Aplicação da

Biologia Molecular
no Diagnóstico
Laboratorial
Natália Gindri Fiorenza
Maria Paula de Souza Sampaio

Aula 02
 Diretor Executivo
DAVID LIRA STEPHEN BARROS
Diretora Editorial
ANDRÉA CÉSAR PEDROSA
Projeto Gráfico
MANUELA CÉSAR ARRUDA
Autor
EDUARDO NASCIMENTO DE ARRUDA
Desenvolvedor
CAIO BENTO GOMES DOS SANTOS
Autoras
NATÁLIA FIORENZA
Olá. Meu nome é Natália Fiorenza. Sou formada em Ciências
Biológicas, com mestrado e doutorado na área de Ciências da Saúde.
Passei por diferentes laboratórios de pesquisa, publicando trabalhos
científicos e participando de muitos Congressos e Cursos em diferentes
áreas de saúde e educação. Fui professora universitária e tutora durante
4 anos do curso de medicina, onde me conectei com minha paixão pela
docência e por metodologias ativas de ensino. Sou ávida por aprender e
ensinar e por trocar conhecimentos quer na area científico-acadêmica,
quer na área de desenvolvimento humano e autoconhecimento. Recebi
com muita alegria o convite da Editora Telesapiens para integrar seu
elenco de autores independentes, pois tenho como propósito transmitir
aquilo que sei e auxiliar outras pessoas no início de sua jornada
profissional. Estarei com você nessa caminhada de muito estudo e
trabalho. Conte comigo!

MARIA PAULA SAMPAIO

Meu nome é Maria Paula, sou graduada em Biomedicina,
habilitada em Citopatologia. Além da prática com a minha habilitação,
pude realizar um curso avançado em Citopatologia Cérvico-Vaginal.
Atualmente, sou voluntária de um projeto de pesquisa na Fundação
Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) sobre Patologia Mamária Comparada, onde fiz
iniciação científica por um ano. Em minha jornada de estudante pude
participar ativamente de congressos e projetos de estudo, e sempre
tive uma paixão por ensinar. Junto com Natália, pretendo transmitir todo
o ensinamento que obtive até aqui, buscando sempre aprender mais.
Estamos juntos nesse aprendizado!
Iconográficos
Olá. Meu nome é Manuela César de Arruda. Sou a responsável pelo pro-
jeto gráfico de seu material. Esses ícones irão aparecer em sua trilha de
aprendizagem toda vez que:

INTRODUÇÃO: DEFINIÇÃO:
para o início do houver necessidade
desenvolvimen- de se apresentar
to de uma nova um novo conceito;
competência;
NOTA: IMPORTANTE:
quando forem as observações
necessários obser- escritas tiveram
vações ou comple- que ser prioriza-
mentações para o das para você;
seu conhecimento;
EXPLICANDO VOCÊ SABIA?
MELHOR: curiosidades e inda-
algo precisa ser gações lúdicas sobre
melhor explicado o tema em estudo,
ou detalhado; se forem necessárias;
SAIBA MAIS: REFLITA:
textos, referências se houver a neces-
bibliográficas e sidade de chamar a
links para aprofun- atenção sobre algo
damento do seu a ser refletido ou
conhecimento; discutido sobre;
ACESSE: RESUMINDO:
se for preciso aces- quando for preciso
sar um ou mais sites se fazer um resumo
para fazer download, acumulativo das
assistir vídeos, ler últimas abordagens;
textos, ouvir podcast;
ATIVIDADES: TESTANDO:
quando alguma ativi- quando o desen-
dade de autoapren- volvimento de uma
dizagem for aplicada; competência for
concluído e questões
forem explicadas;
 SUMÁRIO
Princípios da Eletroforese 10
Eletroforese em gel 10
Gel de Agarose 14
Equipamentos e reagentes necessários 15
Taxa de migração do DNA através
do gel de agarose 16
Eletroforese em gel de poliacrilamina 16
SDS Page 17
Reação em cadeia da polimerase (PCR) 19
Reagentes necessários para a reação 19
PCR 21
RT-PCR 22
PCR em tempo real 23
Multiplex PCR 23
Nested PCR 24
Outros tipos de PCR 25
PCR assimétrica 25
PCR de montagem (Polymerase
cycling assembly – PCA) 25
PCR “touchdown” 26
PCR digital 26
PCR suicide 26
VNTR PCR (“variable number of tandem repeats”) 27
DNA recombinante e produção de material
genético quimérico 28
Clonagem 28
Biblioteca de DNA 30
Vetor plasmideal 31
Enzimas de restrição 36
Transfecção 38
Proteína recombinante 39
Detecção de DNA 40
Classificação das sondas 41
Condições que influenciam a hibridização 43
Marcadores 45
Síntese de sondas 46
RNA anti-senso 47
Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 7

02
UNIDADE
8 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

INTRODUÇÃO
Você sabia que existem diversas técnicas que são aplicadas na
biologia molecular? Isso mesmo. Técnicas como extração de material
genético (DNA e RNA) e eletroforese serão abordadas nessa unidade.
Também serão estudadas as tecnologias de DNA recombinante,
clonagem e hibridização de ácidos nucleicos. Demonstrando a utilização
dessas técnicas na rotina laboratorial, do diagnóstico. A reação em cadeia
da polimerase será estudada, assim como as suas aplicações. Além do
mais, veremos marcadores moleculares essenciais. O objetivo dessa
unidade é apresentar todas essas técnicas utilizadas em laboratório,
seja para diagnóstico ou para produção de proteínas recombinantes.
Entendeu? Ao longo desta unidade letiva você vai mergulhar neste
universo!
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 9

OBJETIVOS
Olá. Seja muito bem-vindo à Unidade 2.Nosso objetivo é auxiliar
você no desenvolvimento das seguintes competências profissionais até
o término desta etapa de estudos:
1. Entender os princípios do funcionamento da técnica de
eletroforese em gel de agarose e de poliacrilamida, assim como as
diferenças existentes nos géis e nos reagentes utilizados. Aprender
sobre a interpretação e principais erros que podem ocorrer.
2. Compreender as técnicas de amplificação do DNA e RNA, os
reagentes utilizados e suas funções, os diferentes tipos de técnica e sua
importância no diagnóstico laboratorial.
3. Aprender sobre a técnica de DNA recombinante, os princípios
da técnica e a sua utilização e importância no tratamento da diabetes.
4. Ressaltar os princípios da hibridização de cadeias oligonucleo-
tídicas a partir do princípio da interação Watson:Crick e as técnicas em
Biologia Molecular que utilizam sondas como forma de diagnóstico.
Então? Preparado para uma viagem sem volta rumo ao
conhecimento? Ao trabalho!
10 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

Princípios da Eletroforese
INTRODUÇÃO
Este capítulo tem o objetivo de introduzir ao leitor a técnica
de eletroforese utilizada tanto em rotina laboratorial de
diagnóstico, quanto em ambiente de trabalhos científicos.
Serão abordado conceitos da eletroforese, suas aplicações
e os tipos de géis utilizados. O entendimento desta técnica
é muito importante para os próximos capítulos. Portanto,
vamos começar o aprendizado!

Eletroforese em gel
Assim como a descoberta da estrutura do DNA deu brecha para
a descoberta de muitos outros processos e moléculas como o RNA, o
processo replicativo, transcricional e a conversão de informação em pares
de bases em aminoácidos (tradução), também deu abertura para as novas
técnicas de isolamentos das macromoléculas, tão importantes para o
organismo humano e de qualquer outro ser vivo: DNA, RNA e proteínas.

VOCÊ SABIA?
A técnica da eletroforese veio no ano de 1964, quando
um grupo de cientistas decidiram estudar a mobilidade do
DNA quando submetido a uma voltagem elétrica.

Os resultados desses estudos levaram ao estabelecimento da

eletroforese, que é a técnica que utiliza a carga elétrica das macromoléculas
para a separação das mesmas macromoléculas, através do seu peso
molecular.
A densidade dos materiais sempre foi uma característica física
avaliada quando o assunto era a separação de substâncias, como água
e óleo. Entretanto, como separar moléculas com a mesma densidade?
Imaginemos uma solução contendo vários fragmentos de DNA, de
mesma densidade, porém de tamanhos diferentes. A molécula de DNA
possui um arcabouço contendo fosfato em sua estrutura, como já foi
discutido na Unidade 1, portanto, sendo carregada negativamente. Essa
é a característica que será explorada na eletroforese.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 11

A técnica consiste em fazer com que as amostras “corram” em

um gel, podendo ser de acrilamida ou de agarose, de um polo ao outro
(no caso do DNA, do negativo ao positivo). Entretanto, não será somente
a característica elétrica da molécula que irá influenciar na corrida da
amostra. Nessa mesma solução hipotética, temos material genético
extraído de uma amostra humana. Nessa amostra, o investigador quer
identificar um gene específico dentro de um grande genoma humano.
Simplesmente correr a amostra tendo como base a característica elétrica
da molécula não vai fazê-lo encontrar o seu gene de interesse. É para
isso que são necessárias etapas anteriores à eletroforese, como a Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) ou Polimorfismo no Comprimento do
Fragmento de Restrição (RFLP), que serão discutidas posteriormente.

EXPLICANDO MELHOR:
Essas técnicas permitem que o pesquisador isole o material
genético de interesse, podendo assim ser separado pela
técnica de eletroforese de acordo com seu tamanho da
cadeia ou peso molecular.

