Metodologias Laboratoriais e

Moleculares em Genética
Conteúdo abordado
 Extração de DNA
 PCR
 Eletroforese
 Visualização
Detecção de moléculas específicas
de DNA, RNA e proteínas
Estudando genes individualmente ou
genomas, os geneticistas sempre precisam
detectar a presença de uma molécula
específica de DNA, RNA ou proteína
 Extração de DNA

• Coleta
• Conservação
• Envio do material para o
laboratório
Extração de DNA
Coleta

Sangue Saliva
Extração de DNA
Coleta
 REAÇÃO DE
POLIMERASE EM
CADEIA - PCR
PCR
O que é
Uma técnica para amplificar milhares de vezes uma região
específica da molécula de DNA, de aplicação ampla:
Na clínica médica, para fins diagnósticos; na identificação
de seres vivos ou mortos, a partir de amostras mínimas de
tecido (fio de cabelo, gota de sangue etc.) e em
biotecnologia.
Teste pré-natal não invasivo
PCR DNA

Primeiro ciclo

Segundo ciclo

Terceiro ciclo

Quarto ciclo
Pipeta Ependorf

Amsotras
 PCR
A reação de amplificação contém:
•Ingredientes requeridos para PCR
•DNA polimerase
•Primer
•Núcleotídeos iniciadores (dNTPs)
 PCR

Os componentes da reação são misturados em

uma amostra que é colocada em um aparelho
chamado de termociclador, que possibilita o
aquecimento e o resfriamento rápido das amostras
Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Pontos Principais:

A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma

técnica para fazer muitas cópias de uma região
específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao
invés de um organismo).

A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a

Taq polimerase, e requer primers de DNA projetados
especificamente para a região de interesse do DNA .
Na PCR, a reação é repetida ciclicamente
através de uma série de alterações de
temperatura, o que possibilita a produção de
muitas cópias da região de interesse.

A PCR tem muitas aplicações práticas e em

pesquisa. Ela é rotineiramente usada em
clonagens de DNA, diagnósticos médicos e
análises forenses de DNA.
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma
técnica rotineira de laboratório usada para fazer
muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região
específica do DNA. Essa região do DNA pode ser
qualquer objeto de interesse do pesquisador.
Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar
quantidade suficiente da região de interesse do
DNA, de modo que essa possa ser analisada e
utilizada de alguma outra maneira.
A PCR é usada em muitas áreas da biologia e
medicina, incluindo pesquisa em biologia
molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns
ramos da ecologia.
Taq polimerase
Assim como a replicação de DNA em um
organismo, a PCR requer uma enzima DNA
polimerase que faça novas fitas de DNA usando as
existentes como moldes.

A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é

chamada de Taq polimerase, em homenagem à
bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada
(Thermus aquaticus).
Primers de PCR
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase
consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado
um primer, uma sequência curta de nucleotídeos
que fornece um ponto de partida para a síntese de
DNA.
Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de
fita simples, geralmente por volta de 20
aminoácidos de comprimento. Dois primers são
usados para cada reação de PCR, e eles são
projetados de modo que englobem a região de
interesse (região que deve ser copiada).
Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser
estendidos pela polimerase, e a região que está entre eles será
copiada.
As Etapas da PCR
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a
Taq polimerase, primers, DNA molde e nucleotídeos
(blocos que compõem o DNA).

Os ingredientes são reunidos em um tubo,

juntamente com cofatores de que a enzima precisa,
e passam por repetidos ciclos de aquecimento e
resfriamento que permitem que o DNA seja
sintetizado.
Este ciclo se repete 25 - 35 vezes em uma reação típica
de PCR, que geralmente ocorre em 2 - 4 horas,
dependendo do comprimento da região de DNA a ser
copiada.

Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de

interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até
bilhões.
Uso da eletroforese em gel para visualizar os
resultados da PCR

Os resultados de uma reação PCR são geralmente

visualizados (tornam-se visíveis) através do uso da
eletroforese em gel.
Eletroforese em gel é uma técnica na qual
fragmentos de DNA são puxados por uma corrente
elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os
fragmentos de DNA de acordo com o tamanho.
Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído
para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da
PCR possa ser determinado.
Uso da eletroforese em gel para visualizar
os resultados da PCR

Fragmentos de DNA de mesmo

comprimento formam uma "banda" no gel,
que pode ser vista a olho nu se o gel for
pigmentado com um corante que se liga ao
DNA. Por exemplo, uma reação de PCR
produzindo um fragmento de 400 pares de
bases (pb) tem a aparência que segue, no
gel.
Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias
da região de interesse do DNA, não apenas uma ou
algumas cópias.
Como o DNA é microscópico, muitas cópias têm de
estar presentes antes que possamos vê-las a olho
nu.
Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser
uma ferramenta importante:
ela produz cópias suficientes de uma sequência de
DNA de modo que possamos ver ou manipular
aquela região de DNA.
Eletroforese em Gel
• Eletroforese em gel é uma técnica usada para
separar fragmentos de DNA (ou outras
macromoléculas, como o RNA e proteínas) com
base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a
passagem de uma corrente através de um gel
contendo as moléculas de interesse.
• Em função de seu tamanho e carga, as moléculas
vão se mover através do gel em diferentes direções
ou em diferentes velocidades, o que permite que
sejam separadas umas das outras.
Eletroforese em gel
Pontos Principais:
• A eletroforese em gel é uma técnica usada para
separar fragmentos de DNA de acordo com seu
tamanho.

