APLICAÇÃO DA BIOLOGIA

MOLECULAR NO DIAGNÓSTICO
LABORATORIAL

NATÁLIA GINDRI FIORENZA

MARIA PAULA SAMPAIO

UNIDADE 04
 UNIDADE 4 | INTRODUÇÃO

A técnica de sequenciamento de DNA é

muito utilizada na biologia molecular e
tem amplas funções e aplicações no
diagnóstico laboratorial.

Figura1: Pixabay
 OBJETIVOS
1. Apresentar a técnica de sequenciamento de DNA, assim
como seu breve histórico e o seu funcionamento.
2. Estudar a aplicação do sequenciamento do DNA em
diagnóstico laboratorial, o depósito de sequências
utilizadas e a utilização para identificar, diagnosticar e
desenvolver tratamentos.
3. Conhecer as aplicações da técnica de sequenciamento
na área das ômicas da Bioinformática.
4. Entender as técnicas mais recentes de sequenciamento
e o avanço das técnicas, além de conhecer sobre a
utilização das tecnologias para desenvolvimento de
produtos e serviços.
 A TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO
Sequenciamento de DNA

Essa é uma nova metodologia para 7

A T C G
6
identificação das sequências de bases 5
em um dado genoma. Esse 4 Cadeias complementares
sequenciamento tem uma ampla 3 Marcadas com ddNTPs

aplicação, sendo possível utilizá-lo para 2

identificar mutações, regiões 1
Primer
polimórficas, DNA invasor e regiões
gênicas importantes. 1
A
2
T G
3 4
A
5
C
6 7
T A

5’ 3’ Cadeia complementar
3’ 5’ Cadeia molde

TAC TG AT

Figura2: Editorial Telesapiens

 BIOINFORMÁTICA
A bioinformática se trata do emprego de
ferramentas computacionais com o intuito
de estudar os problemas e questões
biológicas, abrangendo uma gama de
aplicabilidades, principalmente relacionadas
à saúde humana, como o planejamento de
novos fármacos.

Figura3: Freepik
 BIOINFORMÁTICA

A bioinformática possui duas vertentes muito

bem difundidas:
I. Bioinformática tradicional ou clássica, que
trata de identificar a estrutura sequencial
de nucleotídeos e aminoácidos;
II. Bioinformática estrutural, que aborda
questões biológicas de um ponto de vista
tridimensional, abrangendo a maior parte
das técnicas voltadas à química
Figura4: Freepik
computacional e modelagem molecular.
 BIOINFORMÁTICA

A análise de sequências é menos custosa

computacionalmente, nos possibilitando
lidar com genomas inteiros, nos
permitindo realizar análises de indivíduos
ou até mesmo de populações de
indivíduos, levando à compreensão das
características biológicas de cada
organismo.
Figura5: Pixabay
 SEQUENCIAMENTO DE SANGER

Ao desnaturar a proteína, ela acaba se

desenovelando, tomando sua estrutura primária,
sendo uma cadeia linear. As reações de
degradação promovidas por Sanger eram em
cima dessas sequências primárias, afinal,
identificar componentes proteicos a partir de
estruturas tridimensionais é algo bastante difícil
de se fazer a partir de programas computacionais,
imaginem através de reações químicas
laboratoriais. Figura6: slideplayer
SEQUENCIAMENTO DE SANGER

A técnica de sequenciamento tem como

objetivo a determinação da sequência
de bases nucleotídicas em um pedaço
de DNA.

Figura7: slideplayer
 METODOLOGIA EMPREGADA
• O sequenciamento realizado por Sanger é uma adaptação de técnica de PCR.

• Isso significa dizer que os reagentes utilizados para o sequenciamento serão

basicamente os mesmos

• A única diferença é que será adicionado um nucleotídeo quimicamente modificado

e marcado, como se tivesse construindo sondas.
• Ao final da reação, em cada tubo, haverá fragmentos de DNA com diferentes
tamanhos de comprimento

• Isso porque os ddNTPs são alterados para não terem mais uma OH, assim, quando
esse nucleotídeo alterado for adicionado na cadeia a ser sintetizada

• Ele irá impedir que novos nucleotídeos sejam adicionados.

