RNA-Seq:

Conceito e
Aplicações
BIOTECNOLOGIA
RNA-seq
 RNA-seq é uma abordagem recentemente
desenvolvida, para analisar o perfil de transcriptoma, que
utiliza tecnologias de deep-sequencing.

 O transcriptoma é o conjunto completo de

transcritos (RNAs) em uma célula, e sua quantidade, para
um estágio de desenvolvimento específico ou condição
fisiológica.

 * deep-sequencing = indica que a cobertura do processo é muito

boa. Sequenciar uma mesma região várias vezes.
 O entendimento do transcriptoma é essencial
para:
 Interpretar os elementos funcionais do genoma
 Revelar os constituintes moleculares de células e
tecidos nos diferentes estágios de desenvolvimento
 Compreender os elementos presentes no
desenvolvimento de doenças

 O transcriptoma pretende catalogar todos os

tipos de transcritos:
 mRNAs
 RNAs não codificadores
 pequenos RNAs.
Por que estudar o transcriptoma?

Paradeterminar a estrutura transcripcional dos genes, em

termos de seus sítios de início 5’ e final 3’;
Padrões de splicing e outras modificações pós-traducionais;
Quantificar os níveis de mudanças de expressão de cada
transcrito durante o desenvolvimento e sob condições
diferentes.
Encontrar microRNAs que possuem função reguladora
Metagenômica

* Splicing = é um processo que remove os íntrons e junta os éxons depois da

transcrição do RNA. O splicing só ocorre em células eucarióticas, já que o DNA
das células eucarióticas não possui íntrons.
Criação da Biblioteca
Pode-se utilizar:
Todo o RNA da célula
 Possui 90-95% de rRNA
Apenas mRNA selecionado pela cauda de poli-A
 Perde-se microRNAs e mRNAs sem poli-A
Retira-se o rRNA*
 Por hibridização com sequencias específicas ligadas a biotina que são
retiradas com esferas ligadas a streptovidina
 Por quebra com uma exonuclease que age sobre RNAs que possuem
fosfato na extremidade 5' (apenas rRNAs possuem esse fosfato)
A remoção de rRNAs aumenta a detecção e a montagem de
transcritos raros.
 Mas se o objetivo do estudo é a quantificação, é necessário uma
biblioteca não depletada.
Expressed
sequence
tags (ESTs)
Considerações Prioritárias
na montagem
Para garantir uma alta qualidade na
montagem do transcriptoma, cuidados
particulares devem ser tomados nos
experimentos de RNA-Seq.

• Na fase de análise de dados, as leituras

curtas são pré-processadas para remover
erros de sequenciamento e outros artefatos.

• As leituras são subsequentemente montadas

nos RNAs originais e então sua abundância é
avaliada.
[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]
 Para evitar erros na montagem de RNA, é
necessário retirar o passo de amplificação por
PCR
 Na etapa de amplificação por PCR alguns
fragmentos podem ser melhor amplificados que
outros prejudicando os dados
 Já é possível fazer o sequenciamento sem
amplificação usando as plataformas Helicos e Pacific
Biosciences,

 O sequenciamento através de uma única

molécula é possível, porém essas tecnologias
ainda sofrem com a alta taxa de erro.
Estratégias de Montagem
do Transcriptoma
 Baseado em três categorias :

- Etratégia baseada em referência

- Estratégia de novo

- Estratégia combinada
Estratégia baseada em
Referência
 Quando existe um genoma de referência o
transcriptoma pode ser construido a partir dele.

 Esse método inclui três passos:

 Alinhamento das leituras sobre o genoma de
referência
 As leituras sobrepostas em cada locus são agrupadas
para construir um gráfico de todas as isoformas
possíveis.
 O gráfico é analisado para resolver isoformas
individuais.

 Programas: Blat, TopHat, SpliceMap, MapSplice,

GSNAP
[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]
Vantagens

 Pode montar transcritos de baixa abundância;

 Pode usar computação paralela
 Pode ser feita em máquinas com poucos gb de RAM;
 Descobrir novos transcritos que não estão em anotações já
existentes;
 Descarta artefatos e contaminantes (que não alinham)
 Usado para transcriptomas simples:
 bactérias, archeaeal, eucarióticos simples (com poucos
introns)
 pouco splicing alternativo
Desvantagens

 Não é possível sem um genoma de referência;

 Depende da qualidade do genoma de referência ;

 Genomas podem não ser completos, ter regiões

não agrupadas e parcialmente montadas.

