Citogenética

no Diagnóstico
Laboratorial
Rosalina Guedes Donato Santos

Aula 02
 Diretor Executivo
DAVID LIRA STEPHEN BARROS
Diretora Editorial
ANDRÉA CÉSAR PEDROSA
Projeto Gráfico
MANUELA CÉSAR ARRUDA
Autor
EDUARDO NASCIMENTO DE ARRUDA
Desenvolvedor
CAIO BENTO GOMES DOS SANTOS
Autora
Rosalina Guedes Donato Santos

Olá. Meu nome é Rosalina Guedes Donato Santos. Sou formada

em Biomedicina, com uma experiência técnico-profissional na área
de imunologia, hematologia, toxicologia, análises clínicas de mais
de 12 anos. Passei por empresas com a Faculdade de Ciências e
Tecnologia, UNIFACS, UNIRB, Laboratórios como o Hospital Roberto
Santos, Laboratório José Silveira e Universidade Federal da Bahia. Sou
apaixonado pelo que faço e adoro transmitir minha experiência de vida
àqueles que estão iniciando em suas profissões. Por isso fui convidada
pela Editora Telesapiens a integrar seu elenco de autores independentes.
Estou muito feliz em poder ajudar você nesta fase de muito estudo e
trabalho. Conte comigo!
Iconográficos
Olá. Meu nome é Manuela César de Arruda. Sou a responsável pelo pro-
jeto gráfico de seu material. Esses ícones irão aparecer em sua trilha de
aprendizagem toda vez que:

INTRODUÇÃO: para DEFINIÇÃO: houver

o início do desen- necessidade de
volvimento de uma se apresentar um
nova competência; novo conceito;

NOTA: quando forem IMPORTANTE: as

necessários obser- observações escritas
vações ou comple- tiveram que ser prio-
mentações para o rizadas para você;
seu conhecimento;
EXPLICANDO ME- VOCÊ SABIA? curio-
LHOR: algo precisa sidades e indaga-
ser melhor explica- ções lúdicas sobre o
do ou detalhado; tema em estudo, se
forem necessárias;
SAIBA MAIS: textos, REFLITA: se houver a
referências biblio- necessidade de cha-
gráficas e links para mar a atenção sobre
aprofundamento do algo a ser refletido
seu conhecimento; ou discutido sobre;
ACESSE: se for RESUMINDO:
preciso acessar um quando for preciso
ou mais sites para se fazer um resumo
fazer download, acumulativo das
assistir vídeos, ler últimas abordagens;
textos, ouvir podcast;
ATIVIDADES: quando TESTANDO: quando
alguma atividade o desenvolvimento
de autoaprendiza- de uma compe-
gem for aplicada; tência for conclu-
ído e questões
forem explicadas;
 SUMÁRIO
Técnicas de cultura de tecidos para análise citogenética 10
Biossegurança no laboratório de citogenética 10
Tipos de amostras utilizadas em culturas de tecidos 15
Recepção e identificação das amostras 17
Critérios de rejeição de amostra 20
Tipos de cultura de tecidos 21
Técnicas de bandeamento e coloração cromossômica 24
Fluorocromos 28
Hibridizaçao in situ por fluorescência - FISH 28
Técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese
celular 31
Diagnóstico citogenético nas doenças genéticas 33
Técnica de análise para o auxílio de leucemia mielóide
crônica (LMC) 33
Técnica de análise para o auxílio de leucemia mielóide
aguda (LMA) 35
Técnica de análise para o auxílio de síndrome
mielodisplásica (SMD) 36
Técnica de análise para o auxílio de leucemia linfocítica
aguda (LLA) 36
Técnica de análise para o auxílio de Linfomas 37
Técnica de análise para o auxílio de tumores sólidos 38
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 7

02
UNIDADE
8 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas cresceram os interesses a cerca da biologia
molecular por partes profissionais da saúde, principalmente pela
possibilidade de um diagnóstico mais assertivo nas doenças genéticas.
O avanço nas técnicas moleculares, sobretudo na possibilidade de avaliar
o DNA advindos de materiais biológicos como tecidos, aminiocentese,
biópsia de vilosidades coriônica aumentaram a chance de prever e
diagnosticar as doenças genéticas. Além disso, ferramentas diagnósticas
como a reação de cadeia em polimerase (PCR) despontaram como uma
ajuda no diagnóstico laboratorial, porque essa técnica utiliza quantidade
amostras mínimas, além de ser altamente sensível, específica e possui
alta reprodutibilidade. Essas características foram fundamentais para os
diagnósticos genéticos quanto aos aspectos éticos e legais, uma vez que
o diagnóstico se tornou quase que irrefutável dada a precisão das técnicas
moleculares. Dessa maneira os laboratórios conseguiram uma garantia na
qualidade dos serviços possibilitando que o número de erros laboratoriais
tendesse a zero e os laudos emitidos eram de fácil compreensão para os
indivíduos envolvidos no processo. Entendeu? Ao longo desta unidade
letiva você vai mergulhar neste universo!
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 9

OBJETIVOS
Olá. Seja muito bem-vindo à Unidade 2. Nosso objetivo é auxiliar
você no desenvolvimento das seguintes competências profissionais até
o término desta etapa de estudos:
1. Descrever as técnicas de cultura de tecidos para análise
citogenética;
2. Apontar as técnicas usadas no bandeamento e coloração
cromossômica;
3. Analisar a técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese;
4. Correlacionar as técnicas com o diagnóstico das doenças
genéticas.
Então? Preparado para uma viagem sem volta rumo ao conhecimento?
Ao trabalho!
10 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Técnicas de cultura de tecidos para

análise citogenética
INTRODUÇÃO:
Ao término deste capítulo você será capaz de entender
como ocorre à preparação dos tecidos para a análise,
bem como quais amostras devem ser escolhidas para ter
um melhor desempenho. Isto será fundamental para o
exercício de sua profissão. As pessoas que tentaram realizar
as técnicas da citogenética sem a devida base tiveram
problemas na resolução e no diagnóstico laboratorial das
doenças genéticas. E então? Motivado para desenvolver
esta competência? Então vamos lá. Avante!

Biossegurança no laboratório de
citogenética
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2005) a biosse-
gurança é um conjunto de ações voltadas para: prevenção, minimização
e eliminação de riscos para a saúde, ajuda na proteção do meio ambiente
contra resíduos e na conscientização do profissional da saúde.
Os laboratórios clínicos lidam com situações, atividades e fatores
de risco para os profissionais, os quais podem produzir alterações leves,
moderadas ou graves. Além disso, há possibilidade de causar acidentes
de trabalhos, bem como doenças aos profissionais expostos, sem a
utilização de equipamentos de proteção individual (EPI), pois os líquidos
biológicos e os sólidos manipulados no laboratório clínico, quase sempre
são fonte de infecção. Assim, para evitar processo de contaminação
cruzada dos materiais, deve ter critérios bem estabelecidos quanto à
limpeza dos equipamentos, manuseios de microscópios, treinamento da
equipe de limpeza e cuidado na geração de aerossóis. Esses cuidados
alinhados com o descarte dos materiais fazem parte do conjunto de
boas práticas do laboratório clínico.
Além desses cuidados pré-estabelecidos, outro ponto importante
é a utilização de jalecos. É sabido que o jaleco protege a roupa bem
como a pele do analista clínico da contaminação por sangue, respingos
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 11

de fluidos biológicos, derramamentos de materiais biológicos, que pode

ocorrer desde a coleta de sangue, transporte, manipulação e descarte
do material biológico.
Os laboratórios de citogenética humana devem funcionar com
espaços adequados e seguros para realização dos procedimentos
inerentes à manipulação das amostras, manipulação de substâncias
tóxicas, locais seguros para os equipamentos, locais para estocagem
correta de reagentes, setores administrativos e manter um local seguro
para armazenar as amostras e os laudos dos pacientes.
Para evitar possíveis acidentes ou incidentes toda a equipe
técnica deve ser treinada e a mesma deve ser habilitada para executar
as funções laboratoriais. É de suma importância que o treinamento seja
efetuado antes do início das atividades, o que inclui a verificação de
procedimentos em casos de acidentes ou de contaminação pessoal. O
responsável técnico analista precisa garantir e assegurar que os manuais
estejam disponíveis e acessíveis em locais de fácil acesso e que os
mesmos sejam consultados de forma regular pela equipe técnica.
Uma vez que no laboratório de citogenética se lida com vários
produtos tóxicos, químicos, cáusticos e potencialmente cancerígenos,
os analistas clínicos precisam seguir a risca a utilização de luvas
descartáveis, jalecos, máscaras e a utilização da capela de exaustão para
a manipulação dos produtos químicos bem como do fluxo laminar para
a manipulação de meios de cultura e de amostra biológica, para evitar
contaminação entre o manipulador e a amostra. Além disso, é preciso ter
um manual com as informações a respeito do manuseio, estocagem e
descarte desses produtos.
Assim é importante que o jaleco seja colocado no momento em
que o profissional chega ao laboratório, e o mesmo deve permanecer
com o jaleco durante todo o tempo, à exceção de cantinas, refeitórios,
bancos, bibliotecas, auditórios, nessas áreas deve-se retirar o jaleco
porque não áreas contaminadas e o jaleco pode levar agentes biológicos
para esse local. O pano do jaleco deve ser resistente à penetração de
líquidos, comprimento abaixo do joelho, mangas longas com o punho
em elástico ou com botão, evitar jalecos muito justos ou bordados que
deixem à sua pele descoberta expondo o profissional à riscos biológicos.
12 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Outro ponto importante é a utilização das luvas descartáveis para

a manipulação de materiais potencialmente infectantes. As luvas são
conhecidas como luvas de procedimentos, que são de látex (borracha
natural) ou de material sintético (vinil), estas últimas, além de mais
resistentes aos perfuro cortantes, são também indicadas a pessoas
alérgicas às luvas de borracha natural. As luvas descartáveis devem
ser usadas em todos os procedimentos, desde coleta, transporte,
manipulação até o descarte das amostras biológicas, pois elas são uma
barreira de proteção contra agentes infecciosos. É importante que as
luvas sejam calçadas com cuidado para que não rasguem e que fique
bem aderida a pele, evitando acidentes.
Caso o laboratório lide com materiais biológicos, reagentes e
organismos geneticamente modificados precisam revisitar os manuais
da Vigilância sanitária e a Comissão Nacional Técnica de Biossegurança
(CNTBio) para a verificação dos procedimentos específicos de cada situação.
Figura 1: Biossegurança no laboratório

Fonte: pixabay

Os equipamentos e instrumentos usados no laboratório têm de

passar por uma rotina de limpeza, manutenção e calibração. Além disso,
os manuais e/ou passo a passo devem estar disponíveis na bancada, ao
lado do equipamento para sanar qualquer dúvida durante o processo.
E quanto às amostras e reagentes, deve ser controlado a temperatura.
É importante que as estufas sejam equipadas com alarmes e
indiquem erros na temperatura e condições de CO2.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 13

Quanto aos equipamentos precisa-se que os microscópios

tenham uma resolução adequada para que as análises citogenéticas
sejam feitas de maneiras seguras e corretas, as datas de manutenção
e troca do filtro do fluxo laminar precisam ser registradas e seguidas, e
o tempo de uso lâmpadas UV também precisam ser registradas, pois
possuem vida útil limitada.
As cabines de segurança biológica servem para diminuir os
riscos com os aerossóis, por isso, protege tanto o manipulador quanto à
amostra. Existem três tipos de cabines de segurança biológica:
1. Classe I, o ar que sai passa através de um filtro chamado HEPA
(Hight Efficiency Particulate Air- alta eficiência para partículas de ar) e o
mesmo é eliminado no ambiente livre de partículas contaminadas, esse
tipo de cabine protege o manipulador e o ambiente, porém, não evita a
contaminação do material que está sendo manipulado;
2. Classe II o ar é filtrado por meio dos filtros HEPA, antes de
entrar e antes de sair da cabine, dessa forma consegue proteger o
manipulador, o ambiente e o material, nesses dois tipos de cabines há
abertura frontal;
3. Classe III o ar é estéril, e nesse caso a cabine é completamente
fechada, o que impede a troca de ar com o ambiente e funciona com
pressão negativa, dessa forma oferece total segurança ao manipulador,
ambiente e material e, os materiais a serem manipulados entram e saem
por meio de câmeras de desinfecção.
A cabine de segurança II é um EPC importante nos laboratórios
de saúde pública, unidades hemoterápicas e de citogenética. É crucial
que a cabine esteja funcionando no mínimo 30 minutos antes do início
do trabalho e após o término do trabalho ligar por mais 30 minutos para
o processo de limpeza, descontaminação e desinfecção principalmente
nas paredes laterais e internas da superfície de trabalho.
Para minimizar os riscos de contaminação preconiza-se que os
materiais de culturas de células sejam adicionados em locais diferentes
de culturas de bactérias e/ou vírus.
E por fim deve-se reservar uma área protegida da luz, para a
realização de técnicas moleculares (FISH, CGH etc).
14 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Figura 2: Tipos de cabines biológicas

Fonte: pixabay

Ademais, deve-se incluir no manual de boas práticas laboratoriais

cuidados pessoais, a saber, o vestuário deve ser composto por calças
compridas sem rasgos, sapatos fechados e nesse caso não pode a utilização
de sapatilhas, o material do calçado não pode ser poroso e resistente para
impedir lesões no caso de acidente com perfuro cortante ou substância
química, cabelos compridos devem permanecer presos ou com gorros
para evitar contato com o material manipulado, evitar o uso de lentes de
contato no ambiente laboratorial, pois, podem fixar agentes infecciosos
na mucosa ocular, as unhas devem ser curtas e as mesmas não devem
ultrapassar as pontas dos dedos, deve-se evitar a utilização de maquiagem,
pois, as mesmas facilitam a aderência de agentes infecciosos na pele, o uso
de jóias e bijuterias deve ser evitado, em especial aquelas que possuem
espaços vazios, pois podem ser depósitos de agentes infecciosos.
Além disso, o analista clínico deve estar com a carteira de vacinação
em dia, haja vista que o risco é duas vezes maior de adquirir qualquer
doença em relação à população. As vacinas recomendadas são hepatites
A e B, tétano, difteria, (dupla tipo adulto), tétano, difteria e coqueluche
(tríplice bacteriana adulta), varicela (catapora), influenza (gripe), meningite
C, sarampo, caxumba e rubéola.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 15

Outros cuidados importantes que se deve ter no laboratório são

relacionados à comida e bebida, nesse sentido deve-se evitar comer, beber,
utilizar geladeiras, freezers para guardar sucos e ou refrigerantes, estufas
de secagem para esquentar o alimento ou estantes para acondicionar
alimentos. Devem-se evitar brincadeiras, distrações com fones de ouvido
ou a utilização de celulares bem como conversas paralelas durante os
procedimentos laboratoriais, pois essas desatenções podem causar
acidentes graves, e deve ser lembrado que a responsabilidade do resultado
é do profissional analista clínico, e caso o mesmo libere um resultado errado
o mesmo sofrerá sanções na justiça bem como do Conselho.

