai.1992; Linet ai.2015). A adoção de
marcadores de divisão (Fuet ai.2006; Kimet ai.2009), o uso de
marcadores de seleção de drogas dominantes (McDade e Cox 2001;

Genética, v. 208, 1357–1372 abril de 2018 1357

Raposaet ai.2003), e o emprego de uma cepa receptora deficiente
em junção não homóloga (NHEJ) (Walker et ai.2001; Goinset ai.
2006) aumentou os eventos de integração do genoma entre os
transformantes gerados por eletroporação (-10%) (Linet ai.2015).
No entanto, a eletroporação continua sendo uma abordagem
ineficiente para fazer mutações genéticas direcionadas devido à
predominância da não integração do DNA introduzido e à
predileção da inserção de DNA ectópico mesmo quando a
integração do genoma ocorre.
A introdução da transformação biolística em 1993 foi um divisor
de águas para este campo (Toffalettiet ai.1993) porque a maioria dos
transformantes são estáveis, com DNA introduzido integrado ao
genoma (Lodgeet ai.1994; Kimet ai. 2009). A transformação biolística
logo se tornou o método para edição de genoma emCryptococcus.No
entanto, este método de escolha está longe de ser satisfatório. O
número de transformantes obtidos por transformação biolística varia,
com tipicamente 10-100 transformantes em cepas de sorotipo A
como H99 e 0-20 transformantes em cepas de sorotipo D como JEC21
ou XL280 em nosso ambiente. Com baixas taxas de recombinação
homóloga (HR) (1-10%) noC. neoformanscomplexo de espécies,
transformações repetidas são muitas vezes necessárias para
identificar os mutantes desejados. Além disso, a transformação
biolística depende do caro sistema de entrega de partículas biolísticas
PDS-1000/He que só está disponível na Bio-Rad (Hercules, CA; -$
25.000 em 2017) e o procedimento requer consumíveis caros, como
contas de ouro. Assim, uma abordagem econômica com maior
eficiência de transformação e maior frequência de RH é desejada.
A baixa taxa de integração homóloga é um fator limitante na
manipulação genética direcionada emCryptococcus.NHEJ é
preferido sobre HR durante a fase de não divisão (Sonoda et ai.
2006; Arraset ai.2016). Comprometendo NHEJ (por exemplo, por
eliminação doCKU80gene) pode enriquecer os eventos HR entre
os transformantes. No entanto, contando com aCKU80mutante
de deleção como a cepa receptora é restritiva e problemática,
dado o papel potencial de Cku80 na infecção e adaptação ao
estresse (Liuet ai.2008). Outra abordagem para aumentar a taxa
de FC é criar quebras de fita dupla de DNA (DSBs) (Haber 2000).
Curiosamente, o sistema de repetição palindrômica curta
(CRISPR) agrupada regularmente interespaçada e gene 9
associado a CRISPR (CRISPR-Cas9) de bactérias e archaea
também pode criar DSBs como um mecanismo de defesa
(Barrangouet ai.2007; Bhayaet ai.2011; Correuet ai.2013). Dois
elementos essenciais no sistema CRISPR-Cas9 são o RNA de guia
único (sgRNA) e a endonuclease Cas9. O sgRNA carrega uma
sequência de 20 nt que pode hibridizar com a região de DNA
complementar e leva Cas9 a gerar um DSB quando uma
sequência de motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) segue
imediatamente a sequência alvo. Esse recurso torna o CRISPR-
Cas9 uma poderosa ferramenta de edição de genoma que foi
aplicada em vários eucariotos (Hsu et ai.2014; Maliet ai.2013),
incluindo patógenos fúngicos (Nødviget ai.2015) comoCandida
albicans (Vyaset ai. 2015; Mín.et ai.2016) eAspergillus fumigatus (
Mais cheio et ai.2015; Zhanget ai.2016). Dois sistemas CRISPR-
Cas9 diferentes foram relatados emC. neoformans (Arraset ai.
2016; Wanget ai.2016) e ambos os sistemas podem gerar
1358 Y. Fan e X. Lin
mutantes de deleção de um único gene de forma eficiente. Aqui,
desenvolvemos uma abordagem mais simples chamada TRACE (Tra
conscienteC RISPR-Cas9 acoplado comE lectroporation) que acopla a
eletroporação altamente eficiente com um sistema CRISPR-Cas9 expresso
transientemente para múltiplas aplicações em manipulação genética
direcionada noC. neoformanscomplexo de espécies. Um sistema CRISPR-
Cas9 expresso de forma transiente semelhante é amplamente adotado no
Candida ficampo (Mín.et ai.2016). TRACE tornou-se um método de escolha
em nosso laboratório para modificar geneticamenteC. neoformans.
Esperamos que essa abordagem também facilite muito outros
pesquisadores criptocócicos em suas investigações.
Materiais e métodos
Cepas e condições de crescimento
As cepas usadas e geradas neste estudo estão listadas em Material
Suplementar, Tabela S1 emArquivo S1. As cepas foram armazenadas em2
80- como estoques de glicerol. As cepas recentemente revividas foram
mantidas em meio de ágar YPD (1% de extrato de levedura, 2% de
BactoPeptona e 2% de dextrose) a 30ºC, a menos que indicado de outra
forma. Cryptococcustransformantes foram selecionados em meio YPD
suplementado com NAT (nourseotricina, 100mg/ml) ou G418 (200mg/ml)
para seleção, conforme descrito anteriormente (Linet ai. 2015).
Extração de DNA genômico
O DNA genômico das cepas de referência do tipo selvagem H99,
XL280 e JEC21 foi extraído usando um protocolo CTAB conforme
descrito anteriormente (Pitkinet ai.1996). DNA genômico do
Cryptococcusos transformantes examinados neste estudo foram
extraídos usando um protocolo de minipreparação. Resumidamente,
as células foram coletadas de culturas durante a noite em placas YPD
e suspensas em 500m1 de tampão de lise (100 mM Tris pH 8,0, 50
mM EDTA e 1% SDS). Em seguida, 150-200ml esferas de vidro de
ruptura de 0,5 mm (RPI, catálogo #9831) foram adicionadas à
suspensão de células e as células foram então submetidas a vórtice
por 2 min seguido de centrifugação a 16.0003gpor 3 min. O
sobrenadante foi misturado com 275ml de acetato de amônio 7 M,
incubado a 65- por 5 min, e depois resfriado em gelo por 3-5 min. As
amostras foram então tratadas com clorofórmio (500ml) duas vezes e
o DNA na camada superior foi precipitado por isopropanol. As
amostras de DNA precipitadas foram lavadas com etanol 70%, secas
ao ar e dissolvidas em 100meu água estéril.
Construção do Cas9, o sgRNA e os cassetes de
deleção de genes
Para gerar um construto de expressão de Cas9 criptocócica, a
sequência de codificação de Cas9 foi amplificada a partir do
plasmídeo pDD162 (Addgene, MA) (Dickinsonet ai.2013) por PCR. UMA
FseO sítio da enzima de restrição I foi adicionado ao 59final da
sequência Cas9 e umPacO sítio da enzima de restrição I foi
adicionado ao 39final usando primers especificamente projetados
(todos os primers usados neste estudo estão listados na Tabela S2
emArquivo S1). O produto de PCR foi purificado usando o kit de
purificação Invitrogen Quick PCR (Carlsbad, CA) e digerido comFseeu
ePacI enzimas de restrição. O produto digerido foi ligado em
o plasmídeo pXL1 entre oGPD1promotor e oGPD1 terminador,
conforme descrito anteriormente (Xueet ai.2006; Wang et ai.
2014). O plasmídeo resultante pXL1-Cas9 foi usado como modelo
para amplificar todo o cassete de expressão criptocócica Cas9
para transformação (Figura 1).
Para gerar a construção de sgRNA com a sequência alvo