No caso da PCR, o trecho genético específico que fora amplificado,

vai “correr” o gel, invadindo os poros do gel (que nesse caso será de
agarose), porque, durante a amplificação, aquele trecho em específico
será replicado em milhares de cópias, até que gere somente cópias
daquela região gênica alvo em específico. Assim, uma região específica
tem um peso molecular muito diferente de um genoma inteiro, ou seja,
essa região acaba migrando o gel até parar em um ponto bem distante
de sua origem e que esteja equivalente a um peso molecular.
Já no caso do RFLP, o procedimento gerará fragmentos de diferentes
tamanhos, que durante a corrida da eletroforese, irão migrar a pontos
distintos ou semelhantes a depender do peso molecular, interligados ao
tamanho da fita dupla ou simples de cada fragmento gerado.
Em conjunto com as amostras a serem analisadas, toda corrida
precisa ter uma comparação, algo que informe aproximadamente o
tamanho ou peso molecular que aquela amostra corrida tem. Portanto,
é utilizado um marcador para peso molecular, que vai indicando bandas
as quais possuem um determinado peso molecular, que vai variar
12 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

de acordo com o gel. Os géis de agarose e poliacrilamida possuem

suas especificidades quanto à corrida. No gel de agarose, a corrida é
utilizada para identificar fragmentos longos de DNA (50 – 20.000 pares
de bases) ou outras macromoléculas de grande tamanho. Já o gel de
poliacrilamida possui uma alta capacidade resolutiva ao poder separar
cadeias diferindo de um par de base ou fragmentos contendo 5 – 500
pares de base. O gel de poliacrilamida é mais utilizado para separar
proteínas de diferentes pesos moleculares.
Apesar do gel de agarose ser capaz de separar trechos de DNA
contendo milhares de bases pareadas, ela é incapaz de separar DNAs
acima de 20 - 30 kb. Essas cadeias altamente longas não podem penetrar
nos poros de agarose, sendo assim, elas ficam serpenteando seu caminho
pela matriz com uma extremidade liderando o caminho e a outra seguindo.
Moléculas acima desse peso migram de forma semelhante e são
incapazes de serem separadas na agarose. Entretanto, a eletroforese em
gel de agarose ganhou uma modificação para que essas moléculas grandes
sejam separadas, a partir do mesmo princípio do campo eletromagnético,
porém, utilizando-o em formas de pulsos elétricos alternados.
Ao aplicar a mudança da orientação do campo elétrico, as moléculas
maiores de DNA serão forçadas a se reorientarem de forma paralela ao
campo elétrico de nova orientação, antes de migrarem em direção ao polo
positivo. As moléculas maiores se reorientam de forma mais devagar em
relação as moléculas mais leves. Essa técnica é chamada de eletroforese
em gel de campo pulsado, utilizada para separar DNAs genômicos.
Figura 1: Eletroforese em gel de campo pulsado

Fonte: http://bit.ly/2QYjbw7
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 13

Houve muitas teorias acerca do modo de separação do DNA. Alguns

propuseram que o DNA migrava pelo gel como se tivesse dentro de um
tubo. Entretanto, com o intuito de obter dados sobre a migração do DNA
em gel de agarose, tanto em eletroforese convencional quanto em campo
pulsado, utilizou uma técnica de microscopia de fluorescência e corantes
que intercalavam a dupla cadeia do DNA. Estes experimentos mostraram
que, em eletroforese convencional, as moléculas de DNA migram em
um movimento cíclico que envolvem compactação e alongamento de
polímeros, sempre em paralelo ao campo elétrico. A forma alongada
se deve ao fato das cadeias estarem espremidas na porosidade do gel,
enquanto que a “cabeça” da cadeia vai sendo atraída pelo polo positivo.
O DNA é uma molécula que por si só não será capaz de emitir uma
cor, sendo incapaz a visualização da corrida dessa molécula. Para isso,
métodos de detecção do DNA são necessários para a identificação da
migração do DNA pelo gel. O brometo de etídio é um marcador fluorescente
que, ainda hoje, é tão utilizado para a identificação da migração do DNA,
a partir da irradiação de uma luz UV sobre o gel, que comumente é de
agarose. Essa molécula é conhecida como intercaladora, já que possui a
propriedade de interagir com ambas as cadeias da dupla hélice, de uma
forma perpendicular, através de forças de van der Waals com os pares de
bases. Esse marcador pode ser integrado durante a produção do gel de
agarose, ou diretamente à amostra de DNA.
Ao ser inserida diretamente na dupla fita, ela é capaz de
aumentar a fluorescência emitida em comparação quando incorporada
diretamente no gel de agarose. Além disso, ela é capaz de amenizar
a eletronegatividade dos fosfatos da molécula de DNA e aumentar o
peso molecular da dupla fita, levando a um leve retardo na migração.
Apesar das vantagens de examinar o gel de agarose diretamente em
luz UV, bandas mais nítidas são obtidas quando a corrida é realizada em
ausência do brometo de etídio. A marcação do brometo de etídio viria
após a corrida, promovendo imersão do gel em um tampão ou água
contendo brometo de etídio por 35-40 minutos.
O brometo de etídio está sendo banido por laboratórios devido
ao seu efeito carcinogênico, afinal ele possui sua característica como
intercalante de DNA. Uma forma alternativa é o SYBR Gold, um
marcador fluorescente com alta afinidade ao DNA e um alto índice
14 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

de melhoramento da fluorescência ao se ligar ao DNA. O campo

fluorescente do SYBR Gold é mil vezes maior do que o brometo de etídio.
A utilização desse fluorocromo no gel de agarose é feita antes da corrida
da amostra, adicionado antes da solidificação do gel. O SYBR Gold não
pode ser adicionado ao gel de poliacrilamida durante a sua produção, já
que pode exercer alterações e severas distorções nas propriedades da
eletroforese tanto de DNA quanto de RNA.

Gel de Agarose

DEFINIÇÃO:
A agarose é um polímero composto por alternados
resíduos de D- e L-galactose, unidas por ligações alfa e
beta-glicosídicas.

A agarose em solução contém uma aleatória estrutura de bobina

(enrolada) em altas temperaturas. Ao resfriar, as cadeias de agarose
formam feixes de fibras helicoidais mantidos juntos através de ligações
de hidrogênio não covalentes. A gelificação ocorre em temperaturas
ainda mais baixas, quando os feixes de fibras se ligam em zonas de
junção pela formação de ligações de hidrogênio adicionais.
Os polímeros de agarose são comercializados para conter 800
resíduos de agarose por cadeia. A agarose é realizada ao solubilizar
o pó de agarose em um tampão, o Tris-borato-EDTA (TBE) ou o Tris-
acetato-EDTA (TAE), e muitas vezes misturar com o corante brometo de
etídio. Após misturar, esquentar a solução em um micro-ondas até que a
agarose tenha um aspecto mais denso, significando que aquela estrutura
tem agora agarose em forma enrolada tipo bobina. Após esquentá-lo,
despejá-lo na cuba apropriada para a eletroforese, onde ela irá resfriar,
formando uma estrutura sólida maleável. Nessa estrutura, os poros
estarão bem estabelecidos para a passagem do material genético.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 15

Figura 2: Preparação do gel de agarose

Fonte: http://bit.ly/35FqQ6G

Equipamentos e reagentes necessários

O primeiro material é a agarose, que é vendida em forma liofilizada
(em pó) para que seja misturada aos tampões que serão utilizados tanto
na etapa de fabricação do gel, quanto na etapa da corrida propriamente
dita. Os tampões podem ser o Tris-borato-EDTA (TBE) ou o Tris-acetato-
EDTA (TAE). O TBE é uma solução composta por uma mistura de base
(Tris) ácido bórico e EDTA.

IMPORTANTE:
Essa solução tem a função de deixar o meio em condições
levemente básicas, desprotonado, para que a molécula do
DNA consiga ficar dissociada e solúvel em água

Além do meio básico fornecido pelo Tris, o EDTA tem uma

importância função como quelante de cátions divalentes, particularmente
o Mg+2. Esse íon está presente como cofator para enzimas com
capacidade de degradar o DNA. Sendo assim, o EDTA possui uma função
protetora do DNA por inibir que atividades enzimáticas sejam ativadas,
além de prevenir a ação de enzimas modificadoras de DNA como as
enzimas de restrição.
16 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

O TAE possui funções parecidas, entretanto, tem uma capacidade

de tamponeamento menor quando comparado ao TBE, provavelmente
devido ao ácido utilizado para contrapor o Tris, que começa a ficar
“esgotado” quando a eletroforese é realizada por tempos prolongados.
Apesar disso, o DNA consegue migrar levemente mais rápido com o TAE
ao invés do TBE e tem um melhor poder, mesmo que leve, de resolução
da corrida do que TBE para moléculas com alto peso molecular. Após
montado o gel, despejar em um recipiente, chamado de cuba horizontal
para eletroforese, e esperar o gel esfriar.
É necessário adicionar pentes ao gel quente, para que ele resfrie
formando poços que irão comportar as amostras.
As cubas serão imersas no tampão de corrida (TBE ou TAE) e
os eletrodos serão ligados, iniciando a corrida. No fim da corrida, uma
câmara de raios UV irá irradiar o gel para que as bandas de DNA sejam
reveladas, se o corante utilizado for o brometo de etídio.

Taxa de migração do DNA através do gel de agarose

A concentração da agarose utilizada determinará o tamanho
do DNA a ser investigado. Quanto maior a concentração de agarose,
menor serão os poros formados, impactando no tamanho de pares de
bases que o DNA a ser investigado poderá ter para se adequar àquela
eletroforese. Outro fator que poderá influenciar na taxa de migração
do DNA é a forma do DNA. DNA circular migrará em uma velocidade
diferente do DNA linear, assim como o DNA cortado (Nicked) e o super
helicoidal terão taxas diferentes.

Eletroforese em gel de poliacrilamina

As proteínas podem possuir cargas positivas ou negativas, a
depender da sua estrutura de aminoácidos. Uma proteína para ser
separada pode ser submetida a uma eletroforese, entretanto, em um
gel diferente do anteriormente comentado, o gel de poliacrilamida.
Esse gel é formado por poliacrilamidas unidas por ligações altamente
cruzadas, como uma matriz inerte, que é onde as proteínas passam.
Entretanto, o gel de poliacrilamida também pode ser utilizado para a
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 17

separação de DNA de uma forma mais progressiva, já que é capaz de

separar moléculas de DNA com 1 par de base de diferença. Além do
mais, consegue acomodar uma quantidade muito maior de DNA do que
a do gel de agarose e o DNA corrido nesse gel é extremamente puro e
pode ser utilizado para muitas demandas.

