Transcrição em Eucariotos .

Transcrição em bactérias x eucariotos - similaridades:

● Ambos sintetizam uma fita de polinucleotídeos complementar a uma fita
de DNA molde antiparalela
● Ambos usam nucleotídeos trifosfatatos como precursores
● A química de síntese é a mesma, que ocorre sempre no sentido 5’ → 3’
● Os precursores são rNTPs e não dNTPs
● A reação é catalisada por uma RNA polimerase dependente de DNA
● RNA polimerases não precisam de um primer
● O transcrito de RNA não permanece associado à fita molde de DNA
● Processo menos preciso que a replicação e em ambos tem a mesma
precisão e ambos podem fazer correção de bases colocadas
erroneamente
● A transcrição é assimétrica (apenas uma das fitas é copiada)
● Copia seletivamente apenas partes do genoma, com número de cópias
variável → escolha não randômica e regulável

Fases gerais: também são as mesmas em

bactérias e eucariotos. Em ambos os casos existe
uma fase de início da transição que envolve o
reconhecimento do promotor, no caso de
eucariotos pela maquinaria de transcrição → uma
vez que reconhece o promotor forma um
complexo de pré-iniciação, em que o DNA ainda
está fechado, formando um heteroduplex.

Esse complexo de pré-iniciação se torna um

complexo de iniciação aberto, onde as duas fitas
de DNA já se separaram formando a bolha de
transcrição, permitindo o início da síntese de RNA.
Com início da síntese de RNA tem o fim da fase de
iniciação e a transição para fase de elongação,que
envolve escape da RNA Polimerase do promotor,
entrando em uma fase extremamente processiva
onde sintetiza RNA muito eficientemente, até que a
RNA Polimerase encontra uma sequência
terminadora e ocorra o término da transcrição.

Transcrição em eucariotos: a transcrição em eucariotos é mais complexa.

● A sequência dos promotores é mais variável e é diferente
● Existem vários fatores de iniciação diferentes do fator sigma
● Processo de terminação da transcrição é diferente
● Existe mais de uma RNA polimerase
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RNAs Polimerases:
Eucariotos tem 3 RNA polimerases
nucleares. Além das RNAP nucleares,
tem também nas organelas e
mitocôndrias, mas que são muito
parecidas com a bacteriana.
As 3 RNAPs eucarióticas são
compostas de mais subunidades do
que a bacteriana, no mínimo 11 subunidades. Tem subunidades homólogas
com as bacterianas
As RNA Polimerases eucarióticas não tem fator sigma ou qualquer
subunidade que seja homóloga ao fator sigma → a maneira através da qual
as RNAPs eucarióticas reconhecem o promotor é muito diferente.

RNA Polimerase I: localizada no nucléolo e transcreve genes de rRNAs

RNA Polimerase II: está fora do nucléolo no núcleo e transcreve genes
codificadores de proteínas e outros tipos de RNAs não codificadores.
RNA Polimerase III: está fora do nucléolo no núćleo e transcreve um gen de
rRNA e genes de tRNAs

Assim como existem compostos que inibem a atividade da RNAP bacteriana

como a rifimicina, existem também compostos que podem inibir
especificamente RNAP II eucariótica como a alfa-amanitina, que está presente
em um cogumelo venenoso → bloqueia a etapa de elongação

Como promotores são reconhecidos pela RNAP II:

Ao contrário da RNA polimerase bacteriana, a RNA pol II não consegue
reconhecer promotores sozinha, requer proteínas adicionais chamadas
fatores de transcrição geral, que se ligam
antes da RNA pol ao promotor e não fazem
parte da enzima.
De todos esses fatores, só existe um que tem
apenas uma subunidade, o TFIIB.

O fator mais importante, o que vai de fato

iniciar o reconhecimento do promotor
eucariótico, o TFIID, é composto de 12
subunidades, é maior até que a própria RNA pol II.
O TFIID é composto de uma proteína muito importante para o
reconhecimento da maioria dos promotores eucarióticos, a TBP e proteínas
associadas ao TBP, as TAFs.
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Promotores da RNA
Polimerase II:
Promotor eucariótico é composto
de uma série de elementos
conservados .
Em eucariotos,a montante do
início da transcrição se encontra
por volta de -30 -35, composto
pelo elemento TATA, reconhecido
pela proteína TBP, que faz parte
do TFIID. Esse TATA está adjacente ao elemento BRE, um elemento de resposta
ao TFIIB.
Existe uma sequência conservada que circunda o sítio de início da
transcrição, a INR, que também é reconhecida pelo TFIID, não pelo TBP mas
com TAFs.
Existe também um elemento que fica a jusante, depois do início da
transcrição, em +30, que também interage com TFIID, chamado de DPE
(downstream promotor element).
Nem todos os promotores eucarióticos têm todos esses elementos e també
existem outros elementos minoritários que podem aparecer. A maioria dos
promotores eucarióticos têm essa sequência TATA box junto do BRE e a
sequência INR, de tal forma quando o TBP interage com TATA e recruta o
TFIID para promotor, esse TFIID vai interagir também com a INR.
Existem promotores TATA-less, que não tem TATA box. Contém a sequência
conservada do iniciator e geralmente contém o DPE.
● O TATA box é o elemento mais fundamental do promotor eucariótico. A
sequência consenso é: TATAAAA
● Localizado na posição -30a -40 do início da transcrição.
● TFDIID se liga a TATA box através da Tata binding protein → é o primeiro
evento que acontece para o reconhecimento do promotor.