desejada, primeiro obtivemos as sequências do gene criptocócico
alvo de FungiDB.org (Stajichet ai.2012). As sequências genômicas
das cepas H99 e XL280 foram obtidas do National Center for
Biotechnology Information (PRJNA411 e PRJNA217913) (Niet ai.
2013; Janbon et ai.2014). A sequência guia de sgRNA foi projetada
usando o software sgRNAcas9_V3.0_GUI (Zhaoet ai.2015) com os
parâmetros padrão. A única exceção foi que as possíveis
sequências alvo de sgRNA único foram pesquisadas em ambas as
fitas (comprimento do sgRNA: 20 nt; GC%: 40-60%; distância de
deslocamento de gRNAs pareados:22-32; e número máximo de
incompatibilidades: 5). A sequência guia selecionada de 20 nt foi
adicionada aos primers.Cryptococcuspromotor U6 nativo (Wang
et ai. 2016) foi amplificado a partir de JEC21 enquanto o andaime
de sgRNA foi amplificado a partir do plasmídeo pDD162. O
promotor U6, a sequência guia de 20 nt, o andaime e o
terminador 6-T foram montados na ordem mostrada na Figura 1
usando uma PCR de junta única conforme descrito anteriormente
(Minet ai.2016).
Para gerar o construto de deleção do gene, primeiro amplificamos
o gene da nourseotricina acetiltransferaseNAT1Cassete de expressão
(NAT) e Cassete de expressão gênica de resistência à neomicina (NEO)
marcadores de seleção por PCR dos plasmídeos pPZP-NATcc e pPZP-
NEO1 usando primers M13F e M13R (Waltonet ai.2005). NAT e NEO
conferemCryptococcusresistência a clonNAT e G418,
respectivamente. Os braços homólogos (1 kb ou 500 bp) dos genes
direcionados foram amplificados a partir do genoma da linhagem de
fundo indicada (H99, JEC21 ou XL280). Os 59e 39braços homólogos e
o marcador de droga foram montados como mostrado na Figura 1
por um PCR de dupla articulação como descrito anteriormente (Kimet
ai.2009; Linet ai.2015). Para a construção de deleção de gene com
apenas braços homólogos de 50 pb, as sequências homólogas de 50
pb foram incluídas nos primers projetados como saliências. Os
primers resultantes foram usados para amplificar o marcador de
seleção de drogas.
Todos os três produtos de PCR (o cassete Cas9, o cassete
sgRNA e o construto de nocaute do gene) foram purificados
usando um kit de purificação Invitrogen Quick PCR e eluídos com
água. Os produtos purificados foram concentrados por vácuo
rápido quando necessário. Esses produtos foram então usados
em eletroporação conforme descrito abaixo.
Eletroporação em Cryptococcus
A eletroporação foi realizada como descrevemos anteriormente com
algumas pequenas modificações (Edman e Kwon-Chung 1990; Linet
ai.2015). Brevemente,Cryptococcuscélulas foram semeadas a partir
de estoques de glicerol armazenados em280- e cultivadas em placas
de ágar YPD a 30- antes de serem transferidas para 3 ml de meio
líquido YPD. As células foram cultivadas durante a noite a 30ºC com
agitação a 250 rpm. A cultura durante a noite foi então transferida
para meio YPD fresco (100 ml) com o inóculo inicial de
OD600= 0,2. As células foram cultivadas por 4 a 5 horas adicionais
até que a densidade celular atingisse OD600entre 0,6 e 1,0. As
células foram coletadas por centrifugação a 32003gpor 5 min a
4-. As células peletizadas foram lavadas duas vezes com água
gelada antes de serem suspensas em 10 ml de tampão de
eletroporação (EB) gelado (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl2e
sacarose 270 mM) com DTT 1 mM. Após 1 hora de incubação em
gelo, as células foram colhidas por centrifugação e foram
ressuspensas em tampão EB (250meu). Suspensão de células (45
ml) foi misturado suavemente com DNA (5ml) em uma cuvete de
eletroporação de 2 mm pré-resfriada. A eletroporação foi feita
usando um multiporador Eppendorf com o modo bacteriano (V =
2 kV comtotimizado para 5 ms). As células eletroporadas foram
então suspensas em 1 ml de meio YPD e cultivadas a 30- por 2
horas antes de serem plaqueadas no meio de ágar seletivo
apropriado (YPD + NAT ou YPD + G418). Os transformantes foram
contados após 2 dias de incubação a 30ºC. Para a tela deade2D
mutantes, os transformantes foram mantidos em 4- por mais 2
dias ou mais para acúmulo de pigmento para exame visual.
Teste de estabilidade de transformantes
O teste de estabilidade foi realizado como descrevemos
anteriormente (Linet ai.2015). Resumidamente, os transformantes
foram transferidos para meio de ágar seletivo fresco (YPD + NAT ou
YPD + G418). Após 2 dias de incubação a 30ºC, as placas foram
replicadas em placas YPD não seletivas. Após a incubação a 30-
durante 24 horas, as células foram replicadas novamente em placas
de YPD não seletivas frescas. Na quinta passagem, as células foram
replicadas em placas de YPD não seletivas, bem como em placas de
drogas seletivas apropriadas. As colônias que crescem nas placas de
drogas seletivas foram comparadas com as correspondentes nas
placas de YPD não seletivas. As colónias com crescimento irregular no
meio selectivo em comparação com o meio não selectivo foram
consideradas transformantes instáveis. Apenas as colônias que
apresentaram crescimento semelhante em meios seletivos e não
seletivos foram consideradas transformantes estáveis.
Ensaio de diagnóstico RFLP
Para a triagem do ensaio RFLP diagnóstico para oADE2deleção do
gene, primers conforme indicado na Figura 3A-i (H99_ADE2_FLF e
H99_ADE2_RR) foram usados para amplificar o fragmento de DNA
dos transformantes selecionados e as cepas de controle (tipo
selvagem e um conhecidoade2Dmutante YP27 (Lin et ai.2015)). Para
cepas no fundo XL280, o tipo selvagem deve produzir uma banda de
-4,4 kb de tamanho, enquanto o mutante de deleção de gene correto
deve fornecer uma banda de 3,6 kb de tamanho. Para cepas no fundo
da cepa H99, tanto o tipo selvagem quanto o corretoADE2mutantes
de deleção de gene devem produzir amplicons de PCR de -4,2 kb de
tamanho. Para distingui-los, os produtos da PCR foram purificados e
digeridos com a enzima de restriçãoNãoI. Porque umNãoSe o sítio de
corte estiver presente dentro do marcador NAT, os produtos de PCR
digeridos dos mutantes de deleção gênica corretos devem produzir
duas bandas de 2,3 e 1,8 kb de tamanho, respectivamente, enquanto
o tipo selvagem deve mostrar apenas uma banda de 4,2 kb.
Não há mais biolística emCryptococcus 1359
figura 1Construção do Transient CRISPR (repetição palindrômica curta agrupada regularmente interespaçada)-Cas9 acoplado ao sistema de Eletroporação (TRACE).
Um diagrama dos três elementos do sistema TRACE gerado via PCR (painel esquerdo). As setas representam a posição e a direção dos primers. Um diagrama para o
conceito de trabalho do sistema TRACE (painel direito). Quando os três elementos são todos expressos emCryptococcuscélulas, o RNA de guia único (sgRNA) guiará
Cas9 para o local específico que corresponde à sequência alvo e, em seguida, Cas9 gerará uma quebra de fita dupla (DSB). A construção de deleção servirá como
modelo durante o reparo de DSB e eventualmente substituirá o gene de interesse pelo marcador resistente a drogas por recombinação homóloga. NAT: cassete de
resistência à nourseotricina