SDS Page
Como dito anteriormente, as proteínas podem ter cargas diferentes
a depender da organização dos aminoácidos. Entretanto, para resolver
essa situação, um detergente é aplicado afim de ligar-se a regiões
hidrofóbicas das proteínas. O Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) afeta o
desdobramento proteico, gerando cadeias polipeptídicas estendidas, as
moléculas proteicas individuais são liberadas de suas associações com
outras proteínas ou moléculas lipídicas tornando-se completamente
solúveis na solução detergente. Quando uma proteína se liga ao SDS,
a carga negativa desse detergente supera a própria carga intrínseca da
proteína, fazendo com que essa proteína migre do polo negativo ao polo
positivo da cuba vertical eletroforética.
As proteínas de mesmo tamanho molecular tendem a migrar em
velocidade equiparadas, já que suas estruturas estão desnaturadas e
lineares, podendo ser proteínas diferentes, mas possuem o mesmo peso
molecular, portanto, a mesma velocidade de migração. Proteínas de
diferentes pesos seguirão a regra do maior peso migrar de forma mais
lenta e o menor peso migrar de forma mais rápida, gerando um mix de
bandas proteicas no gel.
Outro agente redutor também pode ser adicionado afim de
quebrar as ligações S-S entre as proteínas de forma que todos os
polipeptídeos constituintes, presentes em múltiplas subunidades,
possam ser analisados separadamente. As proteínas majoritárias
facilmente são detectadas corando-se as proteínas do gel com um
corante como o azul de Coomassie. Até mesmo as proteínas menos
abundantes são visualizadas em géis tratados com coloração de prata
ou ouro, de modo que pequenas quantidades de proteína possam ser
detectadas em uma banda.
18 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

Blotting com anticorpo

Após a eletroforese em poliacrilamida, é comum utilizar um anticorpo,
ligado a um cromóforo, como o DAB, ou a um radioisótopo, para se ligar
ao epítopo da proteína de interesse, assim identificando-a. Afinal, muitas
proteínas serão migradas na eletroforese e uma proteína pode ter o mesmo
peso molecular que o seu alvo. Portanto, o Western blotting (WB) é capaz
de fazer essa identificação ao transferir as proteínas separadas pelo gel para
um papel de nitrocelulose, a partir de um campo elétrico forte. No final do
processo, terá a ligação do anticorpo conjugado à camada de nitrocelulose.
Esse anticorpo será ligado e após um processo de lavagem e de incubação
de uma enzima ou outras moléculas como o peróxido de hidrogênio (se for
necessário), haverá a liberação da cor, mostrando a sua proteína de interesse.

SAIBA MAIS:
O WB é muito utilizado para confirmação de infecção viral
do HIV, sendo a técnica de padrão ouro. Quer se aprofundar
neste tema? Leia o texto: Eletroforese: Conceitos e Aplicações,
acessível pelo link: https://bit.ly/2y5nVbI

RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu mesmo?
Agora, só para termos certeza de que você realmente
entendeu o tema de estudo deste capítulo, vamos resumir
tudo o que vimos. Você deve ter aprendido que a eletroforese
é utilizada para separação e purificação de macromoléculas,
que são, na maioria das vezes, proteínas ou ácidos
nucleicos. Compreendeu que a técnica faz com que essas
macromoléculas sejam submetidas a um campo elétrico
e que elas vão migrar para o polo positivo ou negativo, de
acordo com a sua carga. E esse fluxo é determinado pelo
peso molecular de cada molécula. Viu que a técnica pode
ser aplicada em diversas áreas, como genética, ciência
forense, bioquímica ou microbiologia. Aprendeu sobre os
tipos de géis que podem ser utilizados e quais as suas
características e melhores aplicações, assim como os tipos de
corantes e de tampões utilizados e os tipos de técnicas que
existem e a função de cada uma, ressaltando as vantagens
e desvantagens e a interferência de cada equipamento e
material no resultado da corrida do gel da eletroforese.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 19

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

INTRODUÇÃO:
Ao término deste capítulo você será capaz de entender
como funciona a Reação em Cadeia da Polimerase. Isto
será fundamental para conseguir reproduzir a técnica
de amplificação do DNA ou RNA, a partir de um DNA
complementar, aprendendo sobre seus reagentes,
sobre a ação do termociclador e os diferentes tipos de
PCRs utilizados tanto na pesquisa como no diagnóstico
laboratorial. E então? Motivado para desenvolver esta
competência? Então vamos lá. Avante!

Após a descoberta da molécula da hereditariedade, foram desenvol-

vidas técnicas de análise para facilitar o estudo dessa molécula, tendo
grande importância para a ciência e para os profissionais que trabalham
com isso. A técnica de PCR foi desenvolvida por Kary Mullis e colaboradores,
em 1983, dando a Mullis o prêmio Nobel de Química, em 1993.

VOCÊ SABIA?
Diversos estudos foram desenvolvidos para compreender
a molécula do DNA, como o Southern blot, por Edwin
Southern, o Sequenciamento, por Frederick Sanger e
Walter Gilbert e a Reação em Cadeia da Polimerase-PCR,
por Kary Mullis.

Essa técnica possui uma grande importância e vem sendo aplicada

em amplas áreas como na identificação de polimorfismo, genotipagem,
doenças genéticas e detecção de microorganismos. Ela é utilizada para
análise de ácidos nucleicos que se encontram em baixas quantidades
na maioria dos tecidos vivos. É um método eficaz para amplificação de
segmentos específicos de DNA, realizado inteiramente de forma in vitro.

Reagentes necessários para a reação

A reação se inicia a partir de um DNA molde, seja extraído
convenientemente da amostra ou de uma amostra de RNA, convertida
para DNA complementar (cDNA). É importante que o ácido nucleico não
20 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

contenha impurezas, como outro ácido nucleico, proteínas, reagentes de

extração, entre outras, e é recomendável ser utilizado em concentração
mínima de 5µl/mL (apesar de menores quantidades já terem sido
utilizadas). A DNA polimerase mais utilizada é a Taqque deve ser utilizada
juntamente a uma solução-tampão composta por íons (Na, Cl, Mg, entre
outros), e também pode ser utilizada com detergentes, que vão inibir a
formação de dímeros das cadeias enzimáticas, proteínas estabilizantes
(albumina sérica bovina) e substâncias que agem na desnaturação da
cadeia molde de DNA, como β-mercaptanoethanol, que quebrará as
pontes de hidrogênio entre as bases.
O Cloreto de Magnésio (MgCl2) é muito importante para a reação
pois é um cofator essencial para a atividade da enzima. Os primerssão
pequenas sequências de DNA, de 12 a 35 bases, complementares às
bordas, que delimitam a área que vão ser ligados os dNTPs na fita-mãe.
Os desoxinucleotídeos são utilizados para a síntese das fitas-filhas e são
compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono
5´ da desoxirribose. São adicionados pela polimerase complementar à
fita-mãe. Adiciona-se uma mistura de todos os desoxirribonucleotídeos
fosfatados (dNTPs) em concentrações iguais à reação. O termociclador
gera alterações de temperaturas que levam a desnaturação da molécula
de DNA ou cDNA, ao anelamento dos primers, e ao alongamento das
novas cadeias de DNA.
O desenvolvimento da técnica depende de amostra, primers,
dNTPs, Taq, MgCl2, tampão e termociclador.
Figura 3: Componentes da PCR

Fonte: http://bit.ly/2XPjgUz
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 21

PCR
A amostra utilizada para essa técnica pode ser sangue, biópsia de
tecido, cabelo, unha, líquidos corpóreos, entre outros. Pelo menos um par
de primer irá identificar o local do material a ser amplificado, os dNTPs irão
sintetizar as novas cópias do material genético a ser amplificado, a Taq
irá sintetizar as novas cadeias de DNA ou de cDNA, o MgCl2 junto com o
tampão irão auxiliar a atividade da polimerase. Após o MIX ser feito com
todos os reagentes, irá para o termociclador, que configurará temperaturas
ideais em tempos necessários para as etapas de amplificação.
Na primeira etapa do PCR, o DNA molde é desnaturado através do
calor e anela-se a oligonucleotídeos iniciadores sintéticos. Após isso, a DNA
polimerase é utilizada para copiar o molde de fita simples pela extensão dos
primerse o DNA é desnaturado novamente, anelado aos primers e utilizado
como molde para uma nova síntese. Nesse clico, os primers podem iniciar
a síntese a partir das fitas de DNA que foram sintetizadas no ciclo anterior
ou a partir da síntese de DNA anterior. A polimerase prossegue até o fim
do molde e lá se desconecta. Nesse segundo ciclo, o DNA que vai ser
sintetizado está cobrindo a sequência de DNA que será amplificada.
Os ciclos de desnaturação, anelamento e síntese do DNA
irão produzir segmentos de DNA que correspondem ao intervalo da
sequência que foi delimitado pelos primers.
Figura 4: Reação em cadeia da polimerase

Fonte: Adaptado de http://bit.ly/2OqAILW

O resultado da amplificação pode ser visualizado através da

eletroforese, que é uma técnica onde uma partícula carregada através
de campo elétrico pode se migrar e ser vista em forma de bandas. Essa
técnica foi abordada mais amplamente no capítulo anterior.
22 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

Existem alguns tipos de reações que podem ocorrer com a

polimerase, que possuem características diferentes em suas técnicas,
como Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR), Multiplex PCR e Nested PCR.

