Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre

Curso de Farmácia
Disciplina de Biologia Molecular

Exercícios: Extração de ácidos nucleicos, PCR e Eletroforese

Nome: Bruno Farias Carvalho Data de realização 22 a 24/11/2023

1. Na eletroforese de ácidos nucléicos são utilizados dois tipos de corantes: (a) corante de migração (ou
tampão de amostra) e (b) corante para visualização de DNA. Cite um exemplo de cada um dos dois
corantes e explique por que são utilizados.

Resposta: um exemplo de corante de migração é o azul de bromofenol. Ele possui carga elétrica
contrária ao do DNA, assim na eletroforese é utilizado como indicador visual da corrida
eletroforética, migrando na direção oposta ao DNA. Sobre o corante para visualização de DNA, temos
o brometo de etídio. Ele é usado para possibilitar a partir da luz UV a visualização do DNA, podendo
ser utilizado também para avaliação do tamanho e quantidade dos fragmentos.

2. Explique como ocorre a reação em cadeia da polimerase (PCR) descrevendo o papel de cada um dos
componentes essenciais para esta reação:

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica molecular amplamente utilizada para
amplificar quantidades específicas de DNA. A PCR é um processo in vitro que replica, de maneira
exponencial, uma região específica do DNA. A reação é realizada em um termociclador, um
equipamento que permite controlar a temperatura em diferentes etapas do process o

DNA alvo: Sequência desejada para amplificação.

Primers: Pequenos fragmentos de DNA iniciadores.
Nucleotídeos: Blocos de construção do DNA (A, T, C, G).
DNA polimerase: Enzima que sintetiza o novo DNA.
Cofatores e íons: Essenciais para atividade enzimática.

A PCR envolve ciclos de desnaturação, anelamento e extensão, realizados em um termociclador. A

DNA polimerase, como a Taq, é termoestável, permitindo a replicação em altas temperaturas. O
resultado é uma amplificação exponencial da sequência alvo. A PCR é amplamente utilizada em
diferentes áreas de estudo na saúde.

3. Calcule a concentração resultante, em pmoles/l, de 67,3 nmoles de um primer liofilizado após diluição
com 1000 l de água estéril (miliQ ou para injetáveis). Esta diluição gerou uma solução denominada
solução estoque.
Calcule o volume de solução estoque (acima) necessário para preparar 200l solução trabalho na
concentração de 10 pmoles/l.

Concentração resultante após diluição:

67,3nmoles/µl×1000µl=C2×(1000µl+1000µl)
67300=C2×2000
C2=673002000C2=200067300
C2=33,65 nmoles/µlC2=33,65nmoles/µl

Volume necessário para preparar a solução de trabalho:

V= C do trabalho. V do trabalho/C do estoque

V= 10pmoles.200μl/ 33,65pmoles/μl
Volume aproximado= 59,34 μl

Portanto, para preparar 200 μl da solução de trabalho com uma concentração de 10 pmoles/μl, será
necessário aproximadamente 59,34 μl da solução estoque.
4. Sobre o processo de extração de DNA, julgue os itens abaixo e assinale a alternativa correta:
I- O detergente é a substância responsável por dissolver a parede celular, liberando o DNA.
II- O sal é responsável por aglutinar o DNA, formando uma massa filamentosa e esbranquiçada.
III- O uso de luvas somente é necessário, nesta prática, quando houver agentes patogênicos envolvidos.

(a) I e II estão corretas. (d) I, II e III estão corretas.

(b) I e III estão corretas. (e) nenhuma das alternativas.
(c) II e III estão erradas

5. Sobre a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), responda:

A – A PCR ocorre em um termociclador. Este equipamento proporciona modificações de temperatura de
uma forma controlada, em outras palavras, este equipamento executa os ciclos das reações. Descreva
quais são estas etapas e o que acontece em cada uma delas:
B – Na PCR, o que irá determinar o tamanho dos fragmentos que serão amplificados? Explique:

A. Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):

a) A PCR ocorre em um termociclador e consiste em ciclos repetidos de três etapas: desnaturação,

onde as fitas de DNA se separam; anelamento, onde primers se ligam às sequências alvo; e
extensão, onde a DNA polimerase sintetiza novas cadeias de DNA.

b) O tamanho dos fragmentos amplificados na PCR é determinado pelos primers escolhidos, que se
ligam a regiões específicas nas extremidades do DNA alvo. A distância entre esses primers
controla o tamanho do fragmento amplificado, sendo a escolha dos primers crucial para o
design experimental.

6. Com relação à eletroforese de ácidos nucléicos, assinale verdadeiro (V) ou falso (F) para as afirmações
que seguem:
(V) O corante brometo de etídeo permite a visualização do DNA porque se intercala entre a dupla fita e é
fluorescente sob luz ultra-violeta.
(V) Eletroforese de DNA é um método através do qual fragmentos de DNA de diferentes tamanhos são
separados à medida que migram do pólo positivo para o pólo negativo através de um suporte (gel de
agarose ou acrilamida).
(F) A técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida é preferencialmente utilizada quando os
fragmentos que devem ser separados diferem em mais de 100pb.
(V) A adição do agente de alta densidade (sucrose ou glicerol) ao corante de migração tem como
objetivo proporcionar que e mistura produto de PCR+corante seja adicionada no “pocinho” dos géis.
(F) A eletroforese em gel de agarose é a única técnica que permite verificar o resultado de uma PCR em
tempo real (qPCR).

7. A reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser empregada no diagnóstico de:

 (a) Doenças genéticas e doenças causadas por microorganismos como bactérias, virus e
protozoários.
(b) Doenças genéticas e doenças causadas por bactérias e virus, mas não daquelas causadas por
protozoários.
(c) Doenças genéticas e doenças causadas por virus, mas não para aquelas causadas por bactérias e
protozoários.
(d) Doenças causadas por microorganismos como bactérias, virus e protozoários, mas não para doenças
genéticas.
(e) Doenças genéticas apenas.

8. Como funciona a técnica de Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)?

Ressalte os pontos nos quais ela se diferencia de uma PCR clássica.

A técnica de Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) combina a transcrição

reversa (síntese de DNA a partir de um molde de RNA) com a amplificação do DNA por PCR. Essa
técnica é frequentemente usada para estudar a expressão gênica e para a detecção de RNA específico
em uma amostra.
Pontos nos quais ela se diferencia:
Transcrição Reversa: Na RT-PCR, o primeiro passo é a transcrição reversa, onde o RNA é convertido em
DNA complementar (cDNA) pela enzima transcriptase reversa. Essa etapa é crucial quando se trabalha
com RNA, pois a PCR tradicional amplifica DNA, não RNA.
Amplificação do cDNA: Após a transcrição reversa, o cDNA gerado é então amplificado pela PCR. Os
primers utilizados na amplificação são projetados para se ligar ao cDNA, permitindo a amplificação
seletiva do gene de interesse.
Controle Negativo: Devido à possibilidade de contaminação com DNA genômico durante a extração de
RNA, a RT-PCR geralmente inclui um controle negativo no qual não é adicionada transcriptase reversa
durante a síntese de cDNA. Isso permite verificar se a amplificação está ocorrendo a partir de cDNA e
não de DNA genômico residual.
Detecção de RNA: A RT-PCR é particularmente útil para detectar a presença e quantificar a quantidade
de RNA específico em uma amostra. Isso é essencial para estudar a expressão gênica e a regulação
gênica.

9. Sobre o sequenciamento de DNA, explique:

A- Por que o método de Sanger também é chamado de método de nucleotídeos terminadores de cadeia?
Porque ele utiliza dideoxinucleotídeos (ddNTPs) como bloqueadores da cadeia de DNA durante a
síntese, encerrando a cadeia quando incorporados e permitindo a determinação da sequência .

