20/11/2011

PRINCÍPIOS DA qPCR: Conceitos Básicos

Carolina Morgante
Embrapa Semiárido
carolina.morgante@cpatsa.embrapa.br

PCR (Reação em cadeia da polimerase)

1º ciclo PCR: Gráfico de amplificação

2º ciclo

3º ciclo

4º ciclo

Fases da PCR

Linear PCR convencional

Baixa eficiência
Platô
Sem amplificação
Log [DNA]

Detecção em gel de
brometo
Exponencial
Alta eficiência

No de Ciclos

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PCR quantitativa (qPCR)

Linear
Baixa eficiência
Platô
Sem amplificação
Log [DNA]

qPCR

Exponencial Detecção em tempo real

Alta eficiência usando fluoróforos

No de Ciclos

Evitar RT-PCR para designar real time PCR. Utilizar qPCR e

RT-qPCR para a reação que tem cDNA como alvo.

PCR CINÉTICA

HIGUCHI, R.; DOLLINGER, G.; WALSH, P.S.; GRIFFITH, R.

Simultaneous Amplification and Detection of Specific DNA Sequences,
Nature Biotechnology, vol, 10, p, 413-417, 1992.

HIGUCHI, R.; FOCKLER, C.; DOLLINGER, G.; WATSON, R. Kinetic PCR

Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions. Nature
Biotechnology, vol. 11, p. 1026 – 1030, 1993.

PCR CINÉTICA

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Sistemas de detecção para qPCR

Sistemas de Detecção - SYBR Green

• Molécula fluorescente que se liga preferencialmente à molécula de DNA de

fita dupla

• Assim como BrEt, é um agente intercalante na molécula de DNA de fita

dupla, porém chega a ser 25 vezes mais sensível que o BrEt

• Molécula estável em uma grande amplitude de temperatura (apenas 6%

de sua atividade é perdida nos primeiros 30 ciclos de amplificação)

Sistemas de Detecção - SYBR Green

1- Quando excitado, o SYBR Green 2- Durante a desnaturação do DNA, o SYBR

fluoresce se ligado ao DNA fita dupla. Green é liberado e seu sinal reduzido.

Emissão de
fluorescência
excitação
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3- A hibridização dos primers inicia a síntese 4- Ao final do ciclo o SYBR Green liga-se ao
de uma nova fita e a fluorescência do SYBR DNA fita dupla e um incremento no sinal da
Green é detectada. fluorescência é detectado.

excitação Emissão de
fluorescência

A detecção da fluorescência é realizada ao final da fase de extensão

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Sistemas de Detecção - SYBR Green

• Liga-se não – covalentemente ao DNA, interagindo com a cavidade menor da

molécula, e não interfere na atividade da DNA polimerase e nucleases

• Liga-se à molécula em proporções lineares (quanto maior a molécula, maior

será a intensidade da fluorescência), porém preferencialmente a GC

• O uso do sistema multiplex é limitado

• Inespecífico – liga-se a qualquer molécula de DNA de dupla fita

Princípio de Captação

Definições: Repórter e molécula captadora (quencher)

• Repórter: molécula que emite luz a um certo comprimento de onda

após ter absorvido luz em comprimento de onda específico. O
comprimento de onda de emissão é sempre maior do que o de
absorção.

• Molécula captadora: aceita a energia de um fluoróforo na forma de

luz e dissemina esta energia na forma de luz ou calor.

Princípio de Captação

Repórter
Absorve energia e é promovido para um estado de maior excitação. Na
ausência da molécula captadora, o fluoróforo volta ao estado inicial de
energia e o excesso de energia é liberado na forma de fluorescência.