RT-PCR
Esta reação pode ser dividida em duas partes: a transcrição
reversa e a amplificação. O que diferencia essa reação é que ela não
inicia através de um molde de DNA diretamente extraído da amostra,
ou seja, a amostra fornece o RNA, que é convertido em cDNA. É
muito utilizada em estudos de expressão gênica, visto que através da
avaliaçãodo RNA mensageiro (mRNA), pode-se detectar quais proteínas
estão sendo expressas. Entretando, o estudo direto do RNA é inviável,
devido à sua alta sensibilidade a vários fatores e a altas temperaturas.
O primeiro passo da reação consiste na síntese de uma fita de
DNA tendo como template uma fita de RNA numa reação catalisada por
uma enzima, a transcriptase reversa. Também são utilizados primers,
mas inespecíficos e nunca em pares, são oligonucleotídeos compostos
por várias timinas consecutivas (6 a 35), que são anelados às regiões
Poly-A do RNA, que são ricas em adenina. Após este ciclo, obtém-se o
cDNA que será utilizado na PCR.
O round de transcrição reversa não altera o número de fitas de
RNA ou DNA.
Figura 5: Diferenças entre PCR e RT-PCR

Fonte: http://bit.ly/34sssAB
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 23

PCR em tempo real

Essa técnica é uma variação da técnica de PCR, que permite
monitorar o processo de amplificação em tempo real e quantificar os
ácidos nucleicos através da emissão e captação de fluorescência
durante todo o processo. O resultado é visualizado em tempo real
durante a amplificação da sequência de interesse, gerando resultados
quantitativos com maior precisão. Essa técnica utiliza um equipamento
com monitoramento da emissão da fluorescência.
Figura 6 - Demonstração do resultado gerado pelo equipamento de PCR em tempo real

Fonte: http://bit.ly/2Dl9mjV

Multiplex PCR
Em uma única reação, mais de um segmento é amplificado,
cada um com um par de primer específico.Essa técnica é muito útil na
simplificação de alguns experimentos, como em testes de paternidade,
que deve-se analisar vários marcadores genômicos.
24 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

Figura 7: Esquematização do multiplex PCR, com quatro pares de primers para amplificação

Fonte: http://bit.ly/33kKIKU

Nested PCR
A PCR “aninhada” é utilizada para aumentar a especificidade da
amplificação, reduzindo a ocorrência de amplificação não específica do
DNA. A técnica utiliza dois pares de primers (pares externo e interno) para
um único locus e dois PCRs sucessivos. No primeiro ensaio, os primers
de par externo são utilizados para gerar produtos de DNA e, assim, os
seus produtos de DNA podem conter fragmentos de DNA amplificados
não específicos. Esses produtos então entram em uma segunda corrida
de PCR, utilizando o segundo conjunto de primers internos, cujos
locais de ligação são de cada primer de par externo usado na primeira
reação. Logo, um segundo produto de PCR é produzido, mais curto que
o primeiro. Se o locus errado foi amplificado por engano no primeiro
turno, é poucoprovável que ele também seja amplificado na segunda
vez, dessa forma a nested PCR aumenta muito a especificidade da
PCR. Primers aninhados são utilizados como
​​ controle importante em
experimentos com sequência desconhecida do genoma.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 25

Uma desvantagem dessa técnica é que a adição de um segundo

par de primers após a primeira corrida de PCR aumenta a chance de
contaminação inespecífica.
Figura 8: Diferenças entre PCR e nested PCR

Fonte: http://bit.ly/2KZhA5M

Outros tipos de PCR

PCR assimétrica
Esse tipo de reação amplifica preferencialmente uma fita de DNA
em um molde de DNA de fita dupla. O processo é semelhante ao do PCR,
porém utiliza-se uma quantidade de primer para a fita alvo muito maior
que pra fita não alvo. Enquanto a PCR assimétrica progride, o primer
limitador de concentração inferior é incorporado quantitativamente
ao DNA de fita dupla recém sintetizado. É uma técnica muito útil
quando é necessária a amplificação de apenas uma das duas cadeias
complementares. Entretanto, não é muito utilizada pois possui baixa
eficiência de reação e é difícil otimizar as razões de primeradequadas, o
número de ciclos de amplificaçãoe as quantidades de material.

PCR de montagem (Polymerase cycling assembly – PCA)

O conjunto de ciclagem de polimerase ou PCR de montagem é
um método utilizado para montagem de grandes oligonucleotídeos de
DNA a partir de fragmentos mais curtos. Esse método utiliza a mesma
técnica de PCR, porém utiliza a hibridização e o anelamento do DNA,
26 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

assim como a DNA polimerase para amplificar uma sequência de DNA,

com base nos oligonucleotídeos de fita simples utilizados, permitindo a
produção de genes sintéticos e até mesmo genomas sintéticos inteiros.

PCR “touchdown”
O termo “touchdown” diz respeito aos ciclos de PCR anteriores,
onde a temperatura do anelamento é alta, abaixo da temperatura de
fusão dos pares de primers. Após isso, a temperatura de anelamento é
reduzida. O princípio dessa técnica é que a temperatura do anelamento
durante a reação do PCR determine a especificidade do anelamento do
primer. O resultado dessa técnica aumenta bastante a qualidade da PCR.

PCR digital
Essa técnica é uma nova abordagem para quantificação absoluta
de ácidos nucleicos, onde uma amostra de DNA ou cDNA é separada
em um grande número de partições em poços e as reações de PCR
são realizadas em cada partição. Os poços podem ter a molécula alvo
(positiva) ou não (negativos), tendo reações de PCR positivas e negativas.
No final, as quantidades de resultados positivos e negativos são utilizados
para gerar um número absoluto de moléculas alvo na amostra.

IMPORTANTE:
Essa técnica possui algumas vantagens, seja por não
precisar de referências ou controles endógenos, ou por
possuir alta sensibilidade e precisão devido às várias
replicações de PCR. É muito utilizada na análise de
alterações no número de cópias, sequenciamento de
próxima geração ou mutações raras.

PCR suicide
Essa técnica evita amplificações positivas falsas e devido
a isso, é muito utilizada no estudo do passado através do exame de
material genético preservado a partir de resto de organismos antigos
(paleogenética). É utilizada para evitar falsos positivos e garantir a
especificidade do fragmento amplificado.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 27

VNTR PCR (“variable number of tandem repeats”)

A repetição em tandem de número variável é uma região onde
ocorre uma sequência nucleotídica curta quando repetidas em tandem.
Essa técnica pode ser utilizada para identificação parental e pessoal, é
muito utilizada na genética, pesquisa e análise forense. A PCR do VNTR
tem como alvo a região VNTR, a análise de VNTR menores é a base para
os bancos de dados de impressões digitais de DNA.

SAIBA MAIS:
Quer se aprofundar neste tema? Recomendamos que leia
o artigo: Sensibilidade da técnica de reação em cadeia
da polimerase para HIV-1 em relação à técnica de ensaio
imunoenzimático (Rezende et. Al), acessível pelo link
https://bit.ly/30SKCtK

RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu mesmo
tudinho? Agora, só para termos certeza de que você
realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo,
vamos resumir tudo o que vimos. Você deve ter aprendido
que a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é muito útil
em diversos tipos de diagnósticos laboratoriais. Viu quais os
principais reagentes utilizados na técnica, como iniciadores
(primers)e a DNA polimerase (Taq) e suas etapas, que se
resumem em desnaturação, anelamento e extensão.
Compreendeu que podem ser utilizadas várias amostras,
como sangue ou tecido. Aprendeu a função de cada um dos
reagentes e qual a sua atuação na PCR. Soube que existem
diversos tipos de técnicas de PCR, como PCR em tempo
real e multiplex PCR, e que cada uma dessas técnicas
possui uma especificidade e diversas características que
irão determinar o seu uso. Entendeu as diferenças entre
todas as técnicas, assim como as suas utilidades em casos
como a paleogenética e análise forense, que vão além da
detecção de microorganismos e identificação de doenças.
28 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

DNA recombinante e produção de

material genético quimérico
INTRODUÇÃO:
Os tópicos a seguir irão explicar detalhadamente a
tecnologia de DNA recombinante, abordando todas as suas
etapas e aspectos. O método de clonagem do DNA será
explorado, especificadamente a clonagem molecular que
é o isolamento de uma fia de DNA para reproduzi-la via um
vetor celular que possa multiplicar o seu próprio material
genético e o do DNA alvo. Vamos lá?!

Clonagem
Na biologia molecular e celular há um termo que define o processo
de multiplicar uma região do DNA (gene) ou fita/trecho em específico:
clonagem. A clonagem pode ser dividida em duas categorias: A primeira
é a multiplicação via amplificação do material genético, produzindo
várias cópias idênticas de uma molécula de DNA, um processo realizado
a partir da técnica recém-discutida de PCR. Entretanto, a segunda forma
de clonagem é capaz de multiplicar essa mesma molécula de DNA,
mas não a partir de técnicas de amplificação da molécula, mas sim pelo
isolamento dessa molécula em uma célula que seja capaz de se replicar
e replicar a fita de DNA de interesse.
Em 1972, um bioquímico chamado Paul Berg teve a ideia de utilizar
o Vírus Símio 40 (SV 40) para introduzir um gene de interesse em uma
célula, permitindo que a célula hospedeira conseguisse multiplicar o
material genético de interesse e, também, produzir a proteína desejada.
O genoma desse vírus nada mais é do que um pedacinho de DNA, 600
mil vezes mais curto do que o genoma humano, possuindo apenas 7
genes, ao contrário dos 21 mil do genoma humano. O ponto que mais
lhe chamou atenção era que o sv40 poderia coexistir mais ou menos
de forma pacífica com certos tipos de células infectadas. Ao invés de
produzir milhões de novas partículas virais, como outros vírus comumente
fazem, ele insere o seu DNA no cromossomo da célula hospedeira e, em
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 29

seguida, entra em uma calmaria reprodutiva até ser, de alguma forma,

ativado. O caráter compacto do genoma do sv40 e a eficiência que ele
podia ser introduzido dentro das células lhe dá uma característica ideal
para sua utilização como vetores de entrega de genes, como acontece
com a técnica do CRISPR/Cas9.

