Titulo

Sequenciamento e estudos filogenéticos dos genomas completos de Begomovirus isolados em

plantas da Família Fabaceae.

Palavras-chave: Begomovirus, Fabaceae, Filogenia

Title:

Abstract:

Keywords:

Resumo:

Introdução

O gênero Phaseolus pertence a família Fabaceae, é originário das Américas possuindo em torno de
150 espécies. Entre essas espécies, o feijão comum (Phaseolus vulgaris) e o feijão-fava
(Phaseolus lunatus) são as mais importantes economicamente e cultivadas no Brasil (MERCADO-
RUARO; DELGADO SALINAS, 2000). Sua importância econômica e social, está relacionada
principalmente a sua rusticidade em regiões semiáridas do Nordeste brasileiro, podendo prolongar
a colheita em tempo seco e por ser cultivada tradicionalmente por pequenos agricultores.
(AZEVEDO et al., 2003; CARMO et al., 2015). A baixa produção do feijão, pode estar relacionada
com um grande número de microrganismos fitopatogênicos como fungos, bactérias, vírus e
nematoides (MELGAREJO et al., 2007). Dentre as doenças que acometem a cultura, as viroses se
destacam ocasionando quedas na produtividade e redução do valor comercial do grão (FARIA et
al., 2014). Os vírus pertencentes a família Germiniviridae, são importantes patógenos das
leguminosas, entre elas, as espécies de Phaseolus são comumente afetadas. Esses vírus são
caracterizados por possuir partículas icosaédricas geminadas e componentes genômicos de DNA
fita simples (ssDNA, single strand DNA) monopartido ou bipartido (sendo que as espécies de
genoma bipartido possuem componentes de DNA-A e DNA-B) circulares, com aproximadamente
2.5 a 5.2kb nucleotídeos de comprimento (ZHANG et al., 2012). O Comitê Internacional de
Taxonomia de Vírus (ICTV) divide a família Germiniviridae em quatorze gêneros (Becurtovirus,
Begomovirus, Capulavirus, Citlodavirus, Curtovirus, Eragrovirus, Grablovirus, Maldovirus,
Mastrevirus, Mulcrilevirus, Opunvirus, Topilevirus, Topocuvirus, Turncurtovirus) usando como
critérios de demarcação a gama de hospedeiros, o inseto vetor, organização e identidade pareada
do genoma completo e relações filogenéticas (ZERBINI et al. 2017). Os sintomas observados nas
plantas são: nanismo, enrolamento foliar, ondulação, distorção, mosaico/mosqueado,
amarelecimento internerval e clorose (INOUE-NAGATA et al. 2016). O gênero Begomovirus
causam problemas fitossanitários em muitas culturas agrícolas em todo o mundo, sendo um dos
mais importantes grupos de vírus. Atualmente, possui 424 espécies aceitas, cujos isolados
infectam plantas dicotiledôneas e são transmitidas por mosca branca, Bemisia tabaci (ICTV,
2020). As culturas mais afetadas por esses vírus são o feijoeiro e o tomateiro, sendo sua
incidência um fator limitante para a produtividade dessas culturas (ZERBINI et al., 2005). Vários
estudos já foram realizados no país para investigar a infecção de plantas invasoras por
begomovirus, principalmente em plantas que estão associadas aos cultivos de feijão e tomate, e
foi possível observar que existe uma alta diversidade genética entre os isolados de begomovirus
que infectam essas plantas (AMBROZEVICIUS et al., 2002; CALEGARIO, 2004; CASTILLO-
URQUIZA, 2008). O conhecimento da diversidade genética e da gama de hospedeiros desses vírus
torna-se ferramentas importantes para o manejo do inseto vetor, além de fornecer informações
úteis para os programas de melhoramento genético de espécies cultivadas, que poderão ser
utilizadas para a conservação da diversidade genética e em estudos filogenéticos. O manejo eficaz
dessas fitoviroses é um grande desafio, tendo em vista grandes surtos e a infecção de plantas não
cultivadas que acabam se tornando uma fonte de inóculo em campo (MELGAREJO et al., 2007).
Com isso, o objetivo geral foi caracterizar os isolados de geminivírus associados as diferentes
espécies de plantas da Família Fabaceae, e os objetivos específicos foram clonagem e
sequenciamento os genomas completos de geminivírus a partir de amostras de plantas da Família
Fabaceae; e estudos filogenéticos das espécies encontradas.