 METODOLOGIA EMPREGADA

• Após a conclusão do PCR, o próximo passo é a corrida em

eletroforese.

• Como em cada tubo foram geradas cadeias polinucleotídicas com

tamanhos diferentes por conta da ligação dos ddNTPS, isso poderá
ser lido no gel de eletroforese.
 AUTOMAÇÃO DO MÉTODO DE SANGER
• O avanço tecnológico permitiu que o método
de sequenciamento de Sanger desse um
upgrade melhorando a forma de aquisição da
amostra para o sequenciamento das bases
nitrogenadas.

• A automação permitiu que máquinas

exercessem o processo de mistura dos
reagentes, amplificação das amostras a partir
dos quatro dNTPs e quatro ddNTPs, corrida no
Figura8: wikipedia
gel de eletroforese capilar e aquisição do
sequenciamento.
PROJETO GENOMA HUMANO (PGH)
O PGH foi criado com o intuito de sequenciar todo
o genoma humano e junto a isso, havia também
objetivos como identificar todos os genes
humanos, armazenar as informações geradas em
bancos de dados genômicos, o sequenciamento
de genomas de organismos modelos, melhorar a
capacidade computacional, explorar a função de
genes, estudar a variabilidade genética humana e
treinar cientistas para trabalhar com a área da
genômica.
Figura9: Pixabay
 IMPACTOS DO PGH

• Com o projeto, descobriu-se que o genoma humano contém cerca de 3,2

bilhões de nucleotídeos;
• O tamanho médio dos genes é de 3.000 bases, podendo variar bastante de
acordo com algumas regiões polimórficas;
• A função de cerca de 50% dos genes descobertos era desconhecida;
• A sequência do genoma humano é exatamente 99% compatível entre
qualquer pessoa;
• Cerca de 3% do genoma é responsável pela síntese de proteínas;
• Sequências repetidas que não codificam proteínas constituem mais de 50%
do genoma humano.
 SEQUENCIAMENTO NA ROTINA
LABORATORIAL DE DIAGNÓSTICO

Houve uma evolução nos métodos de

sequenciamentos e suas aplicabilidades
na rotina de grandes laboratórios de
diagnóstico.

Figura10:Freepik
SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO
(NGS)
Com a demanda por novas plataformas de
pesquisa, as novas plataformas de
sequenciamento de nova geração (NGS)
foram construídas com o intuito de gerar
o sequenciamento do DNA em milhões de
pares de base em uma única corrida e a
um preço reduzido.

Figura11: Pixabay
 SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO
(NGS)
• Essas novas plataformas possuem a
característica de gerar informações
muitas vezes maior do que as geradas
pelo método de Sanger e com um baixo
tempo e custo de sequenciamento.
• Essa maior eficiência vem do fato do
uso de novas abordagens, que não são
a formação de fragmentos para análise
em eletroforese capilar.

Figura12: Pixabay
 BIBLIOTECAS GENÔMICAS

Antes do sequenciamento de fato,

existia a necessidade de construir
bibliotecas genômicas, que nada
mais é do que transformar o DNA
genômico em fragmentos menores,
independente de qual organismo
seja.

Figura13:slideplayer
 BIBLIOTECAS GENÔMICAS

• A técnica é baseada no O Shotgun hierárquico é o método

bombardeio do genoma alvo a ser utilizado para grandes fragmentos
sequenciado com partículas que de genoma em que realiza um
possam promover a sua segundo round de fragmentações
fragmentação. para que o DNA extenso seja clivado
em subunidades ainda menores.
• Após a fragmentação, terá a
formação de vários fragmentos de
DNA, com tamanhos
desconhecidos.
 PIROSEQUENCIAMENTO DA ROCHE 454
• Os sequenciadores da Roche foram
os primeiros a serem comercializados
com uma tecnologia de alto
rendimentos (high-throughput) de
DNA;
• Esse método, de forma mais direta,
se baseia de uma cascata enzimática
que culmina na liberação de um
pirofosfato (um difosfato). Figura14:researchgate
 PLATAFORMA SOLEXA (ILLUMINA)
• A Illumina surgiu com a proposta de
realização de exames em biologia
molecular através da técnica de
microarranjos de DNA (DNA microarray)

• O sequenciamento dessa plataforma,

assim como a de Sanger, é mediada àa
síntese usando nucleotídeos marcados
em suas extremidades 5’ e a
amplificação da cadeia.