EXPLICANDO MELHOR:
Alguns vírus são considerados ótimos vetores de entrega
de genes em células-alvos devido a sua capacidade de
entrar na célula-alvo sem que haja outros processos de
transfecção. Hoje em dia, as técnicas de edição gênica
estão trabalhando muito com esses vetores. Um exemplo
disso é o CRISPR/Cas9 que é uma endonuclease guiada
por um RNA capaz de clivar um trecho de 20 pares de base
de uma cadeia polipeptídica. Esse sistema é utilizado por
bactérias para se defender de bacteriófagos invasores. Seu
princípio de ação é bastante utilizado para editar genes
mutados de células humanas. Para que esse sistema de
edição alcance seu alvo, um vetor de transfecção precisa
colocá-lo dentro da célula. E é aí que alguns vírus como o
adeno-associado entra.

Foi a partir daí que Paul teve a ideia de introduzir um gene

bacteriano diretamente no genoma viral para que esse vírus infecte a
célula-alvo e leve junto o seu DNA de interesse, assim a informação
hereditária dessa célula seria alterada, podendo produzir uma proteína
que antes não produzia. Entretanto, ele precisava superar suas primeiras
barreiras da genética: Como “pescar” um determinado gene de interesse
e inseri-lo no genoma viral para a produção de quimeras genéticas?
Importante ressaltar que antigamente o trabalho foi mais complicado
do que quando feito hoje em dia, afinal, algumas técnicas formuladas
posteriormente, como a PCR, são utilizadas hoje como um facilitador do
processo de construção do DNA quimérico.
A pesca do material genético não é o único problema, afinal, tem
que haver uma forma de introduzir esse material genético no genoma
viral, ou seja, primeiro precisa forçar a abertura do genoma viral circular,
pegando como exemplo o sv40, na posição correta para que o gene
30 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

específico consiga ser inserido de forma exata no genoma viral e que

seja totalmente complementar também. Para que isso seja possível,
é necessária a ação de uma enzima capaz de cortar o DNA tanto de
interesse quando viral em trechos que permitam o pareamento entre
ambos. Essa enzima é chamada de enzima de restrição.
Após a criação do DNA viral quimérico, ele estaria apto a infectar
uma célula humana e modificar as informações genéticas contidas em
seu genoma. Mas seria possível um DNA quimérico, um genoma viral
com um gene bacteriano, por exemplo, conseguir gerar uma molécula
efetora de proteína em uma célula humana? As propriedades do código
genético veem à tona para esclarecer essas questões de funcionalidade.

IMPORTANTE:
O código genético é universal, o que significa dizer que uma
proteína codificada por uma bactéria pode ser codificada
por uma célula humana, caso a mesma sequência
gênica esteja disponível para atuação da RNA polimerase
transcrever em um RNA e do RNA em uma proteína. O fluxo
de informação genética está presente em todas as técnicas
em biologia molecular.

Biblioteca de DNA
Para isolar um gene específico pela técnica de clonagem, é
necessária a construção de uma biblioteca de DNA, que é uma coleção
abrangente de DNA clonado em uma célula, que normalmente é a
Escherichia coli. Essa biblioteca inclui, no mínimo, um fragmento do
gene de interesse do pesquisador em todas as moléculas de DNAs
clonados. Então, ao transfectar o vírus na célula humana, pegando pelo
caso anterior, essa célula humana será cultivada em meio de cultura
para que ela cresça e se multiplique, expandindo também o seu gene
inserido através do vetor viral.
Hoje em dia, o processo de clonagem do DNA é feito mais com
transfecção de plasmídeos recombinantes em células bacterianas ou
em leveduras. Como a E.coli se divide mais rapidamente do que um
Saccharomyces então os testes são mais utilizados nessa bactéria.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 31

Outro exemplo de biblioteca de DNA é envolvendo o DNA

complementar (cDNA). O genoma humano é muito extenso, então criar
uma biblioteca de DNA desse genoma vai envolver vários plasmídeos
contendo clones de DNA genômico, sendo muitos plasmídeos
contendo DNA composto exclusivamente de bases não codificantes,
íntrons. Entretanto, para montar uma biblioteca de DNA somente com
os genes codificantes (que até um gene possui cadeias intronicas), será
necessário pegar um mRNA, já que eles são as moléculas compostas
de genes puros, sem os íntrons. Portanto, ao utilizar o mRNA, terá que
convertê-lo ao seu DNA complementar, utilizando uma transcriptase
reversa em RT-PCR. O cDNA será um DNA contendo somente os éxons
de um gene, sendo assim, viável para a construção da biblioteca de DNA
somente com as regiões codificantes.

Vetor plasmideal
Os plasmídeos são DNAs circulares que fazem parte do genoma
da célula bacteriana. Os plasmídeos utilizados para a tecnologia de DNA
recombinante são muito menores do que os bacterianos. Isso confere
uma característica benéfica para o investigador, já que esse plasmídeo
possui um peso molecular muito menor do que o genoma bacteriano em
geral, sendo fácil de separá-los após uma centrifugação, por exemplo,
já que o genoma bacteriano acaba formando um sedimento no fundo
do tubo.
Para que esses plasmídeos comportem os genes de interesse,
primeiro ambos precisam passar por um tratamento com enzima de
restrição para abrir o DNA circular e formar pontas coesivas capazes de
interagirem umas com as outras (plasmídeo e DNA de interesse).
Antes de promover os cortes no vetor plasmideal, é preciso
primeiro “pescar” o gene de interesse na célula desejada, e, para isso,
deve-se levar em consideração o tipo celular que comporta esse gene
de interesse. Como visto na unidade passada, a transcrição do RNA em
procariotos e eucariotos acontece de formas totalmente diferentes.
Os procariotos não possuem núcleo e muito menos íntrons, ou
seja, o mRNA das bactérias não passa por processos como splicing
alternativo e nem por outros processos modificadores da sequência
32 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

do RNA. Eles são formados e diretamente traduzidos. Já o mRNA de

eucariotos, por exemplo as células humanas, possuem íntrons e passam
por processos de modificação na estrutura do mRNA.
Para criar plasmídeos contendo clones de DNA nos eucariotos
o processo é muito mais complicado do que os procariotos, porque o
gene no DNA dos eucariotos não possui íntrons, ou seja, a “pesca” pode
ser diretamente no DNA das bactérias, diferente das células humanas
que terão que ser a partir do mRNA, transformando-os em cDNA para
poder usar sequências exclusivamente decodificantes.
A pesca será permitida através da técnica de PCR, nas bactérias,
que irá gerar fragmentos com cadeias alvos das enzimas de restrição e
pela RT-PCR, nos eucariotos, onde primeiro será necessária a conversão
do mRNA em cDNA para sua posterior amplificação.
O DNA plasmideal possui elementos essenciais para a sua
manutenção e função na célula hospedeira. O seu tamanho é uma
característica fundamental, afinal, moléculas muito grandes são mais
difíceis de se manipular e têm maiores tendências de se degradarem
durante o período de purificação. Nesse plasmídeo deve haver uma origem
de replicação que forneça capacidade ao plasmídeo de multiplicação
independente do cromossomo da célula hospedeira. Os plasmídeos
menores aproveitam as DNA polimerases das células hospedeiras para
promover sua própria replicação, enquanto que plasmídeos maiores
comportam genes codificadores nas próprias enzimas de replicação.
Outra característica é a presença de um promotor forte, que irá
conter várias sequências iguais e muito próximas umas das outras. Além
disso, alguns plasmídeos também terão promotores Lac, Tac e T7. O
promotor Lac é semelhante ao operon Lac nas cepas selvagens de E.coli,
sendo assim, expressando o repressor LacI que irá se ligar ao operador
Lac na ausência do indutor. O promotor Tac possui a região promotora
do operon Trp e a região operadora do operon Lac. Então, ambos os
promotores serão transcritos caso haja a ação de um indutor, porque
esses dois promotores e o operador ficam próximos uns aos outros.
O operador vai impedir que tanto o promotor Trp quanto o Lac sofra
ação da RNA polimerase, levando à transcrição do gene de interesse. O
indutor pode ser ou a lactose ou isopropiltiogalactosídeo (IPTG).
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 33

O promotor T7 está presente em plasmídeos um pouco maiores, o

suficiente para comportar o promotor que transcrever a RNA polimerase
do fago T7. Essa RNA polimerase é muito mais ativa do que a bacteriana,
tendo esse plasmídeo um nível de transcrição basal muito maior. Em
algumas ocasiões, o operador Lac pode estar entre o gene de interesse
e o promotor T7. Sendo assim, esse promotor só será ativado caso na
presença do indutor.
Figura 9: Promotor T7 nos plasmídeos

Fonte: http://bit.ly/34rGeDJ

Todo plasmídeo deve possuir uma região chamada local múltiplo

de clonagem, onde será o espaço ideal para que o gene de interesse
seja inserido para a sua devida transcrição. Essa região poderá sofrer
ação de múltiplas enzimas de restrição.
[[Importante]]: Os plasmídeos devem ter somente um local de
reconhecimento onde as enzimas irão cortar.
Caso tenha mais de um local para corte das enzimas, o gene,
ao ser inserido, pode acabar entrando em uma região não desejada,
prejudicando o processo de transcrição dentro da célula hospedeira.
Portanto, somente um local de transcrição aumenta as chances de uma
inserção desejada e a decodificação eficiente do gene de interesse.
Alguns tipos de plasmídeos são capazes de inserir-se no genoma
bacteriano. Estes plasmídeos integrativos ou epissomas podem ser
mantidos de um modo estável durante numerosas divisões celulares,
mas em algum momento irão retornar a seu estado independente.
34 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