B- A reação de marcação do DNA a ser sequenciado, também chamada thermal cycle sequencing, é
idêntica a uma reação em cadeia da polimerase, tanto nos reagentes utilizados quanto nas condições
de reação (temperaturas e tempos dos ciclos)? Explique.
A reação de marcação do DNA para sequenciamento, também conhecida como sequenciamento por
ciclo térmico, é semelhante à PCR, usando a enzima DNA polimerase para sintetizar uma cadeia
complementar. Entretanto, difere nas condições de reação, visando a determinação precisa da
sequência da cadeia de DNA. Na reação de sequenciamento, uma mistura de ddNTPs marcados e dNTPs
normais é usada. A reação ocorre em ciclos de desnaturação, anelamento e extensão, com baixa
concentração de ddNTPs para permitir a incorporação ocasional de dNTPs, gerando cadeias de
diferentes comprimentos e permitindo a determinação da sequência .

C- O que possibilitou a combinação das 4 reações de marcação com dideoxinucleotídeos em uma mesma
reação de sequenciamento, permitindo, assim, a automatização da técnica?

A combinação das quatro reações de marcação com dideoxinucleotídeos em uma única reação de
sequenciamento é possível pelo uso de fluoróforos diferentes para rotular os ddNTPs de cada base (A,
C, G, T). Cada ddNTP é marcado com uma cor distinta, facilitando a identificação da base durante a
eletroforese capilar. A automação é alcançada com sequenciadores automáticos de DNA, que detectam
sinais fluorescentes e geram a sequência automaticamente, tornando o processo mais eficiente que os
métodos manuais anteriores.
 10. Relacione os problemas possíveis em uma eletroforese, descritos na parte A da questão, com o melhor
método para a resolução do problema ou com a explicação do que ocorreu (descritos na parte B). Há
apenas uma solução para cada problema.
Parte A:
(E) Após misturar a amostra com o tampão de corrida (solução de azul de bromofenol), você pipeta esta
mistura no gel de agarose para fazer a eletroforese, mas embora você tenha certeza que adicionou a
mistura aos “pocinhos” do gel, a solução sobe para a superfície do tampão da cuba.
(D) Após efetuar uma eletroforese, você coloca o gel em um transiluminador, no entanto, você não visualiza
nenhuma banda no gel, nem mesmo as bandas do marcador de peso molecular.
(A) Ao iniciar uma eletroforese em gel de agarose, você percebe que a migração está ocorrendo na direção
contrária ao esperado.
Parte B:
(a) Os cabos que ligam a fonte a cuba estão trocados.
(b) Você deve adicionar mais corante no tampão de migração.
(c) O gel está com concentração inadequada.
(d) O gel foi confeccionado sem brometo de etídio.
(e) Você deve utilizar mais tampão.
(f) Você está utilizando a pipeta errada.
(g) Você deve adicionar mais sucrose ou glicerol no tampão de migração.Na técnica de RT-PCR:
(a) A RNA polimerase é empregada para a síntese de RNA.
(b) Ocorre a síntese de cDNA a partir de um RNA dupla-fita.
(c) É essencial a presença de uma cauda poli(A) para que o primer oligo(dT) anele no RNA molde.
(d) Na primeira etapa da reação, a RNA polymerase é empregada para sintetizar a primeira fita de cDNA, e
na segunda etapa a Taq DNA polimerase sintetiza a segunda fita.
(e) A segunda etapa da reação é muito semelhante à PCR convencional, empregando dNTPs, primers,
tampão, Taq DNA polimerase e água, tendo como molde a primeira fita de cDNA.

11. Na extração de DNA do morango, feita em aula prática, foram utilizados os seguintes reagentes. Quais
as suas funções?

A)Detergente: utilizado para quebrar as membranas lipídicas das células do morango, incluindo a
membrana plasmática e as membranas das organelas celulares. Isso resulta na liberação do conteúdo
celular, incluindo o DNA, para o meio de extração.