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Princípio de Captação

Repórter – Exemplo: SYBR Green

Princípio de Captação (FRET, fluorescence

resonance energy transfer)
• Transferência de energia dependente da distância, sem emissão de
fóton, entre uma molécula doadora e uma aceptora;

Sistemas de detecção – 5’ nuclease assay

(TaqMan)

Molécula
Repórter captadora
(quencher)

• Sondas são constituídas por uma sequência específica de nucleotídeos com

fluorescência repórter ligada a uma extremidade e molécula captadora na
extremidade oposta.

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Sistemas de detecção – 5’ nuclease assay

(TaqMan)
FASES da PCR

5’ 3’
Desnaturação
do DNA
3’ 5’

5’ 3’
5’
5’
3’ 5’

Amplificação da fita senso (sem sonda) Amplificação da fita antisenso (com sonda)

Sistemas de detecção – 5’ nuclease assay

(TaqMan)

5’
• Na etapa de extensão, a DNA polimerase,
3’ 5’ que possui atividade exonucleásica, cliva
por hidrólise a sonda.

• O sinal do repórter não é mais captado

pela molécula captadora e sua
fluorescência é liberada.

• A intensidade da fluorescência aumenta

com o acúmulo do produto de
amplificação.

• A detecção da fluorescência é realizada

durante a fase de extensão.

Sistemas de detecção para qPCR

TaqMan (sonda de hidrólise) SYBR Green

Química Sonda fluorogênica para detectar
produtos de PCR específicos
Especificidade Detecta amplicons específicos
Principais Reação específica, redução de
vantagens backgrounds e falso positivos,
permite multiplex
Fluoróforo que se liga
especificamente à fita dupla de DNA
Detecta todas dsDNA, inclusive
produtos inespecíficos
Não há necessidade de sonda
(redução de gastos), é universal,
sensível em sua detecção

Desvantagens Sonda deve ser sintetizada para Pode gerar sinais falso- positivos,
cada amplicon (aumenta gastos) exige realização de curva de
dissociação

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Sistemas de detecção – Molecular Beacon

- Quando não ligada à molécula alvo, a

sonda forma uma estrutura em grampo
pela complementaridade de sequências
nas extremidades 5’ e 3’.

Sistemas de detecção – Molecular Beacon

A elevação da temperatura promove a desnaturação do DNA e

há sinal de fluorescência.

Sistemas de detecção – Molecular Beacon

A temperatura é reduzida e primer e sonda ligam-se à fita de

DNA complementar.

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Sistemas de detecção – Molecular Beacon

Na fase de extensão, a temperatura é elevada e a sonda

dissocia-se de seu alvo.

Sistemas de detecção – Molecular Beacon

Sistemas de detecção – Molecular Beacon

Pode ser usado para:

• Detecção de SNP

• Detecção de ácidos nucléicos

• Ensaios de quantificação

• Discriminação de alelos

• Diagnósticos clínicos

• Ensaios em multiplex

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Sistemas de detecção – Molecular Beacon

Design de sondas para a detecção de mutantes

Pohl &Shih, Expert Rev. Mol. Diagn, 4 (1):41, 2004

Sistemas de detecção – Scorpions

Bloqueador
Complementary
sequence

- Combina primer, na extremidade 3’, e sonda em grampo na extremidade 5’

em uma única molécula

Sistemas de detecção – Scorpions

Após a desnaturação do DNA, o primer se liga à molécula

alvo e ocorre a síntese de uma nova fita.

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Sistemas de detecção – Scorpions

- Após a fase de extensão, a temperatura

é elevada, ocorre a desnaturação do
DNA.

- A temperatura é reduzida e a sonda se

liga por complementaridade à nova fita.

- O fluoróforo distancia-se da molécula

captadora e há emissão de fluorescência

Fluoróforos disponíveis para qPCR

Escolhendo o sistema de detecção

Tipo de experimento

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Brochure/fluorescent_dna_probes.Par.0001.File.tmp/fluoresc
ent_dna_probes.pdf

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Escolhendo o sistema de detecção

Compatibilidade Repórter x Molécula aceptora

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Brochure/fluorescent_dna_probes.Par.0001.File.tmp/fluoresc
ent_dna_probes.pdf

Escolhendo o sistema de detecção

Compatibilidade Equipamentos x Fluoróforos

Conceitos Importantes

+ Rn
Log [DNA]

ΔRn
Threshold Rn

- Rn
Linha de base Ctr sem DNA

0 Cq 40
No de ciclos

Rn (repórter normalizado) = sinal alvo/sinal referência passiva (Rox)

ΔRn (Rn corrigido pela linha de base) = Rn – linha de base

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Fluorescência passiva (ROX)

• Emitida por um fluoróforo de referência

• Quantificação não deve variar durante as fases da reação e entre amostras

Baseline (Linha de fundo)

• Indica a fluorescência de fundo, aquela emitida pelos

componentes da reação, como água, tampão, tubos etc.

Baseline (Linha de fundo)

• Medida a partir do 3º ciclo da qPCR

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Características dos primers

SYBR Green e TaqMan

• Tamanho: 18-30 bases

• Conteúdo de GC: 45-55% (ideal é 50%)

• Temperatura de dissociação (Tm): Calculada como

2( número de A+T)+ 4(número de G+C)
Deve estar entre 55-60˚C
Diferença entre Tm dos primers FWD/REV deve ser menor
que 4 ˚C (ideal menor que 1 ˚C)

Características gerais dos primers

SYBR Green e TaqMan

EVITAR:

• Mismatches entre primers e sequência alvo, especialmente

na região 3´do primer.

• Sequências repetitivas, especialmente G ou C na região 3`

• Complementaridade intra e entre primers, evitando a

formação de hairpins e dímeros, especialmente de 2 ou
mais pares de bases na região 3´do primer

Mascaração de primers

• Checar se os primers estão em uma região repetitiva ou

se amplificam mais de um loco no genoma (amplificação
de isoformas). Pode ser realizado pelo BLAST (NCBI) ou
por softwears especializados.

• Limitada para espécies com pouca informação genômica.

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Mascaração de primers – Repeat Masker

Mascaração de primers – Repeat Masker

Características dos primers

(SYBR e TaqMan)

• Para cDNA: desenhar os primers complementares aos exons. Para evitar

amplificação de DNA genômico, desenhar um primer na região 3´de um exon e
outro na 5´de outro exon.

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Características dos primers

(SYBR e TaqMan)

Exemplo: Primer leg 66 – Arachis spp.

1 2 3

1 e 2 - cDNA
3 - gDNA

Características da sonda TaqMan

• Tamanho: 18-30 bases (ideal 20 bases)

Mais que 30 bases é possível, mas o quencher não deve ser

posicionado na região 3´do primer

• Conteúdo de GC: ideal entre 40 e 60%

• Tm : entre 8-10 ˚C, maior que a Tm do primer

Características da sonda TaqMan

• Selecionar a fita que tiver mais C que G

• Posicionar a sonda o mais próximo do primer sem fazer

sobreposição

• Evitar :
- Mismatch entre o primer e a sonda
- Complementaridade dentro da sonda
- Sequência idênticas de nucleotídeos, especialmente de 4
ou mais Gs
- G na região 5´(pois pode desnaturar vários fluoróforos,
incluindo FAM)

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Parâmetros para a otimização da qPCR

One Step Two Step

• Kit contém enzima para RT • RT e qPCR em tubos

e qPCR separados
• RT e qPCR no mesmo tubo • RT feita com primers
• Mais rápido randômicos e/ou oligo dT, ou
• Menor chance de erro primers específicos
• Necessita de primer específico • Mais lenta
Para RT • Requer menor quantidade de
• Requer maior quantidade de RNA
RNA

Parâmetros para a otimização da qPCR

• Titulação dos primers

Forward primer (nM)

Reverse primer (nM)