 Genes que se encontram muito próximos ou

sobrepostos podem ser interpretados com um único
transcrito

 Não une leituras que esteja muito distantes no

genoma ou em cromossomos diferentes
Estratégia de novo
 Não utiliza um genoma de referência;

 Se utiliza da redundância das leituras para encontrar

sobreposições entre as leituras

 Programas usam o gráfico De Brujin para reconstruir transcritos

de uma ampla faixa de níveis de expressão e então processar
a montagem de contigs e remover redundancias.

 Semelhante à montagem de genoma

[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]
[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]
Vantagens

 Não depende de um genoma de referência;

 Pode providenciar um novo conjunto de dados de transcritos para genomas que

não apresenta alta qualidade;

 Pode ser usado para encontrar transcritos exógenos ou que estão faltando no
genoma;

 Não é influenciado por longos introns

 Encontra transcritos trans-spliced, resultantes de rearranjos cromossomais

 Pode ser utilizado para o transcriptoma de organismos complexos

Desvantagens

 A montagem de organismos eucariotos complexos pode consumir

muita memória RAM
 Grande quantidade de dados
 Complexidade dos gráficos de Brujin nescessários para analizar os possíveis
splicings
 Consome dias ou semanas de processamento

 Exige maior cobertura (30x)

 Suscetível a erros de leitura, pode não diferenciar um erro do

sequenciamento de um splicing

 Trechos similares ainda podem ser considerados um só transcrito

Estratégia Combinada

• A combinação dos dois métodos pode ser utilizada

• O alinhamento tem a vantagem da sensibilidade
• O De Novo para encontrar transcritos novos e trans-spliced

• Realizando o alinhamento primeiro podemos descartar as

sequências já conhecidas
• Fazendo a montagem De Novo com uma quantidade muito
menor de dados

• Quando o genoma de referência tem baixa qualidade a

montagem De Novo pode ser feita primeiro
• Os contigs e singlets são alinhados no genoma e as lacunas
podem ser preenchidas com informações do genoma
[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]
Cobertura x Custo
 Uma questão importante é a cobertura da sequência ou a
porcentagem dos transcritos pesquisados, os quais implicam no custo.

 Grandes coberturas requerem mais sequenciamento.

 Em transcriptomas simples, como da levedura S. cerevisiae, que não

tem evidência de splicing alternativo, 30 milhões de leituras de 35
nucleotídeos são suficientes para observar a transcrição de mais de 90%
dos genes de células em crescimento sob uma condição unica.
Aplicações
 Portanto, o RNA-seq é utilizado para determinar quais genes são ativados em
uma célula ou tecido, seu nível de expressão e em qual momentos eles são
ativados ou desativados. Ou seja, o RNA-seq é utilizado para analisar a
expressão de um gene em diferentes células ou tecidos, fornecendo pistas
sobre sua possível função.

 Identificar possíveis padrões de expressão gênica relacionados a

determinadas células também podem ser utilizados para estudos de
patologias. Por exemplo, quando um gene está sendo diferencialmente
expresso na célula com câncer em relação a uma célula normal, é possível
que este gene esteja associado aos padrões de crescimento desta célula.

 O RNA-seq também pode ser utilizado para outros organismos como o padrão de
expressão gênica em plantas em determinado ambiente como estresse hídrico ou
térmico, para determinar os genes relacionados com resistência ou tolerância.
 Assim como em microrganismos com potencial biotecnológico ou para o entendimento
do padrão de infecções causadas por eles.
Aplicações

 Descoberta de pequenos RNAs

 Quantificação da expressão em
diferentes momentos

 Fusão de genes em câncer

 Identificação de mutações

 Metagenômica
Análise dos dados do RNA-seq
referência

https://blog.varsomics.com/o-que-e-rna-seq/