• As amostras de DNA são carregadas nos poços

(cavidades) localizados numa das extremidades de
um gel, e uma corrente elétrica é aplicada para
fazê-las avançar pelo gel.
Os fragmentos DNA estão carregados
negativamente, então movem-se na direção do
eletrodo positivo.

Já que todos os fragmentos de DNA têm a mesma

quantidade de carga por massa, os fragmentos
menores atravessam o gel mais rapidamente do que
os maiores.

Quando um gel é pigmentado com um corante que

se liga ao DNA, os fragmentos de DNA podem ser
vistos como bandas, cada uma representando um
grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho.
Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade
de carga por massa.

Por essa razão, a eletroforese em gel de fragmentos de

DNA faz a separação baseada apenas no tamanho.
Através do uso da eletroforese, podemos ver quantos
diferentes fragmentos de DNA estão presentes em
uma amostra, e o quão grandes eles são em relação
aos outros.
Podemos também determinar o tamanho absoluto de
um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA
"padrão", composto de fragmentos de DNA de
tamanhos conhecidos.
A extremidade do gel com os poços está voltada
para o eletrodo negativo.

A extremidade sem poços (para a qual os

fragmentos de DNA vão migrar) está voltada para o
eletrodo positivo.
Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma das amostras de DNA que
queremos examinar é cuidadosamente transferida para um dos poços.

Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência

que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos.

A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel.

As moléculas de DNA têm carga negativa devido aos grupos fosfato em

seus esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas começam a se mover
através da matriz de gel, para o polo positivo.
Pedaços curtos de DNA viajam através dos poros do
gel mais rápido.

Após o gel ter corrido por algum tempo, os pedaços

mais curtos de DNA vão estar mais próximos do
polo positivo do gel, enquanto os mais longos vão
permanecer próximos aos poços.
Visualização
Uma vez que os fragmentos tenham sido
separados, podemos examinar o gel e ver quais
tamanhos de faixas são encontrados.

Quando um gel é pigmentado com um corante que

se liga ao DNA e depois colocado sob luz UV, os
fragmentos de DNA brilham, o que nos permite
visualizar o DNA presente em diferentes locais ao
longo da extensão do gel.
A linha de DNA de um gel é chamada de Banda.
Cada banda contém um grande número de
fragmentos de DNA do mesmo tamanho e todos os
que viajaram, como um grupo, para a mesma
posição.
Um fragmento único de DNA (ou até mesmo um
pequeno grupo de fragmentos de DNA) não seria
visível por si só em um gel.
Ao comparar as bandas em uma amostra à escada
de DNA, podemos determinar os tamanhos
aproximados.
EXERCíCIO
Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de
ciências forenses. Você acabou de receber uma amostra de
DNA de um cabelo deixado em uma cena de crime,
juntamente com amostras de DNA de três possíveis suspeitos.
Seu trabalho é examinar um marcador genético em particular
e verificar se algum dos três suspeitos coincide com o DNA do
cabelo para esse marcador.
O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém
uma única repetição (região marrom abaixo), enquanto o
outro contém duas cópias da repetição. Em uma reação PCR
com primers que atuam na região de repetição, o primeiro
alelo produz um fragmento de DNA de 200 bp, enquanto o
segundo produz um fragmento de DNA de 300 bp:
Você faz uma PCR nas quatro amostras de DNA
e visualiza os resultados por eletroforese em gel,
como representado abaixo:
Eletroforese

Cientista com pipeta carregando gel de DNA em laboratório

Analisando o processo da técnica do PCR, você
pode estar se perguntando: essa amplificação do
número de moléculas do DNA-molde serve para
quais pesquisas? O avanço da técnica de PCR
possibilitou o desenvolvimento de metodologias
para o acompanhamento de amplificação do DNA,
como identificação genética, amplificação de
regiões específicas do genoma ou de transcritos,
análise de polimorfismos de DNA, diagnósticos de
doenças genéticas e infecciosas, medicina forense,
controle de qualidade industrial, entre outros.
Visualização
 Para analisar os resultados do
experimento de eletroforese em gel é
preciso corar o DNA no próprio gel, a
fim de que o torne visível. O brometo
Visualizaçã de etídio é um dos compostos que se
o ligam a uma molécula de DNA presente
no gel e, quando submetido à luz
ultravioleta (UV), fluoresce em cor
avermelhada. Atualmente, os
laboratórios utilizam corantes não
mutagênicos que coram o DNA de verde
ou azul, e alguns deles não necessitam
de luz UV para serem visualizados; já o
brometo de etídio é um poderoso e
perigoso mutagênico e sua radiação
pode causar queimaduras severas.
Bibliografia recomendada
• GRIFFITHS, A. J. F.; WESSLER, S. R.; CARROLL, S. B.; DOEBLEY,
J. Introdução à Genética. 11 ed. Rio de Janeiro: Grupo GEN, 2016.
• MENCK, C. F. M. Genética Molecular Básica. Rio de Janeiro: Grupo
GEN, 2017.
• WATSON, J. D.; BAKER, T. A.; BELL, S. P.; GANN, A.; LEVINE, M.;
LOSICK, R. Biologia Molecular do Gene. Porto Alegre: Grupo A,
2015.
• SCHAEFER, G. B.; THOMPSON, J. Genética Médica: uma
abordagem integrada. Porto Alegre: Grupo A, 2015
• PIERCE, B. A. Genética - um enfoque conceitual. 5 ed. Rio de
Janeiro: Grupo GEN, 2016.
• SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de Genética. 7 ed.
Rio de Janeiro: Grupo GEN, 2017.