Sequenciamento de DNA taxas de integração homóloga foram observadas em ambos os

estudos (Arraset ai.2016; Wanget ai.2016). Um estudo usou um
O sequenciamento de DNA foi usado para examinar a integração do
sistema CRISPR-Cas9 “suicida”, no qual cassetes de sgRNA e Cas9 (0,5
DNA introduzido no local de inserção específico. Para oADE2 deleção,
kb) foram adicionados a um dos braços homólogos do construto de
os candidatos gerados a partir do construto de deleção com apenas
deleção em um único vetor. Após a transformação do HR, os
braços homólogos de 50 pb (detalhados naResultadosseção e primers
elementos CRISPR-Cas9 serão eliminados sem se integrarem ao
mostrados na Figura 4C) foram usados para amplificar a região
genoma (Wanget ai. 2016). Este método requer a construção de um
inserida potencial. Para oADE2candidatos de complementação
plasmídeo complicado transportando todos os três elementos e a
gerados pela inserção do construto de complementação sem braços
construção de deleção de cada vez. O outro estudo usou uma cepa
homólogos (detalhados noResultados), os primers SH2_FLF e SH2_RR
com integração estávelCAS9como o receptor na transformação
foram usados para amplificar a região potencial inserida. Os
biolística (Arraset ai.2016). Assim, permanecem os inconvenientes da
produtos de PCR foram purificados e enviados para a Eurofins
transformação biolística e a necessidade de ter receptores com CAS9
Genomics para Sequenciamento Sanger. Primers para
em seu genoma é limitante. DentroC. albicans,um sistema CRISPR-
sequenciamento também estão listados na Tabela S2 emArquivo S1.
Cas9 expresso de forma transiente pode gerar deleção de genes de
Ensaio de acasalamento forma eficiente sem integração estável deCAS9 (Mín.et ai.2016). Aqui,
decidimos determinar se o sistema CRISPR-Cas9 expresso
As células foram cultivadas em meio YPD e depois suspensas em
transientemente permitirá a manipulação genética eficiente emC.
água estéril.600= 3,0. Volumes iguais de células dos pares de
neoformans.O sistema consiste em três componentes independentes
acasalamento (umaeumacepas como indicado na Figura 7E) foram
que podem ser gerados por PCR: o cassete de expressão Cas9, o
misturadas e 4m1 da mistura de acasalamento foi colocado em meio
cassete de expressão sgRNA e o DNA do doador.por exemplo, a
de ágar de suco V8 (pH = 5). As coculturas foram incubadas no escuro
construção de deleção de gene mostrada no painel esquerdo da
22- por 1 semana e as imagens da colônia foram obtidas com uma
Figura 1).
câmera GO-21 sob um estereoscópio Olympus SZX16.
Para o cassete de expressão Cas9, primeiro geramos o plasmídeo
Disponibilidade de dados pXL1-Cas9, no qual a expressão doCAS9gene foi impulsionado pela

Cepas e plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação. Os expressão constitutivamenteGPD1promotor de Cryptococcus.Um

autores afirmam que todos os dados necessários para a confirmação primer a montante doGPD1promotor e um primer no final doGPD1

das conclusões do artigo estão presentes no artigo, figuras, tabelas e terminador foram usados para amplificar toda a construção de 7 kb

arquivo suplementar. do plasmídeo pXL1-Cas9 por PCR.

Resultados
Construção do transitório CRISPR-Cas9 acoplado ao
sistema de eletroporação (TRACE)
Dois estudos anteriores adotaram diferentes sistemas
CRISPR-Cas9 na transformação deC. neoformans.Aumentou
Para o cassete de RNA guia único, escolhemos oCryptococcus
promotor U6 para conduzir sua expressão como foi usado
anteriormente (Wanget ai.2016). A sequência de andaime do cassete
de sgRNA foi amplificada a partir do plasmídeo pDD162 e seis timinas
consecutivas (6-T) foram incluídas como terminador. A sequência alvo
de 20 nt de sgRNA foi projetada para corresponder à sequência
específica noCryptococcusgenoma que precisava ser editado. Esta
sequência foi adicionada aos primers como

1360 Y. Fan e X. Lin


uma saliência. O promotor U6, a sequência alvo e a sequência de
andaime juntamente com o terminador 6-T foram montados por PCR
de junta única, conforme mostrado na Figura 1.
Para o DNA doador, usamos um construto de deleção de gene.
Um construto de complementação gênica ou construtos para outros
propósitos também podem ser usados (veja oMateriais e métodos
seção e oResultados seção “A complementação por inserção ectópica
na região específica do porto seguro não necessita de nenhum braço
homólogo”para detalhes). O construto de deleção do gene incluiu um
1-kb 59braço homólogo, um marcador de seleção de drogas e um 1-
kb 39braço homólogo (painel esquerdo da Figura 1). Esses três
elementos foram montados por PCR de junta dupla conforme
descrito anteriormente (Kimet ai.2009; Linet ai.2015).
Planejamos misturar esses três componentes e introduzi-los em
Cryptococcuscélulas juntas. Os transformantes serão selecionados
com base no marcador utilizado no DNA doador. Em teoria, se todos
os três fragmentos fossem introduzidos e expressos com sucesso em
células criptocócicas, a sequência alvo de 20 nt de sgRNA
reconheceria e hibridizaria com uma sequência específica no
Cryptococcusgenoma (por exemplo,o sítio noADE2gene como
representado no painel direito da Figura 1). Cas9 seria recrutado pelo
sgRNA e geraria um DSB 3-bp upstream da sequência PAM (Jineket ai.
2012; Correuet ai.2013). O DNA doador, neste caso o construto de
deleção do gene, seria usado como molde para reparar o DSB pelo
HR, consequentemente substituindo o gene pelo marcador de
resistência a drogas (Figura 1, painel direito).
Para entregar esses três elementos de DNA nas células,
decidimos usar eletroporação em vez de bombardeio biolístico
Figura 2TRACE [Transient CRISPR (clustered
regularmente interspaced short palindromic
repeat)-Cas9 acoplado com eletroporação] pode
aumentar drasticamente a taxa de interrupção
do gene. O sistema TRACE foi usado para gerar
ADE2 mutantes de deleção em ambos os
sorotipos A (H99 e cku80DH99) e sorotipo D
(JEC21 e XL280). A eletroporação sem Cas9/
sgRNA (RNA de guia único) foi feita em paralelo.
A construção de deleção foi mantida na mesma
concentração. Colônias vermelhas indicam
mutantes comADE2.
devido à alta eficiência de transformação e baixo custo da
abordagem anterior. Embora a predominância da não integração
do DNA introduzido tenha tornado a eletroporação um método
inferior para mutações genéticas emCryptococcus,hipotetizamos
que o DSB criado pelo Cas9 aumentará drasticamente os eventos
de integração do DNA. Assim, o acoplamento de eletroporação
com TRACE deve torná-lo um método melhor para mutagênese
direcionada emC. neoformans.
Geração dos mutantes de deleção de gene único ADE2
por TRACE
Para testar a eficácia do sistema TRACE naC. neoformans complexo
de espécies, decidimos usar este sistema para deletar a
fosforribosilaminoimidazol carboxilaseADE2gene em ambas as
estirpes do serotipo A e do serotipo D. oade2Dmutante é conhecido
por acumular pigmento vermelho e, portanto, pode ser rastreado
visualmente. Nós construímos oADE2construtos de deleção de genes
para ambas as manchas de sorotipo A e D, que incluíram um -1-kb 59
braço homólogo e um 1-kb 39braço homólogo. Selecionamos um
sítio de direcionamento de sgRNA 648 pb a jusante do sítio de início
de tradução (ATG) deADE2na estirpe de referência H99 do serotipo A.
O site DSB estaria -600 bp longe do 59final e 1,2 kb longe de 39fim do
ADE2sequências que estão sendo excluídas. Para as cepas de
referência do sorotipo D JEC21 e XL280, selecionamos o local de
direcionamento de sgRNA 509 pb a jusante do ATG, conforme usado
no estudo anterior (Wanget ai. 2016). Para isso, 1mg do cassete Cas9
(7 kb), 700 ng do cassete sgRNA (-400 bp) e 2mg da deleção do gene
Não há mais biolística emCryptococcus 1361
Tabela 1 Exclusão deADE2com uma construção de exclusão de braço de 1 kb

Variedade Construção de exclusão Cas9 sgRNA Colônias vermelhas Total de colônias ADE2frequência de interrupção (%)

H99 + + + 4392 4728 92,90

H99 + + + 2648 2864 92,40
H99 + 2 2 20 1120 1,78
H99 + 2 2 16 656 2,44
cku80DH99 + + + 2080 2528 82,30
cku80DH99 + + + 2504 3184 78,60
cku80DH99 + 2 2 26 1456 1,78
cku80DH99 + 2 2 23 1888 1,22
JEC21 + + + 256 456 56
JEC21 + + + 512 760 67,30
JEC21 + 2 2 8 240 3,33
JEC21 + 2 2 12 264 4,55
XL280 + + + 472 720 65,60
XL280 + + + 480 640 75
sgRNA, RNA de guia único.