Metodologia

O presente estudo foi desenvolvido no Campus de Engenharias e Ciências Agrárias da

Universidade Federal de Alagoas (CECA/UFAL). A partir do DNA total extraído de plantas
individualmente, coletadas e testadas positivamente, utilizando primers espécie-específicos para
detecção de espécies de begomovírus, foram realizadas as amplificações dos genomas virais
completos por meio do método círculo rolante na presença da enzima DNA polimerase do
bacteriófago phi29, de acordo com o método descrito por Inoue-Nagata et al. (2004). Alíquotas
das reações de amplificação foram submetidas, individualmente, a clivagens com enzimas de
restrição (ApaI; HindIII; ClaI; PstI; Kpn1) para linearizar o genoma. Alíquotas das reações de
clivagem contendo fragmentos de aproximadamente 2600 nucleotídeos (nt), correspondente a
uma cópia de cada componente genômico, foram utilizadas para ligação no vetor pBluescript KS+
(Stratagene) previamente linearizado com a mesma enzima e defosforilado. O produto da reação
de ligação foi utilizado para transformação de células ultracompetentes de Escherichia coli estirpe
DH5α pelo método de choque térmico (SAMBROOK, et al., 2001). Colônias contendo os possíveis
plasmídeos recombinantes foram repicadas para meio LB líquido contendo ampicilina (Ampicilin,
sodium salt USB©) e incubadas a 37ºC sob agitação orbital de 180 rpm durante 12h. Após
incubação, as culturas foram submetidas à extração de DNA plasmidial com KIT illustraTM
plasmidPrep Mini Spin (GE Healthcare). O DNA plasmidial foi então digerido com a enzima utilizada
para clonagem e o padrão de bandas foi visualizado em gel de agarose 0,8%, utilizado para
confirmação do processo de clonagem. Os clones foram completamente sequenciados pela
Macrogen, Inc. (Seul, Coréia do Sul) por primer walking. O alinhamento múltiplo das sequências
nucleotídicas foi realizado utilizando o algoritmo MUSCLE implementado no programa MEGA 6 e
ajustados manualmente. As árvores de Inferência Bayesiana foram geradas no portal CIPRES
(MILLER et al., 2010) usando MrBayes v. 3.2.3 (RONQUIST et al., 2012). O melhor modelo de
substituição de nucleotídeos foi determinado usando o MrModeltest 2.3 (POSADA; BUCKLEY, 2004)
de acordo com o Akaike Information Criterion (AIC). As árvores foram visualizadas e editadas nos
programas FigTree v. 1.4 (ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) e Inkscape
(https://inkscape.org/pt/).

Resultado

Foram submetidas 42 amostras dos municípios de Maceió – AL, União dos Palmares – AL,
Matriz de Camaragibe – AL e Lagarto – SE para a amplificação de genomas completos utilizando
amplificação de círculo rolante (RCA) (Inoue-Nagata et., al 2004). Foi possível obter com sucesso
a clivagem das amostras utilizando as enzimas de restrição ApaI, HindIII, ClaI, PstI e KpnI. Se
obteve 42 clones correlacionados ao componente genômico DNA-A e DNA-B, sendo dos os isolados
virais LA-4, LA-6, LA-9 (Lagarto – SE); 3MCC6P, 5MCC9P, 14MCC9P, 14MCC10P, 15MCC8P,
16MCC15P (Maceió – AL); 1MC1P, 3MC2P, 3MC5P, 11MC4P, 11MC7P, 12MC2P, 16MC3P, 16MC5P,
18MC10P, 18MC11P (Matriz de Camaragibe – AL); e 1UPC9, 2UPC2K, 2UPC3, 2UPC3K, 2UPC5K,
3UPC1P, 3UPC7P, 3UPC8, 3UPC15, 3UPC23, 4UPC3P, 4UPC5P, 6UPC4, 6UPC5P, 6UPC7P, 8UPC3P,
9UPC1P, 9UPC2P, 10UPC6K, 11UPC8P, 13UPC6, 13UPC12, 14UPC9 (União dos Palmares – AL).
Analisando os resultados do sequenciamento do DNA-A e DNA-B comparando o seguimento
pareado dos nucleotídeos e seguindo os critérios adotados para o estabelecimento de espécies do
gênero Begomovirus (BROWM et al., 2015), foi constatado que todos os isolados pertencem a
espécie Macroptilium yellow vein virus (MaYVV). Os isolados foram segregados em quatro grupos
distintos. O Grupo I, formado pelos isolados de Palmeira dos Índios, obtidos do artigo de Ramos-
sobrinho et al. 2014, são os mais proximamente relacionados entre si, apresentando identidades
de sequências variando entre 99,7-100%. O Grupo II abrange isolados de União dos Palmares e
Maceió, e apresentou identidades de sequências variando entre 97,6-99,8%. O Grupo III, que
engloba os demais isolados de União dos Palmares apresentou identidades de sequências variando
entre 96,4-100%. O Grupo IV, formado pelos isolados de Matriz do Camaragibe, foi o que
apresentou maior variação das identidades de sequências, apresentando entre 93,9-100%.
Quando comparados isolados presentes nesses quatro grupos, foi observado que as identidades de
sequência variaram entre 93,9-97,4%.