Tipos de amostras utilizadas em culturas

de tecidos
Segundo a RDC N° 55, DE 11 DE DEZEMBRO DE 2015 são consi-
deradas amostras biológicas sangue, fragmentos de tecidos, esfregaços,
lavados, entre outros, provenientes de doadores, receptores ou de
tecidos retirados.
Para que haja a escolha do tecido depende do paciente, por
exemplo, pré ou pós-natal, qual o motivo do diagnóstico, se é de origem
constitucional ou adquirido e por fim, qual a indicação clínica do exame.
Caso o diagnóstico seja pré-natal os tecidos mais utilizados são as
células do líquido amniótico (LA), vilosidades coriônicas e os linfócitos de
sangue total, de preferência as amostras devem ser nessa ordem conforme
figura 03. Ademais, outros fatores são importantes na escolha do tecido
como idade gestacional, bem como se o diagnóstico é de importância
primária ou secundária e se haverá necessidade de realização de outros
testes genéticos moleculares e genéticos. Além desses tecidos podem
ser usados tecidos fetais como placenta, pele, pulmão, líquido ascítico
ou renal, também podem ser utilizados para a avaliação citogenética em
casos de indicação terapêutica ou término da gestação.
Os componentes do líquido amniótico estão em suspensão e
dissolução. Os elementos em suspensão são as células esfoliadas no
âmnio, principalmente do feto, lanugem e gotículas de gordura. E os
elementos de dissolução são as substâncias orgânicas e inorgânicas, os
16 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

inorgânicos são representados por pelos eletrólitos e os orgânicos são

as proteínas, aminoácidos, alfa-fetoproteína, substâncias nitrogenadas
não protéicas, lipídeos, carboidratos, vitaminas e enzimas. A análise do
líquido é preconiza danos casos de doenças congênitas, defeitos no tubo
neuronal, idade gestacional e maturidade fetal pulonar, principalmente
em mulheres acima de 35 anos devido à probabilidade de anormalidades
cromossômicas fetais.
Em caso de pacientes neonatos ou adultos, deve ser utilizado para
o diagnóstico cromossômico constitucional o sangue periférico. Sabe-
se que a heparina e o heme inibem a reação de cadeia em polimerase
(PCR), por isso o anticoagulante recomendado para a obtenção da
amostra é o EDTA (ácido etilenodiaminotetracético). No caso de análises
moleculares e avaliação do RNA intracelular é recomendado que a coleta
seja feita em um aditivo para estabilização de RNA ou colocado em um
aditivo para a estabilização do RNA, além disso, deve ser respeitada
a recomendação do fabricante quanto ao volume de amostra e a
quantidade de sangue. A estabilidade do sangue total pode ocorrer na
temperatura ambiente por 24 horas para análise de DNA e até oito dias,
quando resfriado (2-8oC). Para análise de RNA celular, o sangue deve ser
coletado com aditivo estabilizador, pois o RNA se degrada de maneira
rápida. A coleta e armazenamento de sangue total sem estabilizador não
são recomendados para análise de transcrição genética, em função da
indução e da degradação de RNA que ocorre ex vivo.
Para as alterações referentes às anormalidades cromossômicas
adquiridas, é utilizada a medula óssea, ou em casos de tumores sólidos
biópsia do próprio tumor. Devem-se ter alguns cuidados para a obtenção
da medula óssea, a saber, a coleta deve ser feita com uma seringa já
contendo EDTA e a equipe do laboratório deve estar a postos para
processar o material assim que a coleta chegue ao laboratório. Importante
seguir os critérios para a extração de DNA, no qual o aspirado de medula
óssea só pode ser armazenado por até 72 horas de 2-8oC antes do
processamento. Caso seja necessário armazenar por tempo superior a
esse, devem-se remover os eritrócitos e congelar a amostra a -20oC (por
meses), nesse processamento deve-se evitar a hemólise do material, pois
a liberação do heme inibe a reação de cadeia em polimerase (PCR).
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 17

No caso da extração do RNA, o aspirado de medula óssea deve

ser coletado em seringa contendo EDTA, e após a coleta adicionar o
mais rápido possível a solução estabilizadora do RNA, quando não for
possível a amostra deve ser transportada com gelo triturado e a extração
deve ocorrer até no máximo 04 horas após a coleta, e é importante que a
amostra não deve ser coletada antes da retirada dos eritrócitos.
Entretanto, nem sempre é possível a utilização de amostras de
sangue, nesses casos devem ser usadas amostras advindas de um tecido.
Geralmente, 1 a 2g de tecidos devem ser obtidos para que se tenha uma
boa quantidade de células. Tecidos não gordurosos acima de 10mg
fornecem uma cerca de 10 ug de DNA ou RNA, entretanto para cada
protocolo estabelecido no laboratório verifique a quantidade de material
desejado para a realização da técnica. A estabilidade depende do tipo de
tecido, entretanto o acondicionamento não pode ser feito à temperatura
ambiente, o ideal é congelar o tecido em nitrogênio líquido ou em solução
de preservação de ácidos nucléicos ou quando não for possível esse tipo
de acondicionamento colocar a amostra de tecido em banho de gelo e
transportar. Em amostras pequenas, devem-se embrulhar as mesmas
embebidas em salina, a fim de evitar o ressecamento da amostra e
adicionar a solução de preservação dos ácidos nucléicos.
A maioria dos tecidos usados para o diagnóstico citogenético não
possui um número significativo de mitoses espontâneas, daí a necessidade
de realização de culturas para a preparação dos cromossomos. Por isso,
as técnicas de tecidos têm se tornado um suporte importante na pesquisa
cromossômica.

Recepção e identificação das amostras

As etapas dentro de um laboratório clínico correspondem à fase
pré-analítica, analítica e pós-analítica. O laboratório tem por obrigação
liberar resultados confiáveis para auxiliar no diagnóstico e tratamento das
doenças. Os erros inerentes às fases pré e pós analíticas compreendem
cerca de 93%.
A fase pré-analítica corresponde a todos os processos referentes
à a qualidade da mostra antes do processamento laboratorial, a saber,
requisição de exames inapropriados, coleta de amostra inadequada, mal
18 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

acondicionamento da amostra, letra ilegível na requisição, entre outros.