construto (-4 kb) foram misturados comCryptococcuscélulas das cepas
receptoras indicadas (H99,cku80DH99, JEC21 e XL280) durante a
eletroporação. A transformação com apenas a construção de deleção do
gene foi incluída para comparação. Todas as células eletroporadas foram
plaqueadas e os transformantes foram selecionados em placas YPD
suplementadas com o antibiótico clonNAT.
Centenas a milhares de transformantes de eletroporação foram
obtidos para todas as origens de cepas (600-4700 para H99,
1400-3100 paracku80DH99, 200-700 para JEC21 e -700 para XL280)
(Figura 2 e Tabela 1). Menos de 5% dos transformantes eram colônias
vermelhas quando apenas a construção de deleção do gene foi
usada. Isso foi verdade para ambos os sorotipos A e D (-2% para H99
e -4% para JEC21) (Tabela 1). Surpreendentemente, quando
combinado com o sistema CRISPR-Cas9, a proporção de colônias
vermelhas geradas por eletroporação aumentou drasticamente
(Figura 2 e Tabela 1). Mais de 90% dos transformantes para H99,-80%
paracku80DH99,. 50% para JEC21, e . 65% para XL280 eram colônias
vermelhas, indicando uma alta frequência deADE2ruptura entre os
transformantes. Vinte colônias vermelhas dos transformantes no
fundo H99 foram escolhidas aleatoriamente e testadas quanto à
estabilidade por cinco passagens consecutivas em meio não seletivo.
Dezenove deles permaneceram resistentes a NAT após cinco
passagens, indicando integração estável da construção de deleção no
genoma das colônias vermelhas.
Para nossa surpresa, a eliminação deCKU80,que prejudica o NHEJ,
não mostrou muito efeito na proporção de colônias vermelhas em
comparação com o H99 selvagem com ou sem o sistema CRISPR-
Cas9. Quando apenas o construto de deleção do gene foi usado, 1,5%
dos transformantes emcku80DH99vs.2,11% dos transformantes em
H99 eram colônias vermelhas. Esta observação é consistente com a
ideia de que os eventos de não integração são dominantes durante a
eletroporação, o que provavelmente mascara a diferença entre os
dois eventos de integração menores (NHEJ e HR). Inesperadamente,
quando o sistema CRISPR-Cas9 foi usado em conjunto com o
construto de deleção do gene, -80% dos transformantes emcku80D
H99vs. 92% dos transformantes em H99 eram colônias vermelhas. A
falta de diferença dramática entre o tipo selvagem e o mutante NHEJ
pode ser devido à eficiência extremamente alta do direcionamento
específico do local e integração pelo próprio sistema CRISPR-Cas9.
Embora o acúmulo do pigmento vermelho nos
transformantes indique a interrupção da função de Ade2, essa
interrupção pode ser causada por indels (inserção/deleções) após
reparo de DNA não homólogo, inserção do construto noADE2
gene, ou substituição homóloga usando a construção de nocaute
do gene como doador. Para distinguir essas possibilidades,
examinamos oADE2locus em 10-12 colônias vermelhas
selecionadas aleatoriamente de transformantes em H99 usando
RFLP de diagnóstico. Nove de 10 candidatos no fundo H99
mostraram o padrão RFLP indicativo de deleção correta do gene
via substituição homóloga nestes mutantes (Figura 3, A e D). Da
mesma forma, examinamos 12 transformantes no fundo XL280
por PCR de diagnóstico, pois o mutante correto deve produzir
uma banda de -4,4 kb. Cinco de 12 mostraram o tamanho de
banda esperado indicativo de integração correta (Figura 3C). Os
resultados indicam que este sistema TRACE pode efetivamente
gerar mutantes de deleção de um único gene através de HR.
Dos três fragmentos de DNA usados na transformação no
sistema TRACE, apenas a construção de nocaute do gene carregava
um marcador seletivo (painel esquerdo na Figura 1). Com base na alta
porcentagem de colônias vermelhas geradas pelo sistema TRACE em
comparação com o método convencional, onde apenas o construto
de nocaute do gene foi usado na transformação, a maioria dos
transformantes obtidos do sistema TRACE provavelmente recebeu
todos os três fragmentos de DNA durante a eletroporação. Como
nem o construto Cas9 nem o construto sgRNA continham qualquer
marcador de seleção, postulamos que nem todos os transformantes
manteriam esses construtos se esses elementos não fossem
integrados ao genoma. Para testar essa hipótese, examinamos a
presença deCAS9em colônias vermelhas selecionadas aleatoriamente.
Nenhuma das 10 colônias vermelhas examinadas do fundo H99
produziu a banda (-4,4 kb) indicativa da presença doCAS9ORF [Figura
3, A(ii) e C]. Sete das 12 colônias vermelhas examinadas do fundo
XL280 não mostraram amplificação doCAS9ORF (Figura S1B em
Arquivo S1). Assim, a maioria ou todas as colônias vermelhas testadas
não retiveram CAS9em seu genoma. PCR diagnóstico também foi
usado para testar a existência de sgRNA (Figura S1A emArquivo S1).
Todos os 10 candidatos examinados no histórico H99 mostraram um

1362 Y. Fan e X. Lin

Figura 3Exclusão deADE2 (braços de 1 kb) usando TRACE [Transient CRISPR (clustered regularmente interspaced short palindromic repeat)-Cas9 acoplado com
eletroporação] mostrou transienteCAS9expressão e alta eficiência de integração homóloga em ambos os fundos de cepas de sorotipo A e D. (A) Um diagrama para o
RFLP diagnóstico para substituição homóloga correta doADE2gene (i). As setas indicam as posições dos primers para PCR. Para candidatos no fundo H99, o produto
de PCR foi digerido pela enzima de restriçãoNãoI. Um diagrama de Cas9 com setas apontando para as posições dos primers usados para amplificar a sequência de
codificação de Cas9 (ii). (B) análise RFLP de selecionados aleatoriamenteade2Dcandidatos no plano de fundo H99. Candidatos que apresentaram bandas corretas (2,3
e 1,8 kb) apósNãoA digestão estava marcada com estrelas. O tipo selvagem (WT) (H99) mostrou uma única banda de 4,2 kb porque não possui umNãoEu corte site.
DNA genômico de umade2Dcepa de nosso estudo anterior (YP27) foi usada como controle positivo (PC). M, marcador. (C) Nenhuma sequência de codificação Cas9
(4,4 kb) pode ser detectada em qualquer uma dasade2Dcandidatos (H99) ou a estirpe WT. O plasmídeo pDD162 foi usado como um PC. (D) Na análise de PCR deade2
Dcandidatos no plano de fundo XL280, os candidatos que apresentaram a banda correta (4,4 kb) foram marcados com estrelas. WT mostrou uma única banda de 3,6
kb. NAT: cassete de resistência à nourseotricina