A árvore filogenética do DNA-A apresentou quatro clados bem sustentados dos isolados de
MaYVV. Sendo assim, o Clado I englobou com grande predominância os isolados de MaYVV
originados do município de Matriz do Camaragibe. Prosseguindo com o Clado II, que abrigou os
isolados de Palmeira dos Índios. No Clado III houve uma divisão para a formação de dois
subgrupos, com a primeira subdivisão agrupando os isolados de União dos Palmares e na segunda
os isolados de Maceió. No Clado IV foram introduzidos os isolados restantes de União dos
Palmares. A árvore filogenética avigora com o que já foi observado nas análises de comparações
de sequências pareadas (SDT) e sugerem a existência de estruturação das populações por região
geográfica.

As amostras do município de Lagarto – SE (LA-4, LA-6 e LA-9) seguem em processo de

sequenciamento do genoma completo.

Discussão

A diversidade, variabilidade e estrutura de populações de begomovírus que infectam plantas

cultivadas e não cultivadas tem sido acessada. Estas pesquisas vêm auxiliando na compreensão
sobre a diversidade e distribuição da variabilidade genética dessas populações, pois fornecem
informações que buscam facilitar a compreensão dos processos evolutivos que estão atuando
nesse importante gênero de vírus e suas implicações no fornecimento de medidas para solucionar
e traçar estratégias de controle dessas viroses. (PRASANNA et al., 2010; GONZÁLEZ-AGUILERA et
al., 2012; CASTILLO-URQUIZA et al., 2008; SILVA et al., 2011; SILVA et al., 2012; TAVARES et
al, 2012; LIMA et al., 2013, ROCHA et al., 2013, RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; FERRO et al.,
2017; LIMA et al., 2017, MAR et al., 2017). Vários trabalhos vêm demonstrando uma tendência
das populações de begomovírus se estruturarem geograficamente (SILVA et al., 2012; LIMA et al.,
2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; MENDES et al., 2021).

Conclusão

 Todos os clones produzidos e enviados para o sequenciamento dos isolados obtidos no

estado de Alagoas apontaram para a espécie Macroptilium yellow vein vírus (MaYVV).
 A formação da árvore filogenética dos isolados de Macroptilium yellow vein vírus (MaYVV)
proporcionou uma divisão de quatro clados e dois subgrupos.

Referencia

AMBROZEVICIUS, L. P. et al. Genetic diversity of begomovirus infecting tomato and associated

weeds in Southeastern Brazil. Fitopatologia Brasileira, v. 27, n. 4, p. 372-377, 2002.

AZEVEDO, J. N.; FRANCO, L. J. D. ARAÚJO, R. O. C. Composição química de sete variedades de

feijão-fava. Teresina: Embrapa Meio Norte, 2003.

CALEGARIO, R. F. Caracterização do isolado de begomovírus MG-Bi2, um possível membro da

espécie Sida micrantha mosaic virus (SimMV). 2004. Tese de Doutorado. Tese MS). Departamento
de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG.

CARMO, M. D. S.; CARVALHO, E. M. S.; GOMES, R. L. S.; LOPES, A. C. A.; CAVALCANTE, G, R. S.

et al. Avaliação de acessos de feijão-fava, para resistência a Colletotrichum truncatum, em
condições de folhas destacadas e campo. Summa Phytopathologica, v. 41, n. 4, p. 292-297, 2015.
CASTILLO-URQUIZA, G. P. Diversidade e estrutura genética de begomovírus em duas regiões
produtoras de tomate do Sudeste do Brasil. DS Thesis, Universidade Federal de Viçosa. Viçosa MG,
2008.

CASTILLO-URQUIZA, G.P. et al. Six novel begomoviruses infecting tomato and associated weeds in Southeastern
Brazil. Arch Virol, v. 153, p. 1985-1989, 2008.
FARIA J.C. Et al. RNAi-based Bean golden mosaic virus-resistant common bean (Embrapa 5.1)
shows simple inheritance for both transgene and disease resistance. Plant Breeding, v.133, p.
649-53, 2014.