Embora esses pontos não estejam dentro da competência do laboratório,
os mesmos precisam estabelecer critérios de recebimento e rejeição das
amostras, pois a credibilidade do profissional e do laboratório dependem
disso. Além dessas informações, é de fundamental importância a análise
e liberação do laudo.
Assim, é de fundamental importância que o laboratório monitore o
transporte de amostra seguindo os procedimentos operacionais padrão
(POP) quanto ao período de tempo de acondicionamento para o exame
solicitado, utilização dos conservantes necessários para cada amostra
biológica coletada e assegurar critérios regulatórios de registro para o
recebimento das amostras quer sejam nacionais, regionais ou locais. Caso
haja o recebimento de amostras comprometidas, um relatório final deve
descrever de forma minuciosa a natureza do problema, e se aplicável o
cuidado requerido quando á liberação e interpretação do resultado.
Segundo a Agência de Vigilância em Saúde (2005), a amostra do
paciente deve ser transportada e preservada em recipiente isotérmico, e
quando requerido, higienizável, impermeável, garantindo a estabilidade da
amostra desde a coleta até a fase de processamento do exame. A maleta
deve conter o símbolo de risco Biológico, com os dizeres Espécimes
Diagnósticas e com o nome do laboratório responsável pelo envio.
A identificação da amostra primária é iniciada a partir da identifi-
cação do paciente hospitalar ou ambulatorial. A partir desse momento,
deve-se criar um vínculo entre o paciente, amostra coletada, profissional
que realizou a coleta do procedimento, para que haja a rastreabilidade
do processo.
Além desses fatores, deve-se levar em consideração o posicio-
namento da amostra primária, uma vez que o posicionamento inade-
quado pode derramar a amostra ou formar coágulos, evitar a exposição
à luz e a altas temperaturas, evitar excessiva agitação já que pode causar
hemólise, especialmente em amostras de sangue.
As solicitações dos formulários e ou requisições não devem ser
colocadas em torno dos tubos, pois podem danificar, antes devem ser
colocadas em separado, e de preferência dentro de envelopes impermeáveis.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 19

No caso de substâncias líquidas, o recipiente primário e secundário

deve ser a prova de vazamento. Além disso, deve ser colocado um material
absorvente entre o recipiente primário e secundário para não comprometer
o material. O recipiente primário ou embalagem secundária deve ser capaz
de suportar, sem vazamento, uma pressão interna de 95kPa.
Figura 3: Tipo de acondicionamento com recipiente primário e secundário

Fonte: http://bit.ly/2TckKrI

Contudo hoje já podem ser encontrados no mercado dispositivos

capazes de registrar a temperatura e o tempo em intervalos pré
determinados, a exemplo do TempStick®, outros que validam apenas
o transporte como o Mission Starter e o System Manager que avalia
as condições de transporte, sendo permitida a visualização da leitura
e da validação dos dados registrados pelo TempStick® durante um
determinado transporte.
As amostras encaminhadas para o laboratório de citogenética
precisam ser registradas e devem receber um código de identificação
único que as acompanhará por todas as etapas do processo de análise,
esse código é de fundamental importância porque torna a amostra
rastreável em qualquer etapa do processo o que facilita na hora de
tomadas de decisões ou tirar quaisquer dúvidas que surjam no processo
do exame. Os códigos gerados devem distinguir indivíduos da mesma
família ou diferentes amostras coletadas do mesmo indivíduo.
20 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Todas as amostras devem vir acompanhadas de um formulário

de requisição de exame com os dados preenchidos a cerca de nome do
paciente, código de registro do laboratório, data de nascimento, idade,
sexo do paciente, data e hora da colheita do material, tipo de amostra
(a exemplo de sangue periférico, medula óssea, líquido amniótico, etc.),
profissional que solicitou a realização do exame, indicação do exame,
informações clínicas quanto à realização do exame, história familiar
(quando necessário) e profissional que realizou a coleta do material.

Critérios de rejeição de amostra

Os critérios de aceita/rejeição de amostras devem ser
estabelecidos pelo laboratório. As amostras têm de ser rejeitadas quando
não atenderem as normas estabelecidas pelo laboratório, incluindo
aqueles relacionados com as condições ideias de armazenamento da
amostra, temperatura, acondicionamento e transporte.
Pode-se citar como exemplo de critérios de rejeição dados
de identificação incorretos ou incompletos dos pacientes, e volume
insuficiente de amostra. Nesses casos, o laboratório deve entrar em
contato com o serviço ou com o médico responsável para comunicar
a inadequação da amostra coletada e enviada e discutir a possibilidade
de uma recoleta, bem como informar as chances de sucesso envolvidas
no procedimento.
Além desses fatores, devem ser observados a relação anticoa-
gulante sangue, armazenamento da amostra, mostra hemolisada,
coagulada, tubos quebrados ou com vazamentos, caso as amostras
recebidas estejam parcialmente hemolisadas ou parcialmente coagula-
das serão processadas com caráter restritivo para a interpretação
laboratorial, nesse caso deve ser informado por e-mail ou telefone para
o paciente sobre a possibilidade de recoleta.
O ideal é que amostras de sangue total sejam enviadas no
tubo primário e não alíquotas para a realização dos exames. O ideal é
que amostra não seja manipulada fora do ambiente estéril. Amostras
enviadas com seringas para o laboratório de citogenética, a exemplo do
líquido amniótico e vilocorial, devem estar acondicionadas em seringas
sem o bico (borracha preta) e com êmbolo e agulha imobilizados.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 21

As amostras em espera para cadastro são aquelas em que há

ausência de dados como nome do laboratório ou médico solicitante,
nome do paciente, cadastro incompleto do nome completo do exame
solicitado, informações sobre a data da coleta do material, descrição do
material enviado (sangue total, líquido amniótico, tecido, entre outros tipos
de amostras), envio de exames sem o preenchimento do formulário correto
bem como sem a assinatura do termo de consentimento. E caso tenha um
exame para a pesquisa de mutação pontual, a mutação encontrada no
caso – índice (primeira pessoa a ser investigada) deve ser especificada no
relatório médico ou no pedido e quando possível enviar uma cópia.

SAIBA MAIS:
Para entender a cerca dos critérios usados para a coleta,
transporte e armazenamento de amostra em biologia
molecular leia o artigo: Coleta, transporte e armazenamento
de amostras para diagnóstico molecular, disponível em:
https://bit.ly/2ls9XLd

Tipos de cultura de tecidos

O sangue é o tecido mais utilizado nas culturas dado a facilidade
de obtenção, bem como facilidade no cultivo. A coleta deve ser feita
com uma seringa estéril, com heparina e em casos de adultos coletar
um volume aproximado de 10 mL e em crianças em torno de 5mL , sendo
menor ainda para neonatos ou cordão umbilical com volume de 1 a 2 mL.
O sangue do cordão umbilical deve ser coletado por um médico
obstetra depois da vigésima semana de gestação, com o auxílio do
ultrassom. A indicação para essa coleta pode ser a ausência de líquido
amniótico (material mais apropriado para detecção de anormalidades
cromossômicas), devido a alguma malformação fetal detectado mais
tardiamente na gestação ou suspeita de cromossomopatia, ou mesmo
para confirmação de um cariótipo duvidoso em líquido amniótico.
Importante ressaltar que para o lançamento na cultura, pingam-
se de 8 a 10 gotas de sangue total em 5 mL de meio de cultura (dentro
da capela de fluxo laminar devidamente asséptica), deixado a 37°C na
estufa, em cultura fechada ou aberta, por 72 horas. O meio de cultura
22 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

mais usado é o RPMI para manter as células viáveis no meio de cultivo.