banda fraca (Figura S1C emArquivo S1), sugerindo que o sgRNA pode
ser integrado. Esta questão será abordada posteriormente.
Braços homólogos encurtados ainda podem gerar
HR correta
Em espécies fúngicas onde a substituição homóloga é infrequente, comoC.
neoformanseA. fumigatus,sequências flanqueadoras homólogas
relativamente longas são necessárias para mutagênese direcionada
quando CRISPR-Cas9 não é usado na transformação. Assim, braços
homólogos de 1 kb são frequentemente usados emCryptococcuse nossos
resultados mostrados acima indicam que braços deste comprimento são
suficientes em nosso sistema TRACE para gerar mutantes de deleção de
genes. Como braços homólogos mais curtos facilitarão a geração do
construto de deleção de genes por PCR de articulação dupla, decidimos
testar a eficiência do uso de braços mais curtos em nosso sistema TRACE.
Primeiro, reduzimos o comprimento dos braços homólogos doADE2
construção de deleção para 500 pb. Usamos o mesmo sistema para
transformar H99 como indicado na Figura 1 e Figura 2. Um quinto das
células eletroporadas foram plaqueadas e renderam 294 colônias. Destes,
222 apresentaram coloração vermelha sugerindo que oADE2a eficiência de
interrupção é de -75%. Examinamos novamente 12 colônias vermelhas
escolhidas aleatoriamente para a substituição correta do gene por RFLP
(Figura 4A). Onze dos 12 candidatos apresentaram substituição correta do
ADE2gene com oNAT marcador de drogas. Nenhum deles foi positivo para
a presença de
CAS9com base em PCR diagnóstico (Figura S2A emArquivo S1). Este
resultado demonstrou que um braço homólogo de 500 pb ainda pode
gerar eficientemente mutantes de deleção de genes corretos através de
HR usando nosso sistema TRACE.
Braços homólogos extremamente curtos (50 pb) não são
suficientes para substituição de genes homólogos
DentroSaccharomyces cerevisiae,integração genômica e HR do DNA
introduzido são altamente eficientes. Esta característica torna esta
levedura modelo um bom sistema para manipular geneticamente,
pois braços homólogos podem ser incluídos diretamente nos primers
projetados (Rothstein 1983), consequentemente eliminando a
necessidade de PCR de dupla articulação para gerar construções de
deleção de genes. DentroA. fumigatus,braços de microhomologia tão
curtos quanto 35-50 bp são suficientes para manipular o genoma
quando acoplados ao sistema CRISPR-Cas9 (Zhanget ai.2016; Al
Abdallah et ai.2017). Para ver se poderíamos encurtar ainda mais os
braços homólogos para deleção de genes emCryptococcus,decidimos
testar a eficiência doADE2construção de deleção de gene com braços
homólogos de 50 pb. Assim, sequências de 50 pb para os braços
homólogos foram incluídas diretamente nos primers e osADE2A
construção de deleção do gene foi feita por uma única rodada de PCR
regular. Em seguida, transformamos H99 usando o sistema TRACE
conforme descrito anteriormente. Nós plaqueamos um quinto das
células eletroporadas e obtivemos 230 transformantes. Destes,

Não há mais biolística emCryptococcus 1363

Figura 4Braços homólogos de 500 bp, mas não de 50 bp, são suficientes para uma substituição homóloga eficiente. (A) Oade2Dos candidatos (H99) gerados com a construção de
deleção carregando braços homólogos de 500 pb foram selecionados para substituição homóloga por análise de RFLP. Candidatos com bandas corretas de 2,3 e 1,8 kb apósNãoA
digestão estava marcada com estrelas. O tipo selvagem (WT) (H99) mostrou uma única banda de 4,2 kb. DNA genômico de um previamente confirmadoade2Dmutante foi usado
como controle positivo (PC). M, marcador. (B) Um diagrama para a inserção em vez de substituição doADE2locus com a construção carregando braços de 50 pb. As posições dos
primers usados para a tela de PCR em (C) são indicadas com setas. (C) Triagem de PCR de transformantes gerados com a construção de deleção com braços de 50 pb. Candidatos
com inserção devem render uma banda de 2,1 kb enquanto WT deve render uma banda de
- 200 pb. O controle negativo (NC) não tinha molde de DNA. NAT: cassete de resistência à nourseotricina

146 eram vermelhos, indicando uma taxa de interrupção de 60% de
ADE2.Para determinar quantos dos eventos de interrupção foram
causados pela substituição doADE2gene com o construto de deleção
do gene, selecionamos aleatoriamente oito colônias vermelhas e
realizamos PCR de diagnóstico conforme ilustrado na Figura 3A(i).
Nenhum dos candidatos examinados apresentou a banda de 4,2 kb
indicativa daADE2substituição de genes que observamos
anteriormente usando as construções knockout com braços
homólogos mais longos (Figura 3B). A maioria deles apresentou uma
banda maior (-6 kb) (Figura S2B emArquivo S1), o que sugeriu que o
construto knockout foi possivelmente inserido no sítio DSB dentro do
ADE2gene em vez de substituir oADE2gene. Para testar se o ADE2
gene foi realmente interrompido por inserção em vez de substituição
nessas colônias vermelhas, projetamos um conjunto de primers
dentro doADE2gene para triagem (Figura 4B). A cepa do tipo
selvagem deve dar uma banda de -200 bp. Se oADE2 gene foi
substituído pelo marcador da droga, nenhum produto deve ser
amplificado. Se o construto knockout foi inserido nos sítios DSB
dentro doADE2gene, um produto de 2,1 kb deve ser amplificado. A
cepa selvagem H99 e umaade2D foram incluídos como controles.
Todos os quatro candidatos testados produziram um produto de 2,1
kb, consistente com inserção em vez de substituição (Figura 4C). O
resultado sugere que braços de 50 pb não são suficientes para HR na
geração de deleção gênica em Cryptococcus.Embora essa abordagem
não crie uma substituição limpa do gene alvo, ela ainda pode ser
usada para interromper a função de um gene por inserção.
A inserção precisa de um fragmento de DNA introduzido no
sítio DSB pode ser útil em outras aplicações, como a marcação de
proteínas em seus loci nativos. Para examinar se alterações
adicionais, como indels, ocorreram quando esteNATconstrução
foi inserida noADE2DSB, sequenciamos os quatro candidatos.
Como o construto pode ser inserido em duas direções diferentes,
ções, a sequência de cada candidato foi alinhada com duas
sequências esperadas. Dois primers de amplificação de cada
extremidade foram usados para cada candidato para obter uma
sequência completa. Três deles levaram a inserção em uma
direção (Figura S4A-i emArquivo S1) enquanto o outro foi inserido
na direção oposta (Figura S4A-ii emArquivo S1). Entre esses
quatro candidatos, o isolado 7 apresentou inserção precisa sem
quaisquer indels (Figura 4A). O isolado 2 também apresentou
inserção precisa nas junções. Os resultados sugerem que o
reparo NHEJ pode contribuir para o reparo DSB e pode gerar
inserção precisa.
A eficiência da transformação e a taxa de ruptura do
gene dependem da dose de Cas9 e sgRNA
Para determinar se a eficiência do sistema TRACE depende da
concentração de Cas9 e sgRNA utilizada, repetimos o
experimento para deletar oADE2gene em células H99 com doses
mais baixas de elementos CRISPR-Cas9. Testamos três
combinações diferentes de Cas9/sgRNA (1mg/700 ng, 0,5mg/350
ng e 0,2mg/150 ng). oADE2construto de deleção de gene com o
braço de 1 kb foi mantido na mesma concentração (2mg) e a
concentração celular para transformação também foi mantida.
Nós novamente plaqueamos um quinto das células
transformadas e descobrimos que 90,5% das 351 colônias com a
dose alta, 69,9% das 318 colônias com a dose média e 40,4% das
104 colônias com a dose baixa eram vermelhas ( Figura 5 e
Tabela 2). Este resultado indica que a taxa de ruptura do gene se
correlaciona positivamente com a dose de Cas9/sgRNA quando o
construto de deleção permanece o mesmo. Este resultado
também mostra que a redução da dose de Cas9/sgRNA para tão
baixo quanto 0,2mg/ 150 ng é suficiente para a geração deade2D
mutantes. Notamos que o número de transformantes em meio
seletivo caiu quando a dose de elementos CRISPR-Cas9 foi