Todo plasmídeo de clonagem precisa ter um gene repórter capaz

de sinalizar que o processo de transfecção do plasmídeo foi um sucesso.
Esse gene repórter é um fator de resistência bacteriana a um antibiótico,
que pode ser o Cloranfenicol ou Ampicilina. A bactéria que conseguir
captar o plasmídeo de clonagem, ao ser incubada em meio de cultura
contendo esses antibióticos, poderão crescer no meio, sinalizando então
que o plasmídeo foi transfectado com sucesso.
Apesar dos plasmídeos bacterianos serem os mais utilizados no
processo de clonagem, algumas células eucariotas possuem esses
DNAs circulares autoreplicantes, como os Saccharomyces cerevisiae
que não são muito recomendados por alguns autores, uma vez que
sua forma circular não é permanente. Além de seus plasmídeos serem
utilizados em alguns casos, as leveduras também podem ser as células
hospedeiras que irão abrigar o DNA quimérico. Existem três formas de
introduzir o DNA estrangeiro nessas células:
1. Os plasmídeos a serem inseridos têm que possuir centrômeros
para que aquele DNA plasmideal participe da mitose, onde o fuso
mitótico irá distribuí-los para as células descendentes;
2. O plasmídeo pode ser inserido sem um centrômero, tornando
a estrutura desse DNA instável e passando para as células descendentes
ao acaso;
3. O DNA recombinante pode ser inserido diretamente ao
cromossomo de uma levedura.
Apesar dos plasmídeos de menor tamanho serem os mais
utilizados nos processos de clonagem de genes, há a possibilidade
de trabalhar com fragmentos muito grandes de DNAs. Pesquisadores
começaram a utilizar cromossomos artificiais de leveduras (YACs,
yeast artificial chromosomes) para comportar os fragmentos de DNA
com 300 mil a 1 milhão de pares de nucleotídeos. Outra vertente da
mesma aplicabilidade é usar plasmídeos que têm a capacidade de
clonar fragmentos muito maiores também, os chamados cromossomos
artificiais da bactéria (BAC, bacterial artificial chromosome). Esses
cromossomos conseguem estar presentes nas bactérias em somente
uma ou duas cópias.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 35

Essa característica tem impacto benéfico, devido a capacidade

reduzida dos BAC em interagir com outras sequências presentes em
outras cópias do plasmídeo. Por sua estabilidade, habilidade de aceitar
grandes insertos de DNA e por serem facilmente manipulados, os BACs
são agora os vetores preferidos para construir bibliotecas de DNA de
organismos complexos, incluindo aqueles representando o genoma
humano e o de camundongo.
Os plasmídeos podem ser separados em 2 grupos básicos: os
conjuntivos e os não-conjuntivos. Os conjuntivos possuem sequências
específicas, tra-gene, que são capazes da conjugação, isto é, o processo
sexuado das bactérias de repasse de informação hereditária. Os não
conjuntivos não possuem essa sequência, sendo incapazes de participarem
da conjugação sozinhos, a menos que estejam acompanhados de um
plasmídeo conjuntivo.

VOCÊ SABIA?
A conjugação é responsável pelo evento de resistência
bacteriana em algumas infecções. Bactérias super resistentes
a muitos antibióticos são o grande desafio da medicina
moderna e essa resistência é devido à reprodução sexuada
das bactérias, conjugação, que podem passar plasmídeos
de uma para outra. Esses plasmídeos, comumente,
possuem um fator microbiano que lhes confere resistência
aos antibióticos que muitas das vezes são os mais potentes
existentes. É por esse motivo que o uso de qualquer
antibiótico sem a orientação médica é contra-indicado, já
que a bactéria que está infectando aquele organismo pode
ser resistente, promovendo assim a ação dos antibióticos
somente na flora bacteriana fisiológica. Caso o antibiótico
seja tomado fora do tempo estimado, a bactéria patogênica
pode criar resistência contra ao antibiótico.

Os plasmídeos podem ser classificados também quanto às suas

funções:
a. Plasmídeo de Fertilidade (F): Contém apenas transgenes,
tendo a função de iniciar a conjugação bacteriana;
b. Plasmídeo de Resistência (R): Contém genes de resistências
capazes de codificar fatores de resistência a antibióticos;
36 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

c. Col-Plasmídeos: Contém genes capazes de produzir colicinas,

proteínas capazes de matar outras bactérias;
d. Plasmídeos degradativos: Contém genes que permitem a
digestão de moléculas pouco habituais, como o ácido salicílico;
e. Plasmídeo de virulência: Consegue transformar a bactéria num
agente patogênico.
Os plasmídeos são moléculas extremamente importantes para as
bactérias e uma cópia única de um plasmídeo pode desparecer numa
célula filha após os eventos da divisão celular. Para assegurar que isso
não ocorra,alguns plasmídeos incluem um “sistema viciante”, produzindo
tanto um veneno de longa vida como um antídoto de vida curta. A célula
que mantiver uma cópia do plasmídeo irá sobreviver, ao passo que a
célula que não o possuir morrerá em breve por falta do antídoto.

Enzimas de restrição
Após a pesca do gene alvo, será preciso introduzir esse gene dentro
do DNA plasmideal para que ele seja introduzido dentro da célula para
clonagem e produção das proteínas desejadas. Enzimas especializadas
em cortar o DNA em segmentos específicos são convocadas para cortar
tanto o gene de interesse quanto o DNA plasmideal, afim de formar
terminações concisas e equivalentes, permitindo a recombinação do
gene de interesse com o plasmídeo. Junto a esse processo de colagem,
a DNA ligase participará no processo de união polinucleotídica, unindo o
arcabouço nucleotídico de ambos os DNAs.
As enzimas de restrição são encontradas em bactérias. A função
delas é de auto-defesa. Durante a invasão de um bacteriófago, por
exemplo, a bactéria terá de se defender por meio de alguns mecanismos.
O CRISPR/Cas 9 é um exemplo, mas o que realmente importa aqui são
as enzimas de restrição. Elas têm a capacidade de cortar fragmentos
de DNA viral a depender de sequências palindrômicas. Após o
reconhecimento desses determinados sítios, que mudam de enzima à
enzima, essas proteínas farão cortes no sítio de restrição ou em locais
próximos a ele. Os cortes podem mudar de conformação, a depender da
enzima. Geralmente, existem dois grupos de cortes: escalonados e cego.
O corte escalonado acaba gerando extremidades de fitas simples. O corte
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 37

cego não gera extremidades de fitas simples, mas sim extremidades

totalmente cortadas, sem prolongamento de fitas. Essas extremidades
de fita simples também são denominadas de extremidades pegajosas.

IMPORTANTE:
As extremidades pegajosas são úteis na clonagem porque
produzem dois pedaços de DNA (do gene de interesse e
do plasmídeo) que são capazes de interagirem uma com a
outra. Ao contrário dos cortes cegos, também chamados de
cortes bruscos, que não deixam extremidade e dificultam a
ligação das cadeias de DNA.

Uma estratégia utilizada durante o corte é o uso de enzimas de

restrição diferentes. Ao usar uma enzima para clivar um mesmo DNA, em
ambos os lados, tanto o DNA do gene de interesse quanto o plasmideal
podem ser inseridos de forma errada, por conta de um looping que o
DNA por parte do DNA de interesse, levando à ligação da parte que
deveria estar a 3’ no DNA plasmideal, na extremidade 5’, ou seja, uma
ligação de modo inversa.
Existem diversas enzimas e para cada enzima há uma
nomenclatura. A EcoR1 é uma enzima capaz de promover o corte na
região palindrômica G A A T T C. Portanto, o nome EcoR1 tem que indicar
o Gênero, a Espécie, a estirpe e a ordem de descoberta. E – Escherichia;
co – coli; R – RY 13; 1 – primeira enzima de restrição da E.coli a ser
descoberta.
Existem outras como HindIII, TaqI, HaeIII que são capazes de
contribuir para o processo de produção de DNA recombinante.
Tabela 1: Tipos de enzimas de restrição e suas origens

Enzimas Origem Sequências de restrição

Bacillus -G-G-A-T-C-C-
BamHI
amyloliquefaciens -C-C-T-A-G-G-
-G-A-A-T-T-C-
EcoRI Escherichia coli
-C-T-T-A-A-G-
-A-A-G-C-T-T-
HindIII Haemophilus influenzae
-T-T-C-G-A-A-
38 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

-G-G-T-A-C-C-
Kpnl Klebsiella pneumoniae
-C-C-A-T-G-G-
-C-T-G-C-A-G-
PsfI Providencia stuartii
-G-A-C-G-T-C-
-G-T-C-G-A-C-
SalI Streptomyces albus
-C-A-G-C-T-G-
-C-C-C-G-G-G-
SmaI Serratia marcescens
-G-G-G-C-C-C-

EXPLICANDO MELHOR:
Quando se diz “região palindrômica”, entende-se por uma
região que quando lida de traz para frente, na sequência
complementar, é a mesma sequência. A sequência
complementar dela seria a C T T A A G, que lida de traz para
frente fica G A A T T C.

Transfecção
Com o DNA plasmideal montado, precisava haver a transfecção
desse DNA circular na célula hospedeira. A forma de transdução já foi
explicada, que é a utilização de um vetor viral, um bacteriófago para
uma bactéria, capaz de adentrar à célula hospedeira, levando junto o
gene de interesse. Uma outra forma bem conhecida e a mais aplicada é
a transformação bacteriana, processo descoberto por Griffith, em 1928.
A transformação é a passagem de um material genético para
uma bactéria, transformando-a capaz de codificar uma proteína com
uma função. Entretanto, antes que haja a transformação, é necessário
o processo de competência bacteriana. A competência tornará as
bactérias competentes a receber o material plasmideal exógeno, já que
nem todas as bactérias são naturalmente competentes a esse processo.
A competência é feita ao submeter a bactéria em uma solução fria de
cloreto de cálcio por um tempo. Se necessário é possível aumentar
a eficiência do processo por recursos a outros íons monovalentes ou
bivalentes.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 39

Após esse processo, há duas formas de fazer com que o DNA entre
na célula: O DNA por si só não será capaz de atravessar a barreira da
parede bacteriana, sendo assim, dois processos podem ser realizados
capazes de permeabilizar a parede celular bacteriana, eletroporação e
choque térmico. O choque térmico é a retirada da colônia bacteriana ao
gelo e passando-a para um local mais quente, dando assim um choque
térmico em parede celular, criando poros, permitindo a passagem
do DNA. A eletroporação consiste em pequenas descargas elétricas,
desestabilizando a tensão elétrica que envolve a parede celular bacteriana,
criando poros, permitindo assim a entrada do DNA plasmideal.