B) Sal Grosso: é utilizado para precipitar as proteínas da mistura. O sal aumenta a salinidade da
solução, reduzindo a solubilidade das proteínas. Isso leva à formação de uma junção de proteínas que
podem ser removidas por centrifugação, deixando o DNA em solução.

C) Álcool: é utilizado para precipitar o DNA. Quando o álcool é adicionado à solução contendo o DNA,
este se torna insolúvel na solução alcoólica e forma fios visíveis. Esses fios de DNA podem ser
facilmente retirados da solução.
12. O ciclo térmico básico da PCR inicia-se a uma certa temperatura, prossegue para outra e finalmente vai
para uma terceira, quando então recomeça, por pelo menos 25 vezes. Quase estas temperaturas (na
ordem descrita acima) e o que ocorre nelas?
a) 56 o C – pareamento dos primers; 96 o C – extensão de fita pela Taq; 72 o C – desnaturação da fita dupla.
b) 96 oC - desnaturação da fita dupla; 56 oC – pareamento dos primers; 72 oC – extensão de fita pela Taq
c) 96 o C - desnaturação da fita dupla; 72o C – pareamento dos primers; 56o C – extensão de fita pela Taq
d) 72 o C – pareamento dos primers; 56 o C – extensão de fita pela Taq; 96 o C - desnaturação da fita dupla.
e) 96 o C - desnaturação da fita dupla; 72o C – extensão de fita pela Taq; 56 o C – pareamento dos primers.

13. Se a menor temperatura de um ciclo de PCR for reduzida de 56o C para 45 o C, o que provavelmente
ocorrerá? Por quê?
a) A reação não se processará devido ao esgotamento dos primers através de hibridizações múltiplas não
específicas
b) A banda observada no gel terá menor peso molecular porque a Taq DNA polimerase trabalhará mais
lentamente.
c) Outras bandas poderão aparecer no gel como resultado de hibridizações dos primers com
novos sítios, com baixa especificidade.
d) A banda formada terá maior peso molecular devido à reação anômala da Taq DNA polimerase, que
incorpora resíduos de adenina a baixa temperatura.
e) Não serão formadas bandas porque com a queda da temperatura abaixo de 50o C o DNA se renatura por
inteiro e impede a nova hibridização de primers.

14. A apolipoproteína AI é uma proteína presente em lipoproteínas, especialmente em lipoproteínas de alta

densidade (HDL). Para investigar uma mutação na posição 83 do RNA mensageiro, você desenhou o
seguinte conjunto de primers:

APOAI-1: AGG GAC AGA GCT GAT CCT TGA ACT CTT AAG
APOAI-2: TTA GGG GAC ACC TAG CCC TCA GGA AGA GCA
Os primers sintetizados estavam liofilizados nas seguintes concentrações:
APOAI-1: 37,0 nmoles e APOAI-2: 41,2 nmoles
a. (0,5) Adicionando 1000 l de água estéril para confeccionar a solução estoque, qual a
concentração resultante em pmoles/l?
Concentração= pmoles/µl

Quantidade total=37,0nmoles+41,2nmoles
Quantidade total=78,2 nmolesQuantidade total=78,2nmoles

Concentração resultante=78,2 nmoles/1000μL

Concentração resultante=0,0782 pmoles/µl

b. (0,5) Calcule o volume de solução estoque necessário para preparar 200l solução trabalho
na concentração de 10 pmoles/l:

Volume estoque (µl)=Concentração estoque (pmoles/µl)Quantidade desejada (pmoles)

Volume estoque=0,0782pmoles/µl200μl×10pmoles/µl
Volume estoque≈2560,54μl

c. (0,5) Calcule a temperatura de anelamento para cada um dos primers.

Tm=4.(A e T)+2.(G e C)

APOA1-1: A= 9, T=7, G= 8, C= 6
Tm= 4. (16) + 2.(14)
Tm= 92 °C

APOA1-2: A=9, T=4, G= 9, C=8

Tm: 4.(13) + 2. (17)
Tm: 60 °C