Após são feitas as lâminas e a análise microscópica dos cromossomos.
A medula óssea também pode ser usada, porém a cultura
usando esse material dura apenas 24 horas. Devido a alta taxa de
proliferação celular as desvantagens dessa técnica são baixo índice
mitótico, morfologia de baixa qualidade dos cromossomos, uma vez
que se apresentam mais condensados e curtos, o que dificulta a análise.
Entretanto, na tentativa de melhorar a análise do material os laboratórios
usam mais de um protocolo para terem sucesso no exame. No primeiro
protocolo é feita a cultura e adicionada a colchicina, uma substância
que inibe a polimerização das proteínas do fuso mitótico e para a
divisão celular na metáfase, após realizar o protocolo de coloração
(bandeamento GTG).
O segundo protocolo estabelecido é a utilização do meio de cultura
específico para a medula óssea (Marrow Max – GIBCO), após suspender
as células do sobrenadante e incubar de 24 a 48 horas e acrescentar 0.1
mL de colchicina de 40 a 50 minutos. Centrifugar o material a 800 rpm por
8 minutos, retirar o sobrenadante, seguido de hipotonia com Kcl , fixação
do material e coloração com bandeamento GTC.
O líquido amniótico é usado após a retirada por meio da
aminiocentese, as células fetais estão flutuando neste líquido, e por
isso podem ser realizadas análises bioquímicas, moleculares ou
cromossômicas. Importante ressaltar que após a coleta o material deve
ser transportando para o laboratório na própria seringa em temperatura
ambiente. Ao chegar no laboratório o líquido deve ser transferido para
dois tubos cônicos e centrifugados a 1500 rpm por 08 minutos. Após
o sobrenadante é retirado e guardados no freezer para uma análise
posterior. Ao pellet dos tubos são adicionados 4 mL de meios de cultivo,
Amniomax, transferidos em frasco de cultura e incubados na estufa de
CO2. O restante do procedimento, ou seja, hipotonia, fixação, preparação
de lâminas e coloração, é semelhante ao do sangue.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 23

Figura 4: Aminiocentese: coleta do líquido amniótico

Fonte: http://bit.ly/2TdCmDh

A biópsia de vilosidades coriônicas deve ser coletada com meio

de cultura (RPMI 1.640, ou HAM F-10, ou Amniomax) já inserido na própria
agulha, essa coleta é feita por meio de um médico. A lavagem das
vilosidades é feita com qualquer meio de cultura ou cloreto de sódio.
O cultivo deve ser feito apenas do material fetal. As vilosidades são
formações esbranquiçadas e ramificadas que ficam ao redor da placenta,
e se assemelham a árvores brancas. A dissecação das vilosidades deve
ser realizada sob microscópio invertido, de preferência dentro da capela
de fluxo laminar e de maneira estéril.
Após a separação e limpeza, as vilosidades devem passar
por dois procedimentos, o direto que consiste na separação de 3 ou
4 vilocoriônicos, transferência para uma placa de petri com 3 mL de
meio de cultivo ( Amniomax). Após adicionar 0,1mL de colchicina numa
concentração de 10 ug/mL, colocar por 02 a 03 horas na estufa de CO2.
Após devem ser feitas a preparação, coloração e análise das lâminas.
24 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu
mesmo tudinho? Agora, só para termos certeza de que
você realmente entendeu o tema de estudo desses
capítulos, vamos resumir tudo o que vimos. Você deve
ter aprendido que a biossegurança é de fundamental
importância para a manipulação das amostras, bem como
para a segurança do analista para evitar contaminação.
Além disso, foi visto que as amostras usadas nas técnicas
de citogenética compreendem desde sangue até tecidos
ou líquido amniótico, entre outras. No entanto, o mais
importante na escolha desses materiais é a identificação
do motivo do exame, pois, cada amostra biológica tem
uma especificidade e sensibilidade diferente. Ademais, é
mandatório que cada laboratório estabeleça os protocolos
de recepção e de rejeição de amostra, uma vez que o
sucesso do diagnóstico depende desses fatores. E, um
dos pontos mais relevantes é a utilização de meios de
cultivo para manter a viabilidade das células, uma vez que
o estudo do cromossomo é baseado na integridade celular
após a cultura de célula.

Técnicas de bandeamento e coloração

cromossômica
Até meados dos aos 70, a coloração usada para a verificação
dos cromossomos eram Giemsa e a orceína, ambas tinham afinidade
por cromatina e coravam de forma uniforme. No entanto, com esse tipo
de coloração, eram caracterizadas apenas as aneuplodias, e as outras
alterações cromossômicas eram difíceis de identificar. A fim de melhorar
o diagnóstico, foram implementadas no laboratório várias técnicas de
bandeamento e coloração. Essas técnicas foram divididas em duas
classes, a primeira está relacionada com as bandas ou faixas ao longo
de toda a extensão do cromossomo (bandas Q, G e R) e a outra se refere
a marcação de regiões específicas de alguns cromossomos (bandas C,
RON,T,G-11, Cd coradas com DAPI/DA).
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 25

Corantes como orceína e giemsa são usados porque ambos

têm afinidade pelo DNA, fluorescem sob a luz ultravioleta, e após o
tratamento é possível verificar zonas brilhantes e escuras ou bandas que
são específicas para o tamanho e localização do cromossomo, e dessa
maneira era possível identificar as aneuplodias (alterações numéricas).
Estas técnicas permitem a identificação exata de cada elemento do par
cromossômico, além da detecção das aberrações estruturais, o que
possibilita a análise de todo o cariótipo humano.
O primeiro método de marcação foi o bandeamento Q, que
consiste na utilização de fluorocromos. Essa técnica é usada para estudar
os polimorfismos, bem como detectar a presença de material genético
no cromossomo Y. Entretanto, as desvantagens desse método de
bandeamento é o decaimento da fluorescência, o que diminui a eficácia
da análise, por isso é recomendado realizar a preparação e análise das
lâminas no ambiente escuro e com a utilização de fluorescência.
O bandeamento G ou bandeamento de Giemsa é uma técnica usada
em citogenética para produzir um cariótipo visível por meio da coloração de
cromossomos condensados. Essa técnica é útil na identificação de doenças
genéticas através da representação fotográfica de todo o complemento
do cromossomo. As vantagens desse ensaio são o custo baixo, além da
durabilidade das bandas coradas nas lâminas preparadas.
Figura 5: Bandeamento G

Fonte: http://bit.ly/37XNIzH

No bandeamento R, as bandas reversas têm um padrão de

marcação cromossômica oposto ao produzido pelas bandas Q e G, ou
seja, as bandas fluorescentes e escuras possuem maior afinidade por
26 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

regiões ricas em bases CG, e as bandas opacas e claras têm afinidade

pelas bases AT. A preparação da lâmina se dá por meio de altas
temperaturas e com a utilização de tampões, seguidos pela coloração
de acridina laranja.

DEFINIÇÃO:
O bandeamento C é uma técnica responsável por corar
de maneira específica a heterocromatina constitutiva (HC),
localizada ao redor dos centrômeros.

No cariótipo humano, além disso, marca regiões polimórficas

pericentroméricas dos cromossomos 1, 9 e 16 e a porção distal do
braço longo do cromossomo Y. Essa técnica é usada para detectar a
presença de cromossomos dicêntricos (cromossomos que possuem
dois centrômeros) ou pseudodicêntricos, e ainda podem servir como
marcadores na identifcação de linhagem ou doador em caso de
transplante de medula, neoplasias e variantes pleomórficas.
O bandeamento C permite a observação da heterocromatina
constitutiva, para isso são necessárias 04 etapas: preparação e
envelhecimento das lâminas, hidrólise, lavagem, desnaturação, hidrólise,
lavagem, renaturação e avaliação do DNA. O envelhecimento deve ser
feito a partir da digestão enzimática por 02 dias à temperatura ambiente.
A hidrólise deve ser feita mergulhando as lâminas em um recipiente de
ácido acético a 45% em banho-maria, pré-aquecido por 10 minutos.
Após isso, deve colocar o ácido acético em outro recipiente para
posterior uso, e após as lâminas devem ser lavadas em água de torneira
corrente durante 01 minuto e após as mesmas devem ser secadas com o
auxílio de uma bomba de ar, a desnaturação deve ser feita mergulhando
as lâminas numa solução saturada de hidróxido de bário à temperatura
ambiente por 10 minutos. Após lave com a água da torneira até retirar
o excesso dos cristais do hidróxido de bário e adicione a solução de
ácido acético 45%, depois seque as lâminas, transfira para um jarro de
Coplin e adicione uma solução de 2X de SSC (cloreto de sódio isotônico)
pré-aquecido a 60oC. Imediatamente em seguida, coloque o jarro em
banho-maria durante 80 minutos.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 27