1364 Y. Fan e X. Lin


reduzido. Isso sugere que a eficiência de transformação
também é afetada pela concentração de Cas9/sgRNA.
Quando reduzimos ainda mais a dose de Cas9/sgRNA para
170/100 ng, a proporção de colônias vermelhas entre os
transformantes foi ainda mais reduzida (Figura 6A). No entanto,
em comparação com a transformação sem Cas9/sgRNA, a
proporção de mutantes vermelhos ainda foi muito maior. Isso foi
verdade tanto para a cepa H99 do sorotipo A (15,85%vs.2,70%) e
a cepa de sorotipo D XL280 (45,35%vs.0,39%) (Tabela 3) (Figura
6A). Curiosamente, não vimos nenhuma diferença aparente na
porcentagem de colônias vermelhas entre os transformantes
entre o H99 de tipo selvagem e ocku80Dmutante. Isso
novamente é consistente com nossa observação anterior (Figura
2), e sugere que os DSBs criados por Cas9/sgRNA são críticos e
suficientes para promover a integração e substituição homóloga
quando o DNA doador apropriado está presente.
Dado que a maioria dos transformantes gerados a partir de
eletroporação convencional são instáveis devido à predominância de
eventos de não integração do DNA introduzido, decidimos examinar a
estabilidade dos transformantes gerados por TRACE com a dose baixa
de Cas9/sgRNA. Escolhemos aleatoriamente 25 colônias vermelhas e
25 colônias brancas dos transformantes no fundo H99. Após cinco
passagens consecutivas em meio YPD não seletivo, as células foram
replicadas em meio YPD e também no meio seletivo suplementado
com NAT. Vinte e quatro das 25 colônias vermelhas eram estáveis,
enquanto apenas 4 das 25 colônias brancas eram estáveis (Figura
6B). Isso indica que colônias vermelhas de potencialade2 mutantes
são estáveis. Escolhemos ainda 50 colônias brancas geradas pelo
sistema TRACE e 50 colônias brancas geradas por eletroporação
normal e testamos sua estabilidade conforme descrito anteriormente.
Novamente, números igualmente baixos (22 e 24%, respectivamente)
de candidatos estáveis foram obtidos (Figura 6C), corroborando a
baixa frequência de integração quando o DNA foi introduzido por
eletroporação.
Tabela 2 A taxa de interrupção do gene é dependente da dose
Variedade Construção de exclusão (mg) Cas9 (mg) sgRNA (ng)
H99 2 1 700
H99 2 0,5 350
H99 2 0,2 150
sgRNA, RNA de guia único.
Figura 5A eficiência da transformação e a
taxa de interrupção do gene são
dependentes da dose dos elementos CRISPR
(repetição palindrômica curta regularmente
interespaçada agrupada) -Cas9. Diferentes
doses de Cas9 e RNA de guia único (sgRNA)
foram usadas para transformar o mesmo
lote de células H99 usando TRACE (Transient
CRISPR-Cas9 acoplado com eletroporação).
Testamos ainda os transformantes vermelhos gerados com a
baixa dose de Cas9/sgRNA para a substituição doADE2gene e pela
presença/ausência dos elementos CRISPR-Cas9. Sete dos 12
transformantes H99 selecionados aleatoriamente mostraram deleção
genética correta (Figura 6D). Como mencionado anteriormente, o
sgRNA pode se integrar ao genoma criptocócico em alguns dos
transformantes quando a alta dose de Cas9/sgRNA foi usada (Figura
S1 emArquivo S1). Para testar se tais eventos de integração
indesejados foram reduzidos entre os transformantes obtidos em
experimentos com uma dose reduzida de sgRNA, testamos a
presença de sgRNA por PCR desses 12 candidatos. Não conseguimos
detectar sgRNA em cinco dos transformantes e dois transformantes
mostraram bandas muito fracas (Figura 6E). NãoCAS9foi detectado
em qualquer um dos 12 transformantes (Figura 6F). Assim, a redução
da dose de Cas9/sgRNA permite a geração de mutantes de deleção
de genes corretos sem integração de ambosCAS9ou sgRNA.
Embora esteja além do escopo deste estudo atual, é importante
ressaltar que medidas adicionais devem ser tomadas para verificar se
os fenótipos observados nos transformantes selecionados são
causados pela mutação desejada. Para mutantes gerados por
TRACE, os mutantes devem ser rastreados quanto à ausência dos
elementos CRISPR-Cas9. Nos casos em que mutantes com a presença
deCAS9ou sgRNA devem ser usados, cruzar o mutante com um
parceiro do tipo selvagem deve ajudar a obter mutantes limpos se
esses elementos não estiverem ligados à mutação desejada. Mais
importante ainda, os cruzamentos genéticos emC. neoformans
permitem análises de ligação genética que podem verificar a
associação do fenótipo com o genótipo pretendido. Além disso, a
complementação gênica pode verificar o efeito causador da ruptura
gênica, como demonstraremos posteriormente neste estudo.
Múltiplas deleções de genes podem ser alcançadas em
uma transformação pelo sistema TRACE
Em organismos diplóides, a deleção de um gene geralmente requer
transformações consecutivas para substituir ambos os alelos. O CRISPR-Cas9
Colônias vermelhas Total de colônias ADE2frequência de interrupção (%)
318 351 90,6
221 316 69,9
42 104 40,4
Não há mais biolística emCryptococcus 1365
Figura 6A baixa concentração de elementos de repetição palindrômica curta (CRISPR)-Cas9 agrupados regularmente interespaçados é suficiente para a deleção
correta do gene e pode reduzir a chance de integração de RNA de guia único (sgRNA). (A) Transformação de cepas de sorotipo A e sorotipo D com TRACE (Transient
CRISPR-Cas9 acoplado com eletroporação) (100 ng sgRNA e 170 ng Cas9) ou sem TRACE para romper oADE2gene. (B) Após cinco passagens consecutivas em meio
YPD não seletivo, as colônias vermelhas e brancas geradas por TRACE foram replicadas em meio não seletivo e seletivo. Os transformantes não estáveis
apresentaram crescimento irregular em meio seletivo. (C) As colônias brancas geradas a partir de TRACE e eletroporação normal foram testadas quanto à
estabilidade após cinco passagens. As setas pretas indicaram candidatos estáveis. (D) Oade2Dcandidatos gerados por TRACE com a dose baixa de sgRNA e Cas9
foram selecionados para substituição homóloga por RFLP. Candidatos que produziram bandas corretas de 2,3 e 1,8 kb apósNãoA digestão estava marcada com
estrelas. O tipo selvagem (WT) (H99) mostrou uma única banda de 4,2 kb. DNA genômico de umade2Dcepa serviu como controle positivo (PC). M, marcador. (E e F) O
ade2Dcandidatos gerados por TRACE com a dose baixa de sgRNA e Cas9 foram selecionados para a presença de sgRNA (E) eCAS9 (F). O controle negativo (NC) não
tinha molde de DNA.

O sistema é uma ferramenta poderosa porque pode reconhecer ambos os alelos Transformação CRISPR-Cas9 tal método popular logo após ter sido introduzido
do mesmo gene e, consequentemente, um mutante de deleção homozigoto no fungo diplóideC. albicans. Cryptococcus, como a maioria das outras espécies
pode ser feito em uma transformação. Essa propriedade fez com que de fungos, existe principalmente em um estado haplóide.

1366 Y. Fan e X. Lin

Tabela 3 Eficiência de transformação deADE2construção de exclusão com braços de 1 kb

Variedade Construção de exclusão Cas9 sgRNA Colônias vermelhas Total de colônias ADE2frequência de interrupção (%)

H99 + + + 13 82 15,85
H99 + — — 3 111 2,70
cku80DH99 + + + 29 489 5,93
cku80DH99 + — — 2 548 0,36
XL280 + + + 161 355 45,35
XL280 + — — 1 258 0,39
sgRNA, RNA de guia único.