Proteína recombinante
Quaisquer proteínas pertencentes de quaisquer células estão
em pequenas concentrações em seus respectivos meios. Sendo assim,
o seu processo de extração se torna bastante difícil, envolvendo uma
produção maciça de células para a extração de pequenas quantidades de
proteínas, como acontecia com a insulina. As pessoas diabéticas precisam
de insulina para regularizar os níveis de glicose no sangue. Entretanto,
antigamente era muito difícil obter um extrato relativamente razoável de
insulina. Com a tecnologia de DNA recombinante, há a possibilidade de
produzir concentrações elevadíssimas de insulina em apenas uma célula,
melhorando o processo de tratamento dessas pessoas diabéticas. Outra
aplicação para a técnica é a produção de proteínas de patógenos virais ou
bacterianos, por exemplo a proteína GP 120 do HIV, em células bacterianas
para a produção de vacinas a partir dessas proteínas.
Entretanto, após a clonagem nas células hospedeiras, além da
produção maciça do DNA plasmideal, a proteína também vai sendo
produzida e concentrações muito elevadas.
Será necessária a separação dessas proteínas, já que uma
bactéria produz outros tipos de proteínas também. É para isso que dois
processos são utilizados no DNA plasmideal: a inserção de um trecho de
DNA capaz de codificar uma cauda de histidina ou um gene fluorescente
GFP, capaz de codificar uma proteína fluorescente. Ambos os trechos a
mais inseridos no DNA plasmideal permite que a proteína de interesse
seja separada facilmente por cromatografia.
40 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

SAIBA MAIS:
Quer se aprofundar neste tema? Recomendamos a leitura
do artigo A Engenharia Genética, disponível em: https://bit.
ly/2PqG6RS

RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu mesmo
tudinho? Agora, só para termos certeza de que você
realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo,
vamos resumir tudo o que vimos. Você deve ter aprendido
que a tecnologia do DNA recombinante possibilita a
alteração do material genético de organismos seja pela
introdução ou pela supressão de genes estruturais. E que
existe uma biblioteca de DNA que é utilizada para isolar
um gene específico através da técnica de clonagem.
Aprendeu sobre essa técnica de clonagem e sobre os
vetores utilizados, principalmente os plasmídeos de
bactérias, assim como os tipos de plasmídeos existentes
e suas funções. Conheceu alguns tipos de enzimas de
restrição existentes, que possuem função de autodefesa.
Aprendeu sobre a transfecção do DNA circular na célula-
alvo e também sobre a transformação, que é a passagem
do material genético para a bactéria. Por fim, entendeu que
existem proteínas recombinantes que são utilizadas na
técnica de DNA recombinante, na produção de proteínas.

Detecção de DNA
INTRODUÇÃO:
Neste capítulo será abordada uma outra forma de
manipulação do DNA que é a utilização do pareamento
de bases Watson-Crick para identificar outras cadeias
polinucleotídicas, o processo denominado de Hibridização.
No final do capítulo você será capaz de entender o que é
uma sonda, seus princípios básicos, estrutura, formas de
sintetização e aplicabilidades dessa técnica.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 41

Classificação das sondas

Após a descoberta do DNA, várias técnicas de manipulação do DNA
de diferentes aspectos estão disponíveis. Uma delas utiliza as características
dos pareamentos de fitas anticomplementares para identificar moléculas
de DNA e RNA em uma amostra biológica. O nome desse processo se
chama hibridização. A hibridização é realizada ao submeter uma sonda de
DNA ou RNA que seja capaz de se parear a uma cadeia polinucleotídica
contendo 100% de complementariedade. Essa sonda será marcada
com alguma molécula capaz de gerar imagem, seja ela fluorescente,
quimioluminescente ou um radioisótopo. A sequência alvo será imobilizada
em uma membrana para que a ação da sonda seja facilitada.
Muitas sondas são significantemente menores do que as
moléculas alvo para as quais irão se hibridizar. As moléculas das sondas
conseguem ser bem menores, com 20 pares de base, e ainda mantem
a habilidade de discriminar as sequências altamente complementares
em uma amostra contendo todo um genoma celular. Essas sondas são
construídas com base em ferramentas de bioinformática, que terão
a capacidade de identificar a região mais estável, ou conservada na
sequência alvo. Tendo encontrado essa região bem conservada, haverá
a construção da molécula da sonda, com base nas características
principais do processo da complementariedade: além de ter pares de
bases complementares, elas precisam ser invertidas, palindrômicas, já
que a ligação de cadeias ocorre de forma antiparalela.
Sondas curtas tendem a se hibridizarem de forma mais rápidas às
suas sequências alvos quando comparadas às sondas mais longas. Isso
pode ser explicado pegando o mesmo raciocínio utilizado para explicar
as diferenças de migração entre as cadeias de DNA na eletroforese, o
peso molecular.
Uma enorme vantagem na utilização das sondas curtas é que
elas podem ser hibridizadas em soluções tampões aquosos livres de
formamida. E por fim, as sondas curtas podem ser projetadas com
poucas informações da proteína, sendo projetadas sob medida, ainda
mais se nenhuma sonda estiver disponível.
A hibridização pode ocorrer de forma com que a sonda e as
moléculas alvos estejam flutuando em um meio liquido. A hibridização
42 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

dessas moléculas nesse meio vai ser a base da cinética das colisões
aleatórias. Entretanto, há um jeito mais rápido de obter a hibridização de
suas cadeias polinucleotídicas, que é o aprisionamento da sequência
alvo em uma membrana e a adição direta das sondas. Quando essas
sondas são adicionadas a um filtro, sua sensibilidade é prejudicada.

EXPLICANDO MELHOR:
Isso se deve ao fato de ao fixar os ácidos nucleicos no
filtro, isso acaba tornando alguma dessas moléculas
incapazes de hibridizar a uma sonda, talvez devido a uma
incapacidade estérica, já que o sítio de ligação pode estar
em uma orientação em que a sonda não seja mais capaz de
se ligar àquela molécula.

Essas sondas são capazes de identificar de forma quantitativa

ou qualitativa o nível de expressão que um gene tem; inserções e
deleções gênicas; material amplificado; rearranjos gênicos; translocações
cromossômicas; mutações pontais tipo polimorfismos; e alterações
aberrantes em genes que predispõe eventos carcinogênicos.
As sondas podem ser de diversas formas, mas as mais abordadas
serão as sondas de DNA e RNA. Podem ser sondas feitas de DNA de
fita dupla, requerendo assim um processo de desnaturação em seus
constituintes de fita simples, sondas de DNA genômico e sondas de DNA
complementar de cadeia simples (cDNA), sintetizados a partir de mRNA
submetido ao processo de transcrição reversa pela RT-PCR. Esses
últimos são usados para identificar sequências que são unicamente
presentes em uma ou mais populações de RNA.
Uma desvantagem do uso de DNA como sondas é que eles são
termodinamicamente menos estáveis do que as sondas de RNA. Isso é
por conta da ausência da hidroxila (OH) no carbono 2’ do DNA. Como as
moléculas de RNA possuem, ao se hibridizarem com outras moléculas
como o DNA e RNA, a presença dessa hidroxila acaba formando ligações
de hidrogênio. Sendo assim, a interação DNA:DNA (sonda de DNA em uma
molécula alvo de DNA) é menos estável do que os outros tipos de interações
como DNA:RNA e dsRNA (double strand RNA). Por essa razão, sondas de
RNA permitem condições de lavagem e hibridização muito rigorosas,
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 43

sendo então bastante benéficas para o uso nos experimentos envolvendo

hibridização. Entretanto, caso não tenha cuidado, essas sondas podem
promover ligações inespecíficas extensivas e altamente problemáticas.
A rigorosidade representa a probabilidade que a associação
que os pares de bases têm para formar cadeias de fitas simples. Essa
definição vem a partir de pares de bases sob condições bastante hostis.
Portanto, só haverá pareamento de bases caso as moléculas, mesmo
sob condições conturbadas para que haja a hibridização, sejam 100%
complementares umas com as outras.

Condições que influenciam a hibridização

A utilização de sondas de RNA se torna uma ótima vantagem
quando se quer obter sondas capazes de parear de forma muito mais
estável a sequência alvo. Entretanto, alguns fatores externos também
precisam ser levados em conta no momento do experimento, afinal eles
podem evitar que missmatchs acabem dando resultados falso-positivos.
Os mismatchings são pareamentos indevidos da sonda em uma cadeia
polinucleotídica não totalmente complementar. Em uma amostra para
análise é comum ter vários DNAs ou mRNAs do genoma humano, isso
se a amostra a ser analisada for humana.
Dentro de um genoma tão extenso quanto o do ser humano, um
eucarioto superior, haverá uma sequência de bases similar à sequência alvo
da sonda. Essa similaridade vai gerar uma ligação imperfeita entre a sonda
(seja ela DNA ou RNA) e a sequência indevida. Essa sequência chamaremos
de sequência fora do alvo (off-target). Sendo assim, sequências fora do alvo
são capazes de gerar resultados falso-positivos.Os mismatchs são eventos
que, querendo ou não, naturalmente podem ocorrer. Esses eventos fora
do alvo podem ser controlados com a manipulação de alguns fatores
envolvendo o meio externo, tendo interferência também as propriedades
estruturais da própria molécula. A seguir, serão apresentados variáveis que
possam alterar o rendimento da hibridização:
1. Temperatura: Talvez seja a variável mais levada em conta
na hora de prevenir ou induzir a hibridização entre duas moléculas.
Isso porque essa variável é fácil de ser manipulada. Cada molécula
polinucleotídica em dupla fita possui uma temperatura de fusão, ou
44 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