• A inovação dessa técnica é a clonagem Figura15: researchgate

in vitro dos fragmentos em superfície

sólida de vidro, processo também
conhecido como PCR de fase sólida.
 MAPEAMENTO GENÔMICO
• O mapeamento gênico foi uma das vertentes exploradas
Você é contra ou a favor do mapeamento genético?
pelo projeto genoma humano com o intuito de mapear
cada gene presente no cromossomo humano e sua
ligação com os outros genes também presentes no 79,52%
mesmo cromossomo.
• Através do sequenciamento da ordem de pares de bases
do genoma humano foram identificados genes que
tinham uma maior probabilidade de serem permutados

A favor
juntos.
• Os principais objetivos do mapeamento do genoma

Não tenho opinião

humano são possibilitar prevenção, melhor tratamento e, 15,66%
finalmente, cura dos distúrbios genéticos. 4,82%

Contra
• Até quando seria ética e necessária a descoberta precoce
de algumas alterações gênicas? Essa é uma técnica que
tem seus prós e contras, sem assim necessária a avalição Figura16: Editorial Telesapiens
dos prós e contras.
 SEQUENCIAMENTO DE EXOMA
O sequenciamento completo de exoma
• O exoma refere-se ao conjunto de bases
codificáveis em um gene. Coleta da amostra

Extração, purificação e dosagem do

• As técnicas de sequenciamento são DNA a ser analisado
capazes de identificar os trechos Sequenciamento dos 200 mil exons
puramente codificáveis. do genoma humano

Análise bioinformática dos dados

• Essa análise é de grande utilidade, já que
tem a capacidade de estudar a maioria Validação de alteralções
diagnosticadas
das doenças de origem genética
conhecida, por exemplo a Doença de Figura17: Editorial Telesapiens

Huntington e o câncer de mama

 APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE
SEQUENCIAMENTO
Genona DNA

Após os resultados do projeto genoma

Transcriptoma RNA
humano, o estudo das ômicas vieram à
tona como uma ferramenta de análise
genotípica de um genoma, de qualquer
espécie, e como esse genoma pode
Proteoma Proteínas
reagir a partir de fatores externos.

Metaboloma Açucares Nucleotídeos Aminoáciodos Lipideos

Metabólitos
Figura18: Editorial Telesapiens
 ESTUDO DAS ÔMICAS
O estudo do sequenciamento das
bases do DNA permitiu que hoje o
DNA e outras macromoléculas
consigam ser analisados de
diferentes formas, afim de
identificar a constituição genotípica
de um determinado genoma, suas
regiões codificáveis, as
macromoléculas ativas e as
interações dinâmicas feitas por elas
para a geração de um fenótipo a Figura19: USP
partir de uma via metabólica.
 GENÔMICA

Genômica é o estudo de todo o

genoma de um organismo.
A análise genômica permite identificar
regiões hipervariáveis, podendo levar
a variações genéticas predispostas ao
desenvolvimento de doenças ou não.

Figura20: Freepik
 GENÔMICA

Em casos de bibliotecas muito grandes, será

necessária a formação de sub-bibliotecas e o
sequenciamento delas. Essas sub-bibliotecas
formarão mais contigs ainda menores. Esse
conjunto de contigs será utilizado para a geração
de scaffolds.

Figura21: Freepik
 TRANSCRIPTOMA

O estudo da transcriptoma é a
análise da quantidade total de
dados transcritos, RNA, em uma
célula, consistindo em RNAs
capazes de codificar uma

Figura22: USP
mensagem em cadeia proteica e
RNAs não codificáveis.

Fonte: terceirobbiologia
 TRANSCRIPTOMA
A utilização de RNA-Seq pode
mensurar o efeito de diferentes
exposições de um genoma a fatores
externos. Como a expressão gênica
varia de acordo com as condições na
qual um indivíduo, ou outro ser vivo,
se encontra, então essa técnica
consegue mensurar a expressão de
diferentes genes simultaneamente.