A técnica de bandeamento RON cora as regiões organizadoras de

nucléolos (RON), as quais estão localizadas na constricção secundária
dos cromossomos humanos com satélites (Grupos D e G). Essa técnica
pode ser usada na identificação dos dromossomos marcados e na
detecção dos rearranjos ou polimorfismos envolvendo cromossomos
acrocêntricos. Uma aplicação clínica seria na identificação de trissomias.
A coloração de RON deve ser feita usando os seguintes passos:
preparação da lâmina, colocar as lâminas na estufa durante 03 horas
na temperatura de 40oC, após adicionar nas lâminas a solução de SSC
aquecida a 60oc durante 10 minutos. Lavar com água destilada e após
fazer uma câmera úmida e colocar na estufa entre 70 e 80oC, adicionar
uma gota da solução de nitrato de prata sobre a lâmina, cobrir com
lamínula e levar até a câmera úmida previamente aquecida. Espere por
02 minutos e leve ao microscópio para verificar se o material foi corado,
lave e retire a lamínula. Seque a lâmina e para montar adicione bálsamo
do Canadá e analise os RONS dos cinetócoros e centríolos adjuntos.
O bandeamento T avalia as bandas T (telomerebanding), repre-
sentam um subconjunto das bandas R e marcam somente as porções
cromossômicas terminais ou dos telômero.

REFLITA:
É importante refletir sobre a utilização das técnicas de
bandeamento para análise dos cromossomos. Para um
correto diagnóstico, sempre avalie a causa da solicitação
médica, quais cromossomos poderiam estar envolvidos no
processo, pois dessa maneira escolherá a melhor técnica,
bem como o melhor marcador para o teste.

Diversos cromossomos são constituídos ou organizados de

maneiras diferentes, por isso podem ser corados de maneira diferencial.
Os segmentos diferenciais geralmente estão restritos a uma determinada
região do cromossomo, formando o que chamamos de bandas. A
presença dessas bandas permite caracterizar o cromossomo, bem
como identificar regiões homólogas.
28 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Fluorocromos
Os fluorocromos são corantes fluorescentes, que emitem luz após
excitação luminosa. Na citogenética são usados por apresentarem afinidade
pelos pares de bases AT ou GC, produzindo um padrão fluorescente
característico. Para melhorar a coloração podem ser usados dois corantes,
por isso chamamos de dupla marcação. Nesses procedimentos, a
fluorescência emitida pelo fluorocromo examina os cromossomos, e esse
corante é chamado de primário, enquanto que o outro corante usado se liga
ao DNA. Esse segundo corante pode ser fluorescente ou não. Os principais
fluorocromos utilizados nestas técnicas de coloração são:
1. DAPI – 4, 6-Diamino-2-Phenole-Indole (afinidade por bases AT);
2. Hoechst 33258 – 2-[4-hidrox yphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,
5 bi-1 H-benzimidazole (bases AT);
3. Quinacrina (bases GC);
4. CMA3 – Cromomicina A3 (ba- ses GC);
5. Olivomicina (bases GC), entre outros.
As combinações de corante primário e contra-corante são
baseadas em suas afinidades pelas bases de DNA:
„ corante primário específico – AT e contra‐corante também
específico – AT;
„ corante primário específico – AT e contra‐corante específico – GC;
„ corante primário específico – GC e contra‐corante específico – AT.

ACESSE:
Para entender melhor a cerca das colorações usadas na
citogenética leia texto Como observar cromossomo: Um
guia de técnicas em citogenética vegetal, animal e humana,
disponível em: https://bit.ly/2lr84hH

Hibridizaçao in situ por fluorescência - FISH

A técnica de FISH (hibridização in situ por fluorescência) se baseia
na ligação das sequência de DNA marcadas com fluorocromos (sondas)
aos genes ou cromossomos alvo complementares.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 29

A sonda é uma sequência de oligonucleotídeos complementares

e específicos. A marcação com as sondas pode ser direta ou indireta.
Na marcação direta, um ou mais fluorocromos são ligados às sondas
que se ligarão nas regiões 5’ ou 3’ da molécula alvo. A marcação indireta
ocorre quando se liga a molécula de digoxigenina à sonda e só após
há a ligação do anticorpo conjugado com o fluorocromo, nesse tipo de
teste há o aumento da sensibilidade da técnica.
A técnica de hibridização in situ (FISH) é um método histoquímico
que auxilia na visualização, identificação, enumeração e localização dos
agentes patogênicos in situ, sem a necessidade de culturas celulares.
Além disso, essa técnica permite a avaliação de ácidos nucléicos e dessa
forma pode-se avaliar a genética e correlacionar com alterações celulares.
As etapas da técnica compreendem quatro procedimentos, são
eles fixação e permeabilização da amostra, hibridização, lavagem para a
retirada das sondas em excesso e avaliação do material por meio de um
microscópio fluorescente.
Figura 6: Etapas do FISH

Fonte: http://bit.ly/309F9Pw
30 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

A marcação cromossomo-específica é visualizada por meio dos

pontos fluorescentes de uma ou várias cores diferentes, a depender
da quantidade de fluorocromos usados no processo. As sondas mais
usadas na técnica de FISH são oligonucleotídeos entre 15 e 30 bases
com única molécula fluorescente ligada covalentemente ao 5’ terminal.
Os fluorocromos mais usados na rotina são fluoresceína (FITC), derivados
de rodamina e os fluocromos de cianina Cy3 e Cy5.
Apesar dessa técnica ser de alta sensibilidade e especificidade,
podem ocorrer resultados falsos positivos quando as substâncias
analisadas emitirem autofluorescência, a exemplo de tecidos que
contenham alta quantidade de elastina e colágeno, bem como eritrócitos
e eosinófilos. Resultados falsos-negativos podem ocorrer quando houver
penetração insuficiente da sonda no interior do material analisado.
A nomenclatura para a técnica de FISH deve indicar a sonda
utilizada, o cromossomo e a banda correspondentes a ela, bem como o
número de cópias de marcações observadas com a sonda. Se for realizada
também a citogenética convencional, o resultado deve ser colocado em
primeiro lugar, seguido por um ponto (.), e a nomenclatura resultante da
FISH deve ser indicada pela abreviatura ish, um espaço e o resultado da
hibridização. Por exemplo, cariótipo 46, XX.ish 22q11.2 ( D22S75 X 2), esse
resultado indica carótipo normal feminino e, por FISH, foi utilizado a sonda
D22S75 (a região 22q11.1 é responsável pela sídrome de DiGeorge), e nesse
teste a mesma apresentou padrões de normalidade.