No entanto, existem genes duplicados noCryptococcusgenoma
(Fraseret ai.2005) e também existem famílias de genes conservadas.
Aqui, decidimos usar a família de genes de feromônios emC.
neoformanspara determinar se nosso sistema TRACE pode ser usado
para excluir vários genes em uma transformação.
O feromônio criptocócico é um sinal peptídico que inicia o
reconhecimento entre os parceiros de acasalamento compatíveis
e a subsequente fusão célula-célula. Feromônio é essencial para
criptocócicauma-umaacasalamento bissexual e a produção de
hifas de acasalamento (Shenet ai.2002; Lin e Heitman 2006; Linet
ai. 2010) (Figura 7D). Em células H99 (sorotipo A, tipo de
acasalamentoa) existem quatro genes de feromônios,MFuma1-4,
localizado no locus do tipo de acasalamento (Lengeleret ai.2002)
(Figura 7A).MFuma1 eMFuma2genes estão localizados próximos
uns dos outros, eMFuma3 eMFuma4são genes vizinhos (Figura
7A). As sequências ORF doMFuma2, 3,e4genes são idênticos e
diferem apenas ligeiramente dos genesMFuma1 (Figura 7C).
Primeiro decidimos testar a possibilidade de gerar double mfuma
1D2Dmutantes em uma transformação sem ruptura inespecífica do
similarMFuma3eMFuma4loco nas proximidades. Nós projetamos um
sgRNA que visava especificamente os 39sequência deMFuma1 (
sequência azul na Figura 7C), mas não os outros três genes de
feromônio, e gerou um construto de deleção com oNATmarcador de
resistência a drogas carregando os braços homólogos para oMFuma
1–2locus (Figura 7B). Ao contrário doade2mutantes, onde as colônias
vermelhas são em sua maioria estáveis e podem ser facilmente
identificadas visualmente, omfuma1D2Dmutantes não são
visualmente diferentes do tipo selvagem. Para examinar a eficiência
da integração do DNA com a abordagem TRACE, selecionamos
aleatoriamente 32 transformantes para teste de estabilidade e
descobrimos que 30 dos isolados testados eram estáveis. Esta
observação sugere que a grande maioria dos transformantes tinha a
construção knockout integrada no genoma. Oito isolados estáveis
foram então semeados para colônias únicas e examinados para
substituição correta doMFuma1–2genes por PCR diagnóstico. Todas
as oito colônias examinadas mostraram a banda esperada de -4 kb na
confirmação de PCR da correta integração e substituição deMFuma1–
2 (Figura S3A emArquivo S1). omfuma1D2Dmutantes acasalaram com
sucesso com um parceiro de tipo selvagem e geraram filamentos de
acasalamento em meio de agar de suco V8 indutor de acasalamento
(Figura 7E), indicando que os outros dois genes de feromônio
permaneceram funcionais nas cepas testadas. Este resultado sugere
que o sgRNA projetado para MFuma1foi altamente específico e não
teve como alvo os outros homólogosMFumagenes no locus genético
próximo em uma frequência notável.
Em seguida, decidimos testar a possibilidade de gerar quádruplos
mfuma1D2D3D4Dmutantes em uma transformação. Para isso,
projetamos um sgRNA que correspondia à sequência conservada de
MFuma1–4 (asteriscos vermelhos na Figura 7B sequência vermelha na
Figura 7C) e duas construções de deleção como mostrado na Figura
7B; uma construção de exclusão com oNATmarcador de resistência a
drogas carregando os braços homólogos para oMFuma1–2locus e a
outra construção de deleção com oNEOmarcador de resistência a
drogas carregando os braços homólogos para oMFuma3-4locus.
Quatro fragmentos de DNA, Cas9 (1mg), sgRNA (700 ng) e os dois
construtos de deleção (1,2mg cada) foram misturados com células
H99 durante a eletroporação. Após a transformação, as células foram
primeiro plaqueadas em meio de ágar com uma única droga seletiva
(YPD + NAT ou YPD + G418) e depois replicadas em ágar YPD com
ambas as drogas seletivas (YPD + NAT + G418). Cerca de 38% dos
transformantes selecionados nas placas NAT também eram
resistentes a G418. Por outro lado, -55% dos transformantes
selecionados nas placas G418 também eram resistentes a NAT. O
resultado indica que a incorporação de ambas as construções
ocorreu com uma frequência apreciavelmente alta entre os
transformantes.
Para esses mutantes resistentes a drogas duplas, testamos a
integração de duas construções de deleção por PCR de diagnóstico
(Figura S3, B e C). Os resultados da PCR indicam que 6 dos 12
candidatos examinados continham ambas as construções de deleção
corretamente integradas. Consistentemente, todos os seis mutantes
testados para o fenótipo falharam em acasalar com um tipo selvagem
umaparceiro e a cocultura não produziram hifas de acasalamento, em
contraste com a cepa parental H99 de tipo selvagem (Figura 7E). O
fenótipo domfuma1D2D3D4Dmutantes foi semelhante ao conhecido
tapete2Dmutante (Figura 7E), onde o fator de transcrição Mat2 da via
do feromônio foi interrompido (Linet ai. 2010; Wang e Lin 2011;
Feretzaki e Heitman 2013; Gyawaliet ai.2017). Após incubação
prolongada, alguns brotos de hifas rudimentares podem
ocasionalmente ser observados no mfuma1D2D3D4Dmutantes,
provavelmente devido à pobre filamentosa independente de
feromônio nesta condição, como também observamos notapete2D
mutante (Gyawaliet ai.2017) (Figura 7E). Coletivamente, nossos
resultados indicam que um único sgRNA pode direcionar vários genes
e que várias deleções de genes são alcançáveis em uma única
transformação em nosso sistema TRACE.
A complementação por inserção ectópica na região específica do
porto seguro não necessita de nenhum braço homólogo
A complementação em um mutante de deleção de gene é
fundamental para verificar a função do gene deduzido da

Não há mais biolística emCryptococcus 1367

Figura 7TRACE [Transient CRISPR (clustered regularmente interspaced short palindromic repeat)-Cas9 acoplado com eletroporação] pode gerar um quádruplomfuma1D2D3D4D
mutante em H99 com uma única transformação. (A) Um diagrama do locus tipo de acoplamento de H99. O locus do tipo de acasalamento contém quatro genes de feromônio,MF
uma1–4.Três genes de feromônios—MFuma2, MFuma3,eMFuma4—são idênticos na sequência de DNA. (B) Um diagrama das duas construções de deleção carregandoNATeNEO
marcadores de resistência a drogas (NAT: cassete de resistência à nourseotricina; NEO: cassete de resistência à neomicina). As construções foram projetadas para excluirMFuma1–
2ouMFuma3–4por recombinação homóloga. Os asteriscos indicam as sequências alvo de RNAs de guia única (sgRNAs). (C) Alinhamento de sequência dos quatro genes de
feromônios. As sequências de codificação estão sublinhadas. As sequências vermelha e azul são as sequências alvo dos sgRNAs. As sequências de PAM (motivo adjacente ao
protoespaçador) correspondentes estão destacadas em amarelo. (D) Um diagrama do processo celular de acasalamento bissexual emC. neoformans.O reconhecimento célula-
célula e a fusão celular são controlados pela via de feromônios ativada por Mat2. (E)umaisolados de tipo selvagem (WT) H99,tapete2D,mfuma1D2D3D4D (três transformantes
selecionados aleatoriamente), emfuma1D2Dforam cocultivados com o tipo de acasalamentoumaparceiro JEC20. O acasalamento bem-sucedido leva a filamentos que conferem
uma aparência branca e fofa na borda da colônia. O painel superior mostra as imagens de todas as colônias e o painel inferior mostra as imagens da borda de cada colônia.

mutante de deleção do gene correspondente. Embora a abordagem
ideal para complementação seja a integração do alelo do tipo
selvagem de volta ao seu locus original, muitas vezes o alelo do tipo
selvagem é introduzido ectopicamente no genoma do mutante de
deleção do gene. A integração ectópica pode ser problemática, pois o
efeito de posição de todas as cepas complementadas varia e a
inserção pode potencialmente interromper outros genes
importantes, causando efeitos indesejados. Para resolver esse
problema, dois grupos identificaram duas regiões intergênicas no
Cryptococcus genoma em que a inserção de DNA extra não influencia
a expressão dos genes vizinhos (Arraset ai.2015; Upadhyaet ai.
2017). O uso da região de refúgio seguro também significa que
as sequências de franqueamento permanecem as mesmas para a
complementação de diferentes genes. No entanto, devido às
baixas taxas de substituição de homólogos emCryptococcus,
apenas uma pequena fração dos transformantes obtidos por
transformação biolística terá a integração correta do construto
de complementação.
Dada a alta taxa de integração observada acima em nosso sistema
TRACE, decidimos testar se nosso sistema pode ser usado