Figura23:wikipedia
 PROTEOMA

O estudo da proteoma é a análise de todo o

conjunto de proteína em uma célula, tecido
ou organismo. A proteômica é o estudo da
proteoma, entretanto, combinando algumas
outras apropriações como proteoma
estrutural e interação proteína-proteína (PPI).

Figura24: Freepik
 PROTEOMA

A proteoma trabalha em cima da cadeia

primária da proteína, identificando ou
quantificando-a, a proteoma estrutural
trabalha em cima da construção
tridimensional da proteína e os tipos de
modificações proteicas e as PPIs trabalham
com as interações funcionais das proteínas.

Figura25: Freepik
 METABOLÔMICA

• Os metabólitos são, como o nome já diz, produtos oriundos do metabolismo.

• O estudo do conjunto de metabólitos envolvendo uma célula, tecido ou organismo e

a sua medida quantitativa após estímulos fisiopatológicos ou modificações genéticas
é chamado de Metabolômica.

• A análise metabolômica de um grupo de indivíduos exposto a alterações ambientais,

genéticas ou sobre uso de medicamentos em comparação a um grupo não exposto.
Essa comparação pode fornecer informações essenciais para o entendimento da
geração de um fenótipo devido à exposição de algum fator, seja ele ambiental,
químico ou genético.
 AVANÇOS TECNOLÓGICOS DO
SEQUENCIAMENTO

Os novos métodos de sequenciamento,

ainda mais avançados, permitem mais
adaptação ao sequenciamento de
pares de base de características
diversas e abordaremos exemplos de
aplicabilidades práticas desses novos
métodos de sequenciamento.

Figura26: Freepik
 SEQUENCIAMENTO DE TERCEIRA GERAÇÃO

Os sequenciamento de geraçãoes
antigas possuem a característica de
sequenciar dados de leituras curtas
(short-reads), tornando o processo de
leitura bastante complicado quando se
trata de processo de montagem de
genomas ou transcritos longos.

Figura27: wikipedia
SEQUENCIAMENTO DE TERCEIRA GERAÇÃO

Ainda existem dificuldades em

sequenciamento, principalmente
quando se trata da montagem de
genomas e de transcritos longos
(long-reads).

Figura28: gia
 BIBLIOTECAS DE DNA DA TERCEIRA
GERAÇÃO

Em sequenciadores de terceira geração,

tendo a capacidade de realizar leituras
longas, a construção de bibliotecas de DNA
não será necessária, podendo sequenciar as
duas fitas de DNA genômico, ou no caso da
Oxford Nanopore, uma só.

Figura29: slideplayer
 PACBIO
A plataforma de sequenciamento SMRT,
PacBio, utiliza uma abordagem de
sequenciamento em tempo real, sendo
algumas etapas de seu processo bastante
similares com a utilizada pela HeliScope.
Entretanto, ao contrário da HeliScope que
lê 25 a 35 pares de base, a SMRT tem a
capacidade de leitura extremamente
aumentada, alcançando,
aproximadamente, 20Kb.
• A semelhança entre o sequenciamento da
HeliScope e a SMRT está na forma de
sequenciamento.
• Após a desnaturação do DNA, as
extremidades de ambas as fitas serão
unidas, formando uma fita única celular
com auto pareamento.
• A fita circular vai gerar somente uma única
amplificação/sequenciamento em alguns
ciclos, como se fosse uma nova PCR, só que
agora em um genoma. Essas leituras são
chamadas de CCS (clusters of circular
consensus).
 OXFORD NANOPORE (MINION)
Essa técnica é baseada em sequenciamento em nanoporos, os quais
contem proteínas canais que têm a função de emitir uma corrente
elétrica à medida que a amostra de DNA vai passando pelos
nanoporos.
Uma das características que faz essa plataforma ser revolucionária é o
tamanho do sequenciador, chegando a pesar cerca de 100 gramas,
tornando um sequenciador portátil e tendo também uma porta USB
para a transferência de dados para a máquina, seja computador ou
laptop.
Obrigada!