Montagem do complexo de transcrição basal:

Primeiro, TBP interage com TATA box e recruta TFIIB
para o promotor, que se sobrepõe à região do incio da
transcrição, a região do iniciator.
TFIID e sua subunidade TBP recrutam outros dois
fatores de transcrição basais para o promotor, TFIIA e
TFIIB. TFIIA não é necessário em 100% dos casos, mas
quando se associa ajuda a estabilizar a interação do
TFIIB com TFIID e o DNA.
O TFIIB, quando interage, interage com subunidades
do TFIID e com o DNA no elemento BRE. A associação
do TFIIB com seu sítio BRE e o TFIID é assimétrica, se
acredita que por isso o TFIIB é o fator que dá
direcionalidade a RNAP.
Transcrição em Eucariotos .

Em seguida, o complexo TFIIA-TFIIB-TFIID recruta a RNA polimerase para o

promotor.
A RNA Polimerase II forma um complexo de pré-iniciação com os fatores gerais
de transcrição no promotor. Quando a RNAP se associa ao promotor, se
associa por uma região em sua estrutura chamada de cauda.
A RNA Polimerase vem junto com o fator TRIIF, que vai auxiliar a estabilizar a
interação entre a RNAP, TFIIB e TFIID e DNA. O TFIIF também vai recrutar
outros fatores de transcrição que vão ser responsáveis pela transição do
complexo de pré-iniciação para u complexo de iniciação
aberto.
TFIIF recruta TFIIE, que recruta e regula TFIIH, que se
ligam ao complexo.
TFIIH tem duas atividades bioquímicas importantes:
helicase (usa a energia de hidrólise do ATP para
promover a desnaturação da fita de DNA, formando a
bolha de transcrição) e quinase (vai permitir o escape
da RNA polimerase do promotor → a cauda contém
várias repetições de uma sequência de 7 aminácidos
(heptapeptídeo) que tem resíduos de serina e trionina,
que podem ser fosforilados). A TFIIH, através da sua atividade de quinase,
fosforila o resíduo de serina 5 dessas repetições, fazendo com que a causa da
RNA pol II perca a afinidade pelos fatores de transcrição gerais no promotor
→ RNA Polimerase se solta do promotor e entra na fase de elongação.
Esses processos com TFs gerais são o que é necessário in vitro para início da
transcrição, mas in vivo,para que aconteça a transcrição são necessários
outros fatores adicionais e existe um outro complexo de proteínas que faz
parte da maquinaria basal de transcrição e se associa a RNAP, o complexo
mediador.

Complexo mediador: formado por mais de 20

subunidades, é variável entre diferentes espécies ou
células.
In vivo, olhando para maquinaria basal de
transcrição eucariótica:

Para que a RNAP

eucariótica, que é muito
grande, reconheça um
promotor, ele tem que
estar acessível, os
nucleossomos tem que
ser reposicionados.

O mediador tem uma

função importante: em
eucariotos, é comum ter a RNAP e a maquinaria de transcrição
Transcrição em Eucariotos .

associadas a um promotor mas que não estão transcrevendo, que precisam

de sinais regulatórios para iniciar a transcrição.
O mediador entra nesse papel de interpretar sinais regulatórios, atua para
promover o início da transcrição pela RNAP II.
Relembrando em bactérias:
Nas bactérias, tem um ativador
que se liga a um sítio
regulatório e interagindo
diretamente com a causa C
terminal d DNAP.

Em eucariotos, a interação com ativadores pode aumentar a afinidade e a

estabilidade da RNA pol com o promotor, mas os ativadores não interagem
diretamente com a RNA Polimerase, que está entre muitas proteínas do
complexo.

Em eucariotos, esses ativadores

fazem contato diretamente com a
maquinaria basal de transcrição,
que pode envolver tanto Fatores de
Transcrição Gerais quanto
subunidades do mediador. O
mediador serve de contato entre
um ativador ligado ao seu sítio e a
RNA Polimerase.
O mediador tem várias
subunidades diferentes, então é capaz de reconhecer ativadores e
repressores diferentes → le os sinais que estão presente e os interpreta,
passando para a RNA Polimerase, modulando sua atividade de iniciar a
transcrição. Mediador consegue justafor o TFIIH com a cauda C terminal da
RNAP, colocando o TFIIH na posição correta para fosforilar a cauda e permitir
escape do promotor.

