FASES DA PCR:
REAL (qPCR)
AMPLIFICAÇÃO DA
SEQUÊNCIA ALVO
Exponencial:
 Fase de alta eficiência
Linear:
 Fase de baixa eficiência
Platô:
 Fase sem amplificação
 Posteriormente ocorre a detecção
em gel
 Perda da atividade da enzima
 Todas as enzimas disponíveis estão
ocupadas com a síntese de DNA
 Acúmulo de produtos amplificados
tendem a parear entre si, em
detrimento do pareamento com os
iniciadores
 Acúmulo de pirofosfato (resultante
das ligações fosfodiéster)
TRANSCRIÇÃO REVERSA
 mRNA → cDNA
 Permite a análise de transcritos
(mRNA)
 Análises fenotípicas de expressão
gênica
 Baixa sensibilidade e resolução
 Pobre discriminação entre os
produtos amplificados
VARIAÇÕES DA PCR: qPCR
 PCR QUANTITATIVA EM TEMPO
- Baseado na PCR convencional
(presença de fluoróforos)
- Sinal fluorescente ao longo dos
ciclos
- Análise de dados durante todo o
processo (Real-Time)
Brometo de etídeo intercalado na dupla fita
de DNA
 Provoca mudanças na conformação
e na flexibilidade da molécula de
DNA
Na visualização dos produtos em géis
(eletroforese), a cada ciclo, o número de
cópias aumenta
TIPOS DE PCR
 "Real-time PCR"
- Detecção dos produtos de PCR
com fluoróforo Sybr Green
- Quanto mais fluorescente, mais
produto de PCR foi gerado (é
proporcional)
- Ct (Cycle Threshold) é o número
de ciclos em que a fluorescência
detectada ultrapassa o limite da
fluorescência basal
 PCR Multiplex
- Mais de um segmento genômico
é amplificado numa única reação,
cada um com seu par de primers
específico
- Investigação de paternidade
- Diagnóstico de doenças
- Identificação de transgênicos
  Nested PCR
- Duas etapas (rounds) de
amplificação (concomitantes ou em
duas reações separadas)
- Utiliza-se o produto de uma PCR
anterior com um par de primers
internos ao par utilizado na
primeira reação (PCR do produto
da PCR)
RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
 Estuda o VNTR (Variable Number of
Tandem Repeats) através da
hibridização de sondas multilocais
ou unilocais
 Utilizada no exame de investigação
de paternidade
 Precisa muito DNA (íntegro)
 É mais lenta
 A determinação dos alelos
observados não é precisa (dificulta
comparações)
 Taxa de mutação muito mais
elevada que dos loci STR, o que
aumenta a chance de falsas
exclusões de paternidade
 É mais polimórfica, sendo mais
informativa
PCR-STR (Polymerase Chain Reaction)
 Estuda os locus (loci) STR (Short
Tandem Repeat) pela amplificação
destes
 Necessita de pouco DNA (permite a
utilização de pequenas amostras)
 Determinação simultânea do sexo
dos indivíduos testados (evita uma
possível troca de amostras)
 É mais rápida
 A análise dos resultados baseia-se
na determinação exata dos alelos
através da comparação direta com
escadas alélicas definidas e
validadas internacionalmente
(significativamente mais precisa)
 Facilidade de montar bancos de
dados da população local
 Menor taxa de mutação
 Menor preço e polimorfismo
 Possui muito mais marcadores
validados que a técnica de RFLP-
VNTR
Exemplos:
 Síndrome de Angelman e Prader-
Willi por PCR
 Estudo molecular gene cKIT
(mutação D816V)
- Altera um domínio de ativação da
atividade quinase, sendo comum
na mastocitose, em tumores do
estroma gastrintestinal e na
leucemia mieloide aguda)
 Pesquisa molecular de
cromossomo x-frágil
Ms-PCR
 Reação em cadeia da polimerase
sensível a metilação
Síndrome do X-Frágil
 Alterações presentes no
cromossomo X (Gene FMR1 -
Síndrome de Martin-Bell)
 Causa mais comum da deficiência
intelectual hereditária
 Acomete mais homens