Reação em Cadeia da DNA Polimerase e Eletroforese

Essa técnica possibilta a síntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA

polimerase que sintetiza uma sequencia complementar de DNA desde que um
pequeno fragmento – o primer ou iniciador, já esteja ligado a uma das cadeias de DNA
. Os iniciadores definem a sequencia a ser replicada e o resultado obtido é a
amplificação de uma determinada sequencia de DNA com bilhões de cópias. Suas
aplicações são imensas: é usada no diagnóstico médico, mapeamento genético,
detecção de doenças hereditárias, clonagem de genes, testes de paternidade,
identificação de “impressões digitais” genéticas. Objetivo: Amplificar
exponencialmente um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade
mínima.

Aplicações:

- investigação forense

- antropologia

- paternidade

- linhagem animais

- identificação de patógenos

- identificação de doenças

- transgenia

- identificação de restos humanos

O ciclo da Reação em cadeia da polimerase decorre em três estágios que se repetem

um número específico de vezes:

1. Desnaturação das fitas de DNA – desnaturação da fita dupla de DNA

2. Hibridização ou Annealing – hibridização dos primers com a cadeia de DNA
previamente desnaturada em sequências específicas e complementares. A escolha
criteriosa dessa temperatura permite que os primers se liguem à sequencia alvo com
maior especificidade.

3. Extensão – amplificação do DNA (formação do amplicon).

A Reação em cadeia da polimerase, ocorre no Termociclador, aparelho capaz de

controlar e alternar a temperatura durante o períodos programados de tempo para o
número apropriado de ciclos de PCR , geralmente entre 30 e 40 ciclos. O passo final é
a análise do produto de reação. Esta pode ser feita através de eletroforese em gel de
poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de agarose, corado por
brometo de etídio. Em qualquer uma delas, o material amplificado é visualizado como
uma banda, a ser analizada de acordo com o seu peso molecular.

A eletroforese consiste na separação de moléculas ionizadas, de acordo com suas

cargas elétricas e pesos moleculares em campo elétrico. Moléculas orgânicas como
RNA, DNA e proteínas são separadas pela migração destas em um gel durante a
aplicação de um potencial elétrico. O princípio da eletroforese utilizada para separação
de DNA, por exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA (conferida pelos
grupamentos fosfatos). Sendo assim, as moléculas de DNA tendem a migrar em
direção ao pólo positivo (cátodo).

Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o eletrodo na
velocidade ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e a carga
líquida da molécula. A mobilidade eletroforética é também inversamente proporcional
ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua vez, é função do tamanho e forma
da molécula, e da viscosidade do meio.

A eletroforese em gel de agarose é o método padrão usado para separar, identificar,

analisar , caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é capaz de separar
misturas de fragmentos de DNA que não podem ser separados por outros meios, tais
como centrifugação com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentação.
A localização do DNA no gel pode ser determinada diretamente.

Os géis de agarose são, geralmente, corados com soluções de brometo de etídio

(EtBr), uma substância intercalante que revela os ácidos nucléicos ao fluorescer sob
luz ultravioleta. Concentrações de até 1ng de DNA podem ser visualizadas por exame
direto do gel na luz ultravioleta.

Vantagens da PCR convencional (Mullis,1986)

• sensibilidade

• versatilidade

– acessar diferentes genes simultaneamente

• custo insignificativo dos primers

• confiabilidade

• comparações de resultados entre

experimentos (existência de controles adequados)

• controles adequados

Desvantagens da PCR (Mullis,1986)

• etapas de otimização para cada abordagem a ser avaliada

– temperatura de pareamento

– nº de ciclos

– quantidade de primers

PCR quantitativo (real time)

• muitas similaridades com a PCR (Mullis,1986) – emprego de primers, DNAs molde,

polimerase e nucleotídeos
• diferenças com a PCR (Mullis, 1986)

– máquina especial – corantes especiais – procedimentos de otimização diferentes.

Vantagens na utilização de reações de PCR em tempo real.

O método qualitativo, que era aplicado como semiquantitativo antes da criação

do PCR em tempo real, é baseado na amplificação das sequências-alvo seguidas por
eletroforese em gel de agarose para detecção do DNA amplificado com um corante
capaz de intercalar no DNA e fluorescer sob exposição à luz ultra-violeta, tal como o
brometo de etídio. Esta metodologia possui inúmeras desvantagens, dentre elas
podemos destacar o fato de permitir a detecção dos produtos de reação apenas no
final de todos os ciclos de termociclagem (entre 25 e 30 ciclos), momento no qual o
DNA-alvo se encontra amplificado em condições de saturação. Mesmo após correção
pela intensidade de expressão de genes endógenos utilizados como controle da
reação, “housekeeping”, muitas vezes não é possível detectar diferenças na
expressão de determinados genes, não sendo possível observar diferenças reais
de expressão gênica. Portanto, em estudos de análises de PCR semiquantitativa
deve ser realizada uma padronização do número de ciclos de termociclagem para
detecção da reação no início da fase exponencial de amplificação de cada amostra, o
que é bastante variável e pode resultar em falso-negativos.

Na PCR semiquantitativa a reação só pode ser visualizada em altos ciclos de

amplificação, isto é, em condição de saturação, consequentemente, pequenas
diferenças de expressão gênica dificilmente podem ser detectadas em tal ensaio.

A técnica de PCR em tempo real, por sua vez, permite a detecção do DNA
amplificado, ciclo a ciclo, com elevada sensibilidade e especificidade da intensidade de
fluorescência emitida em decorrência da amplificação da sequência de DNA-alvo,
possibilitando a análise comparativa da expressão de tal gene entre as amostras logo
no ínício da fase exponencial de amplificação, em que não há saturação da
amplificação, eliminando um viés da técnica semiquantitativa.

• corantes fluorescentes

– SYBR green – Applied Biosystems – TaqMAN – Applied Biosystems

• usos do PCR tempo real

– análise de expressão gênica

– análise de “splice” alternativo

– carga viral (diagnósticos clínicos)

– analise de mutações

– discriminação alélica

– detecção de transgênicos