1) O que é PCR e qual sua utilidade na biotecnologia?

A PCR é uma técnica de amplificação de DNA que utiliza uma enzima chamada DNA
polimerase para produzir milhões de cópias de um segmento específico de DNA. É
amplamente utilizada na biotecnologia para uma variedade de aplicações, incluindo
diagnóstico de doenças genéticas, identificação de patógenos, análise forense, estudos de
expressão gênica, clonagem de genes e produção de proteínas recombinantes.

2) Quais são os passos de execução de um protocolo de PCR?

1- Desnaturação: a dupla fita de DNA é aquecida a uma temperatura de cerca de 95°C para
que as duas fitas se separem, formando duas fitas simples de DNA.
2- Anelamento: a temperatura é reduzida para cerca de 55-65°C para permitir que os
iniciadores (primers) específicos do gene-alvo se liguem às fitas simples de DNA.
3- Extensão: a temperatura é aumentada para cerca de 72°C para que a Taq polimerase
adicione nucleotídeos complementares às fitas simples de DNA, criando novas fitas duplas
de DNA.

Esses passos são repetidos por cerca de 30-40 ciclos, resultando em uma amplificação
exponencial do DNA alvo.

3) Qual o papel da enzima Proteinase K no procedimento?

A proteinase K quebra as proteínas e desestabiliza a membrana celular dos organismos que
estão sendo amplificados. A Proteinase K é capaz de digerir essas proteínas e romper as
células, liberando o DNA para que possa ser amplificado pela PCR.

4) Quais são os tampões utilizados para a técnica de PCR?

Os tampões de reação, fornecidos juntamente com as polimerases, possuem uma grande
diversidade de componentes. Normalmente, os tampões possuem um pH a 20oC entre 8,3
e 8,8. Possuem Tris (Tris(hidroximetil)aminometano), importante para o tamponamento,
NaCl, KCl, e outros reagentes descritos anteriormente. Deve-se observar as concentrações
de íons: até 50mM de NaCl e/ou KCl pode facilitar o anelamento dos primers (sabe-se que
concentrações de KCl maiores que isso inibem a atividade das polimerases). Ex: 10x
DreamTag Green Buffer

5) O que é Taq Polimerase? Qual sua utilidade na PCR?

A Taq Polimerase é uma enzima de DNA polimerase termoestável derivada da bactéria
Thermus aquaticus, que é capaz de sobreviver em altas temperaturas. Sua utilidade na
PCR reside na sua capacidade de sintetizar novas fitas de DNA a partir dos iniciadores de
PCR em temperaturas elevadas, tornando a técnica de PCR mais eficiente e precisa. Além
disso, a Taq Polimerase tem atividade exonuclease, permitindo a correção de erros de
incorporação de nucleotídeos durante a síntese do novo filamento de DNA.

6) Como funciona um termociclador? Quantos ciclos foram usados para a amostra de DNA
de camundongo?
O termociclador eleva e reduz a temperatura do bloco em ciclos de tempo pré-programados,
permitindo a multiplicação em massa de moléculas de DNA com a ajuda da enzima TaqDNA
polimerase e de primers, pequenos pedaços de DNA que servem para iniciar a reação,
atingindo grandes quantidades de DNA após alguns ciclos do processo. 7 ciclos foram
usados:

1°- 95°C por 5:00
2°- 95°C por 0:30
3°- 62°C por 0:30
4°- 72°C por 0:30
5°- Voltar para estágio 2 por 35x
7°- 72°C por 5:00
8°- 4° Forever

7) Descreva a técnica de eletroforese em gel de agarose.

A eletroforese, separação de moléculas carregadas em um campo elétrico, é uma técnica

essencial em qualquer laboratório e o primeiro passo em vários procedimentos. Por meio
dela, as moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a forma ou a
carga. O gel de agarose é a matriz na qual é aplicada a amostra e que permite realizar a
separação dessas moléculas. Os géis de baixa percentagem de agarose são relativamente
rígido e fáceis de manipular, sendo usados para separa moléculas grandes como o DNA e o
RNA, proteínas e complexos proteicos muito grandes. O que é preciso observar é que a
concentração do gel deve ser apropriada ao tamanho do fragmento que se está interessado
em analisar.

8) Apresente três aplicações da técnica de PCR comuns na profissão do biomédico.

1. Diagnóstico de doenças infecciosas: A PCR pode ser usada para identificar patógenos
em amostras clínicas, como sangue, urina ou tecidos, permitindo diagnósticos mais precisos
e rápidos de doenças infecciosas.
2. Genética molecular: A PCR é amplamente utilizada em estudos de genética molecular,
como análise de mutações genéticas, identificação de marcadores genéticos e investigação
de doenças genéticas.
3. Forense: A PCR é usada na análise de DNA forense, permitindo a identificação de
suspeitos em casos criminais. A técnica também pode ser usada para análise de amostras
biológicas em acidentes de trânsito, desastres naturais e casos de paternidade.