SAIBA MAIS:
Estude sobre as doenças genéticas e como o laboratório
de citogenética pode auxiliar no diagnóstico, leia o artigo:
Genética médica para não especialistas: O reconhecimento
de sinais e sintomas, disponível em: https://bit.ly/2ko1qIV
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 31

Técnica de micronúcleos com bloqueio da

citocinese celular
A avaliação da frequência de micronúcleos (MNs) é um
ensaio usado na determinação da presença e da extensão do dano
cromossômico em populações expostas a agentes genotóxicos, exemplo
organofosforados, pesticidas, ou ainda avalia susceptibilidade genética.
Além disso, esse teste também pode ser usado na identificação de dietas
e fatores genéticos. Assim, esse teste é capaz de detectar os agentes
genotóxicosclastogênicos( promotores de quebras cromossômicas) e os
interferentes da formação do fuso mitótico.
O ensaio de micronúcleo com bloqueio da citocinese (CB-MN) pode
ser usado para avaliar os efeitos genotóxicos e citotóxicos de espécies
reativas de oxigênio, tais como peróxido de hidrogênio, superóxido,
neutrófilos ativados e/ou radiação ionizante.
A técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese (CBMN)
avalia os micronúcleos em culturas humanas. Além do sangue, também
podem ser usadas células epiteliais esfoliadas, células mononucleares do
sangue periférico e eritrócitos. A escolha da amostra biológica deve ser feita
a partir dos estudos a cerca do mecanismo de ação do agente estudado.
Os micronúcleos são produzidos durante o processo de divisão
celular, na etapa da telófase, quando o envelope nuclear é reconstituído
ao redor dos cromossomos das células filhas. São formados por
fragmentos cromossômicos acêntricos ou cromossomos inteiros que
são perdidos durante a divisão nuclear, e por isso, foram excluídos do
núcleo principal das células filhas. Assim, a detecção de micronúcleos
representa perda de cromatina devido ao dano cromossômico estrutural
no aparelho mitótico, somente na fase da mitose. Assim, os micronúcleos
contêm fragmentos cromossômicos resultantes da quebra de DNA,
replicação do molde de DNA danificado e inibição da síntese da DNA.
O teste in vitro consiste na utilização da citocalasina B, uma
substância responsável por inibir a polimerização da proteína actina,
requerida para a formação de anel de microfilamentos, responsável por
induzir a contração do citoplasma e divisão da células em duas células
filhas, fenômeno chamado de citocinese. Assim, o resultado é o acúmulo
de células binucleadas a partir de células que passaram por apenas um
ciclo de divisão nuclear. Ver figura 09.
32 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Figura 7: Micronúcleo em célula binucleada

Fonte: http://bit.ly/306yky2

Os critérios estabelecidos para realizar o teste de micronúcleo

são binucleação, apresentação de dois núcleos em célula binucleada,
membranas nucleares intactas e situadas dentro do mesmo limite
citoplasmático, os dois núcleos da célula binucleada devem ser
proporcionalmente iguais em tamanho e intensidade da coloração, união
de uma fina ponte nucleoplasmática entre os dois núcleos da célula e
ausência de sobreposição.
Os fatores que podem influenciar na frequência de micronúcleos são
idade, provavelmente devido ao aumento de mutações em decorrência
do acúmulo de DNA não reparado ou à diminuição da capacidade de
reparação dos danos celulares, tabagismo, pois estudos têm mostrado
que o fumo altera a frequência de mutações, atividade física que quando
em excesso pode gerar altos níveis de estresse oxidativo, podendo
acarretar danos ao DNA e peroxidação lipídica.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 33

RESUMINDO:
A evolução das técnicas de citogenética contribuiu muito
para a acurácia do diagnóstico das doenças genéticas.
A escolha do ensaio depende dos objetivos desejados
bem como dos recursos disponíveis no laboratório, assim
também como a escolha do corante. Alguns corantes
permitem visualizar simultaneamente os cromossomos
e os nucléolos, enquanto outros coram apenas os
cromossomos, porém com maior nitidez e contraste.
Quando os cromossomos são grandes, a coloração com
orceína pode ser mais adequada, por ser mais simples e
permitir uma observação rápida e direta dos cromossomos.
Quando os cromossomos são muito pequenos, deve ser
utilizado o corante de Giemsa, que garante uma coloração
mais intensa e melhor contrastada. Além dessas técnicas
convencionais, pode-se utilizar as técnicas moleculares,
a exemplo de Hibridização in situ na qual são utilizadas
sondas marcadas com fluorocromos que se ligam ao DNA
ou ainda pode-se usar o ensaio de micronúcleos para
avaliar a presença e extensão do dano cromossômico.

Diagnóstico citogenético nas doenças

genéticas
No laboratório clínico de forma rotineira são usadas várias técnicas
de análise cromossômicas para o auxílio de doenças como a leucemia
mieloide crônica, síndrome mielodisplásica, leucemia linfócítica aguda e
crônica, linfomas e tumores sólidos.

Técnica de análise para o auxílio de

leucemia mielóide crônica (LMC)
A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa
clonal na qual o paciente apresenta fraqueza, cansaço, indisposição, dor
abdominal, aumento de volume do abdome ou empachamento após as
refeições devido ao aumento do tamanho do baço. A fisiopatologia da
doença é caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia(Ph),
com apresentação da translocação t (9;22)(q34;q11), formando o rearranjo
gênico BCR-ABL.
34 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

O gene da fusão BCR‐ABL1 transcreve RNAm, que é responsável

por codificarumaproteína com atividade tirosina-quinase maior que a
proteína produzida pelo ABL “selvagem”. Dependendo do ponto de quebra
no BCR, o produto da fusão pode ser: M-BCR (major), m-BCR (minor) ou
μ BCR. O M-BCR é o mais comum na LMC, e resulta em proteína de 210
kD (p210BCR-ABL). A ativação constitutiva da sinalização mitogênica,
redução da apoptose e redução da adesão das células ao estroma e à
matriz extracelular são as possíveis ações da proteína BCR‐ABL1 são os
mecanismos propostos na fisiopatologia da LMC. Ver figura 10.
Figura 8: Indivíduo normal x indivíduo com LMC

Fonte: http://bit.ly/2NeQ7xV

Para o diagnóstico da LMC são usados o hemograma, avaliação

da extensão sanguínea, imunofenotipagem e citogenética para a
identificação do cromossomo Philadelphia ou do complexo BCR/ABL1.
A técnica usada é a hibridização in situ por fluorescência (FISH). Essa
técnica detecta o rearranjo BCR/ABL1, e tem sido preconizada para as
situações em que não se têm metáfases para análise ou de cromossomo
Ph mascarado no cariótipo.
O prognóstico é feito por meio da correlação entre as alterações
cromossômicas e a leucemia e que conferirá um bom ou pior prognóstico
para o paciente. Dessa maneira, a presença do cromossomo Ph confere
maior sobrevida aos pacientes, por isso é considerado bom prognóstico,
o que não ocorre com os Ph negativos, os quais devem fazer testes
confirmatórios para excluir totalmente a não-presença do cromossomo
Ph. A prevalência do cromossomo Ph é de cerca de 90% a 95% dos
pacientes e os Ph negativos geralmente são encontrados nos idosos,
osqauis apresentam leucocitose, trombocitopenia com resposta fraca
à terapia e a sobrevida desses pacientes geralmente é bem mais curta.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 35