Outras proteínas:
Além do complexo mediador e dos
ativadores, in vivo, existem outras classes
de proteína importantes para iniciar a
transcrição, que vão atuar sobre a
estrutura da cromatina.
Essas estruturas vão remodelar e
reposicionar nucleossomos , gastando ATP.
Existem enzimas modificadoras de histonas, que vão adicionar grupos
químicos às caudas amino-terminais das histonas através de modificações
covalentes.
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Essas proteínas vão ser recrutadas por ativadores, que não só são
importantes para o início da transcrição através da sua modulação do
complexo mediador, mas também através do recrutamento dessas enzimas
que vão atuar a nível da cromatina, tornando-a acessível.

Fase de Elongação:
Após o escape do promotor, os fatores
de iniciação que estavam associados a
RNAP, são substituidos por fatores de
elongação.
Existem vários fatores de elongação,
na imagem é dado o exemplo do Spt5,
que interage com a RNAP II,
aumentando sua processividade, transcrevendo sem muitas pausas, além de
promover sua atividade de correção.
Não só a RNAP tem que lidar com os nucleossomos para reconhecer um
promotor, mas a medida que vai transcrevendo vai encontrar nucleossomos
em seu caminho e precisa conseguir lidar com eles, isso é feito através de
fatores de elongação que vão recrutar complexos que vão deslocar
nucleossomos.
Tem um promotor onde a RNAP vai se associar, depois
ela vai coeçar a transcrever e encontrar um
nucleossomo no seu caminho. É possível mapear a
posição nucleossomo antes e depois da transcrição,
observando que ele muda de posição, através da ação
de algum complexo remodelador de nucleossomos.
Um dos complexos que é capaz de fazer isso é o FACT.

FACT é um complexo remodelador de nucleossomos recrutado pelo fator de

elongamento FTIIS. É um dímero de duas proteínas, SPt16 e SSRP1. No primeiro
passo, o que o FACT faz é remover do octamero de histonas o dímero
H2A-H2B. A RNAP então transcreve essa região e depois esse mesmo dímero,
associado a essa região, vai conseguir colcoar de volta o dímero H2A-H2B
remontando o nucleossomo.
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Terminação de transcrição:
É um processo completamente diferente em eucariotos e que está ligada a um
processo de poliadenilação, uma modificação que os RNAs que são
transcritos pela RNAP II sofrem depois que são transcritos, faz parte do
processamento e da maturação desses RNAs.
● O processo não é tão bem conhecido como em procariotos
● O sinal de poliadenilação leva à clivagem do mRNA sendo transcrito

Em eucariotos a terminação
está relacionada com a
clivagem do transcrito, que
acontece mais ou menos de 10 a
30 nucleotídeos de um sítio
conservado, chamado sítio de
polinilação que tem a sequência
AAUAAA.

No momento em que o RNA é transcrito, essas sequências consenso vão ser

reconhecidas por complexos proteícos que vão promover essa clivagem.

Tem a sequência do sinal de poliadenilação no DNA

e ele é transcrito para o RNA. A RNAP tem a cauda
fosforilada; quando a RNAP entra na fase de
elongação, ela deixa de estar associada aos fatores
de iniciação e passa a se associar a fatores de
elongação, proteínas que vão promover o
processamento do RNA e proteínas associadas com
a poliadenilação. Muitas dessas protéinas são
carregadas na cauda da RNAP através de interação
dessas proteínas com resíduos fosforilados.

No caso existem dois complexos envolvidos na

terminação, o CstF e CPSF, que são complexos com
várias subunidades que estão na cauda da RNAP, mas que são transferidos
para o RNA uma vez que o sítio de poliadenilação é transcrito. Isso é possível
pois o sítio de saída do RNA está justaposto a cauda. Essas proteínas
interagem tanto com a sequência conservada AAUAAA, como com a
sequência rica em GU.
Uma endonuclease, componente do CPSF vai clivar o RNA nessa posição
depois do sítio de poliadenilação.
Esse RNA vai sofrer o processamento de poliadelinação, mas vai ficar com
RNA pendurado na RNAP, que mesmo assim está continuando a transcrever.
● Após clivagem, a RNA pol continua transcrevendo, mas eventualmente
se dissocia do molde terminando a transcrição

Existem dois modelos propostos para explicar como a clivagem está

relacionada com o término da transcrição:
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Modelo do torpedo: o RNA

eucariótico quando está sendo
transcrito sofre uma outra
modificação na extremidade 5’,
que o protege da degradação por
exonucleases. Nessa cauda da
RNAP, são carregada, entre outras
proteínas, exonucleases que estão
associadas ao processo de
terminação. Quando ocorre a
clivagem, isso gera uma
extremidade de RNA que não está
protegida e é alvo da exonuclease
que está na cauda da RNAP → é
transferida e começa a degradar
o RNA no sentido 5’ 3’.
O que se acredita é que essa exonuclease va alcançar a RNAP e a empurrar
para fora do molde, causando a terminação.

Modelo Alostérico: propõe que a terminação não necessita da atividade de

exonuclease. Postula que, de alguma maneira, a transferência das proteínas
que promovem a clivagem causa uma alteração conformacional na RNA
Polimerase, fazendo com que ela fique menos processiva, perdendo sua
eficiência de transcrição e eventualmente se solta do molde.
Esses modelos não são exclusivos, podem acontece simultâneamente.