melting temperature (Tm), o que irá predizer a temperatura necessária

para que 50% de uma dupla fita de cadeia polinucleotídica se dissocie
formando e 50% de cadeias simples. Portanto, o aumento da temperatura
vai levar no aumento da rigorosidade do meio, levando em uma maior
dissociação das fitas antiparalelas do DNA. Em um meio suficientemente
rigoroso, as únicas moléculas que irão se parear serão as com 100% de
complementariedade, sendo assim, aumentando a sensibilidade das
sondas às suas cadeias alvo.
2. Força iônica: A rigorosidade do meio é extremamente
influenciada pela concentração da força iônica, representada pela
concentração de sais monovalentes no meio. A cadeia dos polinucleo-
tídeos é carregada negativamente, por esse fato, ambas as fitas,
carregadas negativamente, têm a tendência em se repelirem por
natureza. Entretanto, quando o meio é suplementado com sais
monovalentes, como o Na+ do NACl, esses íons tem a capacidade de se
ligarem aos fosfatos negativos do arcabouço da molécula de DNA, por
exemplo. O uso do EDTA ajuda na quelação desses íons, como o cálcio.
A ação do EDTA também pode prevenir a ação de enzimas, dependentes
de cofatores, capazes interferir na estabilidade do DNA.
3. pH: A concentração de íons H+ no meio pode interferir
na cinética da hibridização por motivos semelhantes ao dos sais
monovalentes. Um meio mais ácidos, porém não tão ácido (levemente
abaixo do 7), é capaz de neutralizar os fosfatos negativos da estrutura
do DNA, permitindo taxas maiores de hibridização. Um meio levemente
alcalino permite que a sonda e sua molécula alvo interaja de forma
satisfatória, inibindo as interações entre cadeias não alvo. Um meio muito
ácido pode depurinizar ambas as cadeias moleculares, sonda e alvo, e
um meio muito alcalino pode impedir a hibridização entre as cadeias.
4. Tamanho e concentração da sonda: O tamanho da sonda
está intimamente interligada com a temperatura (Tm) e a concentração
de bases G e C. Por exemplo, quanto menor for a sonda, maior será
sua capacidade de discriminar sequências altamente semelhantes,
podendo ser diferida de apenas um par de base. O tamanho da sonda
também influencia na quantidade de energia, temperatura, necessária
para que uma determinada molécula polinucleotídica em dupla cadeia
se dissocie. O conteúdo de bases C e G também estão interligados, já
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 45

que a interação G:C é uma interação que requer uma maior quantidade
de energia para que seja dissociada, por conta das três ligações de
hidrogênio envolvidas nessa interação, tornando cadeias ricas em G:C
termodinamicamente mais estáveis do que A:T. A concentração vai
influenciar na velocidade de hibridização. Quanto maior a concentração
de sondas no meio, maior será a velocidade de hibridização da sonda
e seu alvo. Entretanto, concentrações extrapoladas podem favorecer
interações inespecíficas fora do alvo.
5. Erros fora do alvo (Mismatching): Toda sonda de qualidade,
ao ser comprada, tem sua porcentagem de hibridizações com a fita
alvo, sob condições de alta rigorosidade, formando duplex de cadeias
polinucleotídicas. As implicações de saber os possíveis pareamentos
se traduz num maior rigor representado pelo meio, impedindo que
essas sondas sejam capazes de interagir com qualquer fragmento de
DNA genômico. Um pareamento imperfeito vai diminuir a velocidade
de hibridização do processo e pode acontecer somente om uma única
base nitrogenada. Podendo representar um polimorfismo de uma base
no gene a ser estudado, ou erro ao desenhar a sonda.
6. Formamida e Ureia: A formamida é uma cadeia nitrogenada
capaz de desestabilizar a dupla fita de moléculas polinucleotídicas
através de sua interação nas pontes de hidrogênio formadas entre
os pareamentos entre as bases, reduzindo assim a temperatura de
fusão. Entretanto, essa é uma molécula tóxica e é bastante volátil em
temperaturas necessárias para a hibridização. Para evitar a exposição a
fumaças tóxicas da formamida, a ureia entra como uma via alternativa,
que também possuí a capacidade de desestabilizar as ligações de
hidrogênio entre as bases nitrogenadas, porém em concentrações muito
menores, quando comparada à formamida.

Marcadores
Toda sonda é conjugada a um marcador com função de identificar
ou reportar a presença da sonda, caso esteja ligada à sequência alvo.
O primeiro marcador utilizado era um radioisótopo que se ligava ao
arcabouço da cadeia polinucleotídica. Essa marcação vinha através de
um nucleotídeo marcado com um P radioativo (32P) e era inserido na
46 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

cadeia oligonucleotídica através da técnica de PCR. Esse fosfato era

transferido através de uma reação enzimática da polinucleotídeos-
cinase que transferia um único radioisótopo 32P de uma molécula de ATP
para a extremidade 5’ da nucleotídio. Como apenas um átomo de 32P é
incorporado pela cinase em cada fita de DNA, as moléculas marcadas
não eram suficientemente radioativas para serem utilizadas como
sondas de DNA. Entretanto, novas metodologias são empregadas com
diferentes marcadores quimioluminescente e fluorescentes.
[[Imortante]] Existem três tipos de métodos para marcação:
1. Radiomarcação;
2. Incorporação de hapteno que irá suportar uma molécula não
radioativa quimioluminescente;
3. Marcação enzimática direta.
Essas técnicas são compatíveis para marcação de DNA e RNA
para muitas aplicações.
Dentre os marcadores não radioativos mais comuns, são a biotinili-
zação, marcação com digoxigenina (DIG), marcação com fluoresceína,
marcação direta enzimática e marcação com fluorocromos. A biotina,
DIG e fluoresceína são marcadores cromogênicos, ou seja, geram cores
por quimioluminescência. Os fluorocromos são moléculas que emitem
uma coloração específica ao serem excitadas com um feixe de luz a uma
determinada amplitude de onda, como acontece na Citometria de fluxo. A
seguir, explicaremos como funciona alguns desses marcadores citados.

Síntese de sondas
Além dos variados métodos para marcação descritos, há várias
metodologias que permitem a formação das sondas. Algumas dessas
metodologias serão abordadas a seguir:
1. Reação em Cadeia da Polimerase: PCR é um excelente método
para síntese de sondas, visto que ele é capaz de amplificar/duplicar o
material genético, adicionando novos nucleotídeos que podem ser
marcados de formas diferentes. Marcação por PCR oferece vantagens,
tais como velocidade, versatilidade, eficiência na reação e o fato de
muitos laboratórios estarem realizando PCR rotineiramente. Quando
realizados na presença de nucleotídeos marcados, as sondas são feitas
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 47

de modo que os nucleotídeos ficam presentes durante toda a cadeia

oligonucleotídica e geralmente mostram um alto grau de marcação.
2. Nick Translation: É uma das técnicas mais antigas de criação
de sondas. Em uma molécula de DNA, haverá mini cortes em seu
arcabouço pela proteína DNase I. Esses minis cortes servirão de moldes
para a substituição da cadeia perdida.
3. 5’End-Labeling: Outro método alternativo é a adição de
fosfatos marcados na cadeia da sonda, em sua extremidade 5’. O método
é coloquialmente chamado de reação de cinase, ao transferir o ϒ fosfato
marcado de um ATP para um nucleotídeo contendo uma extremidade
5’ desfosforilada. Essa reação é um excelente método para marcar uma
sonda curta.
4. 3’ End-Labeling: Essa técnica é realizada através da adição
de um nucleotídeo marcado à extremidade 3’ de um nucleotídeo. Essa
reação é catalisada por uma transferase terminal. Uma característica
mais da transferase terminal é que não existe nenhum requisito de
molde, isto é, esta enzima é uma polimerase não dependente do molde.
Consequentemente, qualquer uma de dNTP (ou mistura de dNTP) pode
ser selecionada para adição à extremidade 3 de um polinucleótido.

RNA anti-senso
Durante a etapa da preparação das sondas de RNA, há a
transcrição de fita senso e da anti-senso. A fita de RNA anti-senso é
complementar ao mRNA, sendo assim, capaz de parear com ele. Esse
RNA pode ser utilizado para o estudo transcricional de um gene. Além
dessa habilidade, o RNA anti-senso pode inibir a expressão gênica a
partir da sua interação com o mRNA, formando uma molécula incapaz
de ser traduzida, devido a formação de uma dupla fita de RNA, sendo
esse o cerne do RNA de interferência (iRNA).

SAIBA MAIS:
Quer se aprofundar neste tema? Recomendamos a letua
do artigo: Eletrodos modificados com dna: uma nova
alternativa em eletroanálise, acessível pelo link: https://bit.
ly/2zBiJKo.
48 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial

RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu
mesmo tudinho? Agora, só para termos certeza de
que você realmente entendeu o tema de estudo deste
capítulo, vamos resumir tudo o que vimos. Você deve ter
aprendido sobre os princípios da hibridização de cadeias
oligonucleotídicas a partir do princípio da interação
Watson:Crick, sobre a detecção de DNA a partir de uma
cadeia oligonucleotídica conjugada. Aprendeu também
que essas cadeias estão conjugadas a um composto capaz
de gerar cor, podendo ser um fluorocromo, cromóforo
ou radioisótopo. Compreendeu sobre as estruturas de
uma sonda e quais os tipos de sondas existentes, assim
como suas funções e aplicabilidade. Conheceu sobre os
reagentes necessários para a construção das sondas, e os
tipos de corantes. Viu que existem tipos de hibridização e
pôde conhecer um pouco sobre esses tipos, como DNA:
DNA, DNA:RNA e RNA:RNA. Por fim, aprendeu sobre as
técnicas de biologia molecular que utilizam as sondas
como forma de diagnóstico, entendendo melhor a sua
funcionalidade laboratorial.
 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 49

BIBLIOGRAFIA
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