Técnica de análise para o auxílio de

leucemia mielóide aguda (LMA)
A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença que tem por
característica aproliferação de mieloblastos anormais. Fatores como
exposição a benzeno, radiação ionizante e tratamento com agentes
alquilantes ou outras drogas citotóxicas podem desencadear a LMA.
O diagnóstico laboratorial é feito a partir da análise do hemograma,
mielograma, imunofenotipagem, estudo cromossômico dos blastos
(cariótipo) e análises moleculares.
A citogenética busca a identificação das alterações t(8;21), t(15;17),
inv(16) e 11q23, recomendadas pela Organização Mundial de Saúde.
As categorias de risco são baseadas na identificação citogenética, por
exemplo, quando for encontrado t(8;21) com ou sem del(9q) e com ou
sem complexidade com mais de três alterações, t(15;17) com ou sem
alterações adicionais, inv(16)/ t(16;16)/del(16q) com ou sem alterações
adicionais, é favorável para o paciente, porém se for identificado -5/
del(5q), -7/del(7q), inv(3q)/t(3;3), t(6;9), del(9q), t(9;22), 11q anormal, 20q,
21q, ou 17p ou cariótipo complexo definido com mais de três alterações,
é desfavorável para o paciente.
Na fase LMA-M0 o estudo da imunofenotipagem relata uma
população blástica com relação entre tamanho/grânulo (FSC/SSC)
baixa, com positividade para pelo menos um dos antígenos de linhagem
mielóide CD33, CD13 e/ou CD11b. Na LMA-M7 os marcadores de
superfície encontrados são CD13 e CD33, CD41, CD42, CD61 e em alguns
casos HLa-DR negativo. Na LMA-M2V os blastos são positivos para os
antígenos de linhagem mielóide CD13, CD33, CD65w e anti-MPO.
No entanto, o achado imunofenotípico patognomônio é a
presença dos antígenos de linhagem linfóide (CD19) ou linhagem
NK (CD56) associados aos antígenos CD33 e CD34, na LMA-M3 os
blastos apresentam grande auto-fluorescência, e positividade para os
marcadores de linhagem mielóide CD13 e CD3343. E apresentam, os
antígenos CD34, HLA-DR e CD14 são negativos, na LMA-M4Eo apresenta
marcação positiva para os antígenos de linhagem mielóide CD13 e CD33,
assim como para os antígenos de linhagem monocítica CD14, CD15 e
CD11b. Caracteristicamente, há expressão anômala do antígeno de
36 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

linhagem linfóide CD2, na LMA-M5 os antígenos de linhagem mielóide

CD33 são positivos e os CD13, negativos. Os antígenos CD14 e CD15 são
positivos. A técnica para a identificação dessas alterações é Hibridização
in situ que é rápida, sensível e específica.

Técnica de análise para o auxílio de

síndrome mielodisplásica (SMD)
A síndrome mielodisplásica (SMD) corresponde ao um conjunto
de doenças com proliferação clonal das células da medula óssea,
caracterizado, nas fases iniciais, por pancitopenia devido à alteração na
apoptose e na maturação das células e, nas fases mais tardias, por evolução
para leucemia aguda, em decorrência do bloqueio de diferenciação.
Agentes físicos e químicos podem estar associados ao desen-
volvimento da doença. O estudo citogenético em SMD é usada como
ferramenta para o diagnóstico, prognóstico, previsão de progressão da
doença e escolha terapêutica. Além disso, a presença de anormalidade
citogenética confirma a monoclonalidade da doença. As alterações
citogenéticas mais comuns são 5q-, 7q-, 20q-, 11q-, 13q-, 12p-, 17p-.
Além desses testes, pode-se realizar a imuno-histoquímica,
usando os marcadores CD34, CD117/c-kit ou da proteína p53 em células
imaturas; nesse caso haverá expressão de marcadores de linhagem em
precursores imaturos ou pode realizar a técnica de Hibridização in situ
por fluorescência.

Técnica de análise para o auxílio de

leucemia linfocítica aguda (LLA)
A leucemia linfocítica aguda (LLA) é uma doença de origem
heterogênea, caracterizada pela proliferação clonal com acúmulo de
células linfoblásticas malignas na medula óssea e no sangue periférico.
É uma doença que podem ter várias etiologias como genética, fatores
ambientais, hematopoiéticos ou ao acaso.
A abordagem diagnóstica é feita a partir da combinação de vários
métodos como a citomorfologia, a citoquímica e a imunofenotipagem
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 37

permitem a categorização em diferentes linhagens. As leucemias de

linhagem B estão divididas de acordo com os estágios de maturação
dos progenitores B na medula óssea, dessa forma são classificadas em:
pró-B, comum, pré-B e B-maduro. A LLA do tipo pró-B representa 5%
dos casos pediátricos e 10% dos casos de LLA em adultos. As células
expressam: HLA-DR, Terminal Desoxinucleotidil Transferase (TdT), CD34,
CD19 e CD22(c)(31).
A LLA do tipo comum expressa CD10, o que é de bom prognóstico,
CD22(c), CD19 e/ou CD20. Esse tipo representa cerca de 75% dos casos da
LLA infantil e 50% dos casos em adultos. A leucemia pré-B expressa cadeia
µ citoplasmática, em adição a CD19, CD20 e CD10(31), representando,
aproximadamente, 15% das crianças com LLA e 10% dos casos em adultos.
E, a LLA do tipo B maduro, presente em 2% a 5% de crianças e adultos,
apresenta um fenótipo incomum, caracterizando-se pela expressão de
cadeias leves de imunoglobulina na superfície de membrana (SmIg). Os
blastos apresentam as mesmas características morfológicas (FAB L3) e
translocações cromossômicas associadas à célula maligna do linfoma
de Burkitt (23, 28, 31, 34). Este tipo de leucemia apresenta prognóstico
desfavorável, pois há elevada incidência de envolvimento no sistema
nervoso central (SNC), resposta deficiente à terapia e sobrevida abreviada.
A anormalidade estrutural mais frequente é a t(12;21) (TEL/AML1
ou ETV6/RUNX1), ocorrendo em 20 a 25% dos pacientes. A técnica usada
é a de Hibridizaçaoin situ por imunofluorescência.

Técnica de análise para o auxílio de

Linfomas
Os linfomas são doenças caracterizadas por desordem hemato-
lógica e representam a terceira causa de câncer na infância. Os sintomas
dos pacientes são aumento de linfonodos e/ou sintomas sistêmicos,
como febre, sudorese noturna, perda de peso ou fadiga. O diagnóstico
deve ser baseado na história clínica, exame físico detalhado, realização
de um aspirado de medula óssea com biópsia, com avaliação pela
imuno-histoquímicas como auxílio na distinção dos infiltrados e a
imunofenotipagem.
38 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial

Diversos fatores estão elencados no ínicio da doença como infecção

crônica, imunossupressão e história familiar. Infecções com o vírus Epstein-
Barrvírus [EBV, HTLV ( víruslinfotrópico para células T humanas do tipo 1,
o herpes vírus humano do tipo 8 [HHV8]), Helicobacterpylori e o vírus da
hepatite C podem estar associados ao aparecimentos de linfomas.

Técnica de análise para o auxílio de

tumores sólidos
Tumores sólidos são caracterizados pelo crescimento anormal
de células de um tecido, alguns tumores como câncer de mama e
meduloblastoma, são avaliados na citogenética a partir da alteração
ERBB2/ HER2/NEU, receptor de fator de crescimento de epiderme e
para o muduloblastoma é avaliado o isocromossomo do braço longo
do cromossomo 17 (i17q). A técnica usada para a identificação é a de
hibridização in situ por fluorescência.

RESUMINDO:
As doenças genéticas tem origem multifatorial como
fatores ambientais, genotóxicos, desordens hematológicas,
translocações cromossômicas, entre outras coisas. O
diagnóstico laboratorial é baseado num conjunto de
métodos diagnósticos como avaliação celular, imunofeno-
tipagem, imunohistoquímica, citogenética molecular. A
citogenética é de fundamental importância porque ajuda
no estadiamento da doença, bem como no prognóstico. O
diagnóstico realizado de maneira precoce ajuda no início
do tratamento e diminui o avanço da doença. A técnica
mais utilizada hoje no laboratório é a de hibridização in situ
devido a alta sensibilidade e especificidade.
 Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 39

BIBLIOGRAFIA
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