100 300 600

100 100/100 100/300 100/600
300 300/100 300/300 300/600

600 600/100 600/300 600/600

OBS – para multiplex as concentrações de primers são menores

• Concentração da sonda (entre 50 e 250 nM)

Parâmetros para a otimização da qPCR

THRESHOLD

• Deve ser fixado para cada gene analisado

• É calculado automaticamente pelo programa

do equipamento na fase exponencial do ciclo

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Parâmetros para a otimização da qPCR

Cálculo da eficiência da reação

• Eficiência é calculada para cada par de primers

• Indica se a amplificação é exponencial a cada ciclo

• Deve ser de 100 ± 10%

• É calculada por meio da construção de uma curva padrão

• Pode influenciar a escolha do método de análise

CURVA PADRÃO

Regressão Linear
y = ax + b

E= 10 (-1/slope) – 1
- 3.6 ≥ slope ≥ - 3.1

R2 – Coeficiente de correlação
Ajuste da regressão linear
R2 ≥ 0,99

• Função inversa

Importância da eficiência

Y=x (1+E)n
Y=x 2n (para E = 100 %)

Y= quantidade
X = número inicial de cópias do alvo
E = eficiência
n = número de ciclos da PCR

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Parâmetros para a otimização da qPCR

Cálculo da eficiência da reação

Cálculo da eficiência a partir de dados de ∆Rn:

- LinReg

- PCR Miner

Parâmetros para a otimização da qPCR

Cálculo da eficiência da reação – PCR Miner
http://www.miner.ewindup.info/Version2

Parâmetros para a otimização da qPCR

Cálculo da eficiência da reação – PCR Miner
http://www.miner.ewindup.info/Version2

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Parâmetros para a otimização da qPCR

Cálculo da eficiência
PCR Miner x Curva Padrão

Primers PCR Miner Curva Padrão

52 101,3% 108,8%
53 99,0% 98,3 %
54 97,9% 104,7%
56 100,0% 125,7%
57 100,8% 106,2%
58 106,6% 104,1%
59 102,3% 105,3%
60 103,0% 90,1%
62 101,8% 100,9%

Parâmetros para a otimização da qPCR

Curva de dissociação

DNA fita simples

Absorbância relativa de luz a

1,4
260 nm

1,2 Desnaturação

DNA dupla fita

1
30 70 Tm 100
Temperatura
Temperatura em que metade dos
pares de bases de uma molécula
estão desnaturados

Curva de dissociação

• Realizada ao final da reação

• Dissocia Associa Dissocia as moléculas de DNA

• Realizada para cada amostra

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Parâmetros para a otimização da qPCR

Curva de dissociação

• Realizar para discriminar as moléculas de DNA de fita dupla resultantes

da amplificação por PCR

• Etapa obrigatória em experimentos com SYBR Green para a detecção de

amplificações inespecíficas, contaminações ou formação de dímeros de
primers

• Quando realizada com o regente SYBR Green, é possível acompanhar o

comportamento da fluorescência à medida em que ocorre a transição do
DNA de fita dupla para fita simples

Curva de dissociação

Curva de dissociação (melt curve)

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Curva de dissociação (melt curve)

Contaminação no
NTC (Cq = 34)
com o DNA alvo

Curva de dissociação (melt curve)

NTC com Cq = 37
Provável formação
de dímeros

Curva de dissociação (melt curve)

Formação de dímero na
amplificação do DNA alvo

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Curva de dissociação (melt curve)

Amostras
NTC

Amplificação inespecífica

Curva de dissociação (melt curve)

Amplificação de isoformas

Definição de replicatas

Replicatas técnicas: são medidas realizadas utilizando-se as

exatamente as mesmas amostras para testar a
reprodutibilidade da técnica. Uma vez feita e corrigida, essas
medidas são agregadas em um único valor.

Replicatas biológicas: representam uma condição biológica.

É a repetição do experimento biológico. Permite a validação
estatística do experimento.

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