1368 Y. Fan e X. Lin


para a integração direcionada na região do porto seguro (SH2)
(Upadhyaet ai.2017). Devido à capacidade de inserção precisa no
local DSB dentro doADE2locus que observamos anteriormente
quando braços homólogos muito curtos (50 pb) foram usados
em nosso sistema TRACE (Figura 4, B e C), decidimos testar nosso
sistema para complementação gênica noSH2 região usando duas
construções de complementação diferentes; uma construção de
complementação carrega braços homólogos de 1 kb de
comprimento combinando com oSH2região, enquanto o outro
construto de complementação não carrega nenhum braço
homólogo. Optamos por utilizar oADE2gene para complementar
ade2Dmutantes.
A primeira construção de complementação exigiu quatro
fragmentos de DNA: (i) o 5 kb de comprimento 59SH2braço
homólogo; (ii) o ADE2gene composto por seu promotor nativo, ORF e
terminador (3,3 kb); (iii) oNEOmarcador que confere resistência ao
fármaco G418 (2,2 kb); e (iv) o 3 de comprimento de 1 kb9SH2braço
homólogo (Figura 8B). Esses quatro fragmentos de DNA, juntamente
com um vetor pUC19, foram montados usando o NEBuilder HiFi DNA
Assembly Master Mix de acordo com as instruções do fabricante. O
segundo construto de complementação não carregava braços
homólogos aoSH2região e, portanto, exigiu apenas aADE2gene e o
NEOmarcador (Figura 8C). A eliminação dos braços homólogos
simplificou muito o processo de construção e a construção foi criada
por um PCR de junta única. O sgRNA foi projetado para atingir oSH2
região. Umade2DO mutante vermelho gerado anteriormente foi
usado como a cepa receptora. No total, 94,5% dos transformantes
ficaram brancos quando o construto de complementação
transportando braços homólogos foi usado (Figura 8A).
Surpreendentemente, 86,8% dos transformantes ficaram brancos
quando o construto de complementação sem braços homólogos foi
usado (Figura 8A). Os resultados sugerem que construtos com ou
sem a
Figura 8ADE2complementação no porto seguro H99 (
SH2)região por TRACE [Transient CRISPR (clustered
regularmente interspaced short palindromic repeat)-
Cas9 acoplado com Eletroporação]. (A)
Complementação de ade2Dpor TRACE com a
construção de complementação carregando os
braços homólogos (esquerda) ou a construção de
complementação sem (S/O) quaisquer braços
homólogos (direita). (B e C) Um diagrama da
construção de complementação com os braços
homólogos (B) ou sem braços (C) (NEO: cassete de
resistência à neomicina). As posições dos primers
usados para análise de PCR adicional em (D e E)
estão indicadas com setas. (D e E) Triagem por PCR
de colônias brancas selecionadas aleatoriamente a
partir de transformação com o construto de
complementação com os braços homólogos (D) ou
sem os braços homólogos (E) para os eventos de
integração noSH2 região. Integração correta noSH2
região deve render uma banda de 7,4 kb. O tipo
selvagem (WT) deve render uma banda de 2 kb.
braços homólogos podem complementar oade2Dmutante de forma
eficiente. Para determinar se as cepas fenotipicamente
complementadas de ambas as transformações têm o construto de
complementação integrado naSH2região, selecionamos
aleatoriamente 12 colônias brancas dos experimentos com os dois
construtos de complementação (um com braços homólogos e um
sem) e realizamos PCR diagnóstico usando o conjunto de primers
representados na Figura 8B. Usando este conjunto de primers, a cepa
do tipo selvagem deve produzir uma banda de 2,1 kb de tamanho,
enquanto os transformantes com o construto de complementação
inseridos corretamente noSH2região deve render uma banda de 7,5
kb de tamanho. Descobrimos que 11 dos 12 testados a partir da
transformação com o construto carregando os braços homólogos
mostraram integração correta noSH2região, enquanto 4 de 12
testados a partir da transformação com o construto sem braços
homólogos mostraram integração correta (Figura 8, D e E). O
sequenciamento dos amplicons de PCR indicou que a inserção precisa
pode ocorrer com o construto de complementação gênica sem
braços (Figura S4B emArquivo S1). A descoberta indica que os
construtos de complementação de genes podem ser integrados ao
SH2região com uma frequência suficientemente alta com ou sem
braços homólogos.
Discussão
No início da década de 1990, dois grandes métodos de transformação,
biolística e eletroporação, foram desenvolvidos para manipular
geneticamente o patógeno fúngico clinicamente importante.C.
neoformans (Edman e Kwon-Chung 1990; Toffalettiet ai.1993). Embora a
transformação biolística seja atualmente empregada como abordagem de
rotina para manipulação genética emC. neoformans,a baixa eficiência de
transformação, a variação de experimento para experimento e os altos
custos são desencorajadores.
Não há mais biolística emCryptococcus 1369
 Neste estudo, introduzimos um sistema de transformação
simples e econômico, TRACE, para manipulações genéticas noC.
neoformanscomplexo de espécies. Combinando a alta taxa de
transformação da eletroporação e o aumento da taxa de HR
devido ao CRISPR-Cas9, o TRACE pode gerar centenas a milhares
de transformantes com # 90% da taxa de interrupção do gene. É
importante notar que o sistema TRACE depende da entrega bem-
sucedida de todos os três fragmentos de DNA independentes
(cassete sgRNA, cassete Cas9 e DNA doador) no receptor, o que
requer um método de transformação altamente eficiente. A
eletroporação fornece um sistema de entrega ideal para
Cryptococcus.
Um problema associado ao sistema CRISPR-Cas9 são os potenciais
eventos fora do alvo (Fuet ai.2013; Hsuet ai.2013), o que pode levar a
mutações inesperadas no genoma. No entanto, esse risco pode ser
minimizado selecionando cuidadosamente as sequências alvo de sgRNA e
reduzindo as doses de Cas9 e sgRNA. Apenas um sgRNA com o menor
número possível de locais fora do alvo deve ser escolhido. Por exemplo, o
sgRNA projetado usado paraMFuma1foi altamente específico e não teve
como alvo os outros homólogosMFuma genes no locus genético próximo
entre os transformantes que examinamos. Além disso, em contraste com
o uso de uma cepa receptora que transporta elementos CRISPR-Cas9
integrados, um sistema transitório pode minimizar ainda mais o efeito fora
do alvo, pois o sgRNA e o Cas9 são eventualmente eliminados. O
retrocruzamento do mutante com uma cepa do tipo selvagem é
fortemente recomendado. Isso pode demonstrar a ligação genética entre
o fenótipo e a mutação desejada, bem como remover possíveis mutações
fora do alvo presentes nos transformantes originais. Uma abordagem de
sequenciamento de genoma foi recentemente usada para analisar
potenciais mutações secundárias no genoma causadas por bombardeio
biolístico emCryptococcus (Friedmanet ai.2018). Da mesma forma, uma
comparação completa dos efeitos fora do alvo de um transientevs.um
sistema CRISPR-Cas9 permanente pode ser alcançado por análises
comparativas do genoma de múltiplos transformantes.
Para encerrar, demonstramos que o TRACE pode ser usado para
criar eficientemente deleções de um único gene, deleções de vários
genes, complementação de genes e inserções direcionadas. O TRACE
também pode ser usado para knock-in preciso para marcação de
proteínas. O TRACE não é apenas econômico; também acelera a
engenharia genética deCryptococcus.É concebível que o TRACE
permita que laboratórios em regiões com recursos limitados para
pesquisa realizem uma manipulação genética eficiente desse
patógeno, pois requer apenas uma máquina de PCR e um
eletroporador, dois instrumentos comumente usados em
laboratórios de biologia molecular. Dado que eventos de não
integração e a dominância de NHEJ apresentam um gargalo para
manipulação genética em muitos outros patógenos fúngicos (Boyce e
Andrianopoulos 2015), esperamos que TRACE ou sistemas similares
possam ser aplicáveis nesses organismos.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório Lin por suas
sugestões úteis e Rene Garcia pela assistência técnica. Este
trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde
1370 Y. Fan e X. Lin
(http://www.niaid.nih.gov/Pages/default.aspx) (R01AI097599 a
XL). XL detém um Prêmio de Investigador na Patogênese de
Doenças Infecciosas do Burroughs Wellcome Fund (http://
www.bwfund.org/) (1012445 a XL). Os financiadores não tiveram
nenhum papel no desenho do estudo, coleta e interpretação de
dados ou na decisão de enviar o trabalho para publicação.
Contribuições dos autores: YF e XL conceberam e projetaram
os experimentos. YF realizou os experimentos. YF e XL
analisaram os dados. XL contribuiu com reagentes, materiais
e ferramentas de análise. YF escreveu o jornal. XL editou o
jornal.
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Editor de comunicação: A. Mitchell