FERRO, M. M. M. et al. Genetic structure of populations of the begomoviruses Tomato mottle leaf curl virus and
Sida mottle Alagoas virus infecting tomato (Solanum lycopersicum) and Sida spp., respectively. Tropical Plant
Pathology, Brasília, v. 42, n. 1, p. 39-45, 2017.
GILBERTSON, R. L. et al. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella
occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology, v. 2,
n. 1, p. 67-93, 2015.

GONZÁLEZ-AGUILERA, J. et al. Genetic structure of a Brazilian population of the begomovirus Tomato severe
rugose virus (ToSRV). Tropical Plant Pathology, v. 37, p. 346-353, 2012.
INOUE-NAGATA, A.K.; LIMA, M.F.; GILBERTSON, R.L. A review of geminivirus (begomovirus)
diseases in vegetables and other crops in Brazil: current status and approaches for management.
Horticultura brasileira, v. 34, 18p., 2016. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV).
Taxonomy Release In. http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp. 2020.

LIMA, A. T. M. et al. Synonymous site variation due to recombination explains higher genetic variability in
begomovirus populations infecting non-cultivated hosts. Journal of General Virology, v. 94, p. 418-431, 2013.
MELGAREJO, T. A.; LEHLONEN, M. T.; FRIBOUNG, C. E.; RANNALI, M.; VALKONEN, J. P. T. Strains
of BCMV and BGMNV characterized from lima bean plants affected by deforming mosaic disease in
Peru. Archives of Virology, v. 152, n. 10, p. 1941-9, 2007.

MELLO, R. N. et al. Survey of begomoviruses associated with soybean and identification of Sida
mottle vírus (SiMoV) infecting this crop in Brazil. Virus Reviews and Research, v. 7 (Supplement),
p. 157, 2002.

MENDES, A. L. S. F. et al. High molecular diversity and divergent subpopulations of

the begomovirus Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus associated with
Cnidoscolus urens. Archives of Virology, v. 166, p. 3289-3299, 2021.

MERCADO-RUARO, P.; DELDADO-SALINAS, A. Cytogenetics studies in Phaseolus vulgaris L.

(Fabaceae). Genetics and Molecular Biology, v. 23, p. 985-987, 2000.

MILLER, M. A. et al. The CIPRES Portals. Cipres. 2010. Website

http://www.phylo.org/sub_sections/portal [acesso em 06 Maio de 2022].

POSADA, D.; BUCKLEY, T. Model Selection and Model Averaging in Phylogenetics: Advantages of
Akaike Information Criterion and Bayesian Approaches Over Likelihood Ratio Tests. Systematic
Biology, v. 53, p. 793–808, 2004.

PRASANNA, H. C. et al. The population genomics of begomoviruses: global scale population structure and gene
flow. Virology Journal, v. 7, p. 220, 2010.
RAMOS-SOBRINHO, R. et al. Contrasting genetic structure between two begomoviruses infecting the same
leguminous hosts. Journal of General Virology, v.95, n. Pt 11, p. 2540-2552, 2014.
ROCHA, C. S. et al. Brazilian begomovirus populations are highly recombinant, rapidly evolving, and segregated
based on geographical location. Journal of Virology, v. 87, p. 5784-5799, 2013.
SAMBROOK J.; RUSSEL D. Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3ª ed.). Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.

SILVA, S. J. C. et al. High genetic variability and recombination in a begomovirus population infecting the
ubiquitous weed Cleome affinis in northeastern Brazil. Archives of Virology, v. 156, n. 12, p. 2205-2213, 2011.
SILVA, S.J.C. et al. Species diversity, phylogeny and genetic variability of begomovirus populations infecting
leguminous weeds in northeastern Brazil. Plant Pathology, v. 61, p. 457–467, 2012.
VARSANI, A. et al. Capulavirus and Grablovirus: Two new genera in the family Geminiviridae.
Archives of Virology, v. 62, p. 1819–1831, 2017.

ZERBINI, F.M. et al. Traditional and novel strategies for geminivirus management in Brazil.
Australasian Parglant Pathology, v. 34, p. 475-480, 2017.
ZERBINI, F.M. et al. Traditional and novel strategies for geminivirus management in Brazil.
Australasian Parglant Pathology, Perth, v. 34, p. 475-480, 2005.

ZHANG, J. et al. V2 protein encoded by Tomato yellow leaf curl China virus is an RNA silencing
suppressor. Virus Research, v. 163, n. 1, p. 51-58, 2012.