20/11/2011

Por quê?

Genes de Referência

Como selecioná-los? Como utilizá-los?

Fernanda Carvalho Humann

Gene de Referência

Não deve variar nos tecidos

ou células sob investigação,
ou em resposta ao
tratamento experimental

Genes de referência clássicos:

variação mais de uma década antes da disponibilização de PCR em
tempo real

-1975: rRNA 18S com aumento de expressão em resposta à infecção por

cytomegalovirus (Tanaka et al.)
-1984: transcrição de GAPDH ocorre numa taxa similar em diferentes tecidos de
ratos, estes contem diferentes quantidades de mRNA (Piechaczyk et al.)
-1987: mRNA de β-actina estava diferencialmente expresso em amostras distintas
de tumores de pacientes com leucemia (Blomberg et al.)

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Normalização: remove a variação não-biológica específica de

cada amostra

Instrumento
bloco do PCR Reagentes
detectores fluoróforos
lâmpadas polimerase
filtros ….
….

Análise de dados Propriedades ópticas

dos plásticos
correção da linha de base
threshold

Medida da variabilidade representa o erro acumulado por todo o processo, ou

seja, a variação inata do gene sob investigação e o erro experimental associado
com a técnica

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Avaliação da estabilidade de expressão

Vamdesompele et al., 2002

10 genes de referência comuns > 85 amostras > 13 diferentes tecidos humanos

Classes funcionais diferentes

Erro: 1 gene de referência

Erro normalizado: razão das razões entre dois genes de referência em duas amostras

3X 6X
25% 10%
20X

Como a estabilidade da expressão de um

candidato pode ser avaliada se não há uma
boa medida disponível para normalizar o
candidato?

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Medida da estabilidade gênica (M)

Princípio: razão de expressão de dois genes controle internos ideais

é idêntica em todas as amostras, independente da condição
experimental ou tipo celular.

razão estabilidade de expressão

Cada gene controle > variação com todos os outros genes controle
como o desvio padrão das razões de expressão logaritimicamente
transformadas , e M é a média de variação de um gene com todos os
outros

menor M > expressão mais estável

geNorm
Visual Basic Application (VBA) para Microsoft Excel

Fator de normalização

Média geométrica

-somente os genes mais

estáveis
-incluir somente o necessário
evitando desperdício

Mínimo de três e inclusão de

mais genes controle até não
haver mais contribuição
significativa

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Validação dos fatores de normalização

8000 arranjos gênicos contendo os nove genes avaliados

Expressão dos genes de referência em tecidos específicos

Perfeita normalização da expressão

gênica é um pré-requisito absoluto para
resultados confiáveis

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Baseado em dados de microarranjo e permite a análise

simultânea de milhares de genes e gera uma lista dos melhores
genes de referência

Oryza sativa (arroz)

Categorias
Glycine max (soja)
-tipo desenvolvimento/tecido
Arabidopsis thaliana (arabidopsis)
-stress abiótico
Solanum licopersicum (tomate)
-stress biótico
Vitis vinifera (uva)
-hormônios
Triticum aestivum (trigo)
-outros estímulos
Hordeum vulgare (cevada)
-linhagem genética/cultivar
Populus (choupo)
-miscelânea
Zea mays (milho)

Interface amigável com várias opções diferentes de ferramentas e parâmetros para

investigar os melhores genes de referência

Parâmetros do Web Sever for Identification of Reference Genes

(1) Seleção dos experimentos de microarranjo: deve ser espécie-específico

(2) Transformação logarítimica: distribuição simétrica e Gaussiana e determinação dos
resultados positivos
(3) Intensidade do sinal: gene de referência e de interesse com nível de expressão
comparável
(4) IDs definidos pelo usuário: comparação de genes de referência escolhidos pelo usuário
aos encontrados pelo servidor

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Validação em arroz

Validação em Arabdopsis

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Organizando um experimento
-3 genes de referência e três genes de interesse
-11 amostras e 1 controle sem amostras

Gene maximization
-Introduz variação entre as placas
-aplicável para grandes estudos nos
quais as amostras não cabem numa
única corrida
-variação pode ser medida e corrigida
usando calibradores

Sample maximization
-sem aumento na variação pela
ausência de interrun
-bom para experimentos controlados

Hellemans et al., 2007