E.

Novaes

Universidade Federal de Lavras

Departamento de Biologia
Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

GENÔMICA E BIOINFORMÁTICA

Aula 5 – SNPs e Genotipagem por Sequenciamento

Professor: Evandro Novaes

Introdução

• Sequência referência é só o início

• Próximo passos: entender a natureza e a distribuição da
variabilidade genética nos indivíduos

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Polimorfismos
• Na definição clássica (genética de pop.) são
diferenças nas moléculas de DNA da população,
em que o alelo mais frequente possui <99%.
– Através desse critério, boa parte da variabilidade (alelos
raros) são desconsiderados

Mutações vs. Polimorfismo

• Mutação é o ato (pontual) que causa alterações
no genoma.
• Todos os polimorfismos se originam a partir de
mutações
• No entanto a mutação já ocorreu há algum
tempo e, portanto, os polimorfismos não podem
mais ser denominados mutação

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Polimorfismos
- Larga escala: variações estruturais

Single Nucleotide Polymorphism (SNPs)

• Forma mais comum de polimorfismo nos genomas

• Diversidade de SNPs em seres humanos é de 0,1%

– 1 SNP a cada 1000bp diferencia pares de indivíduos
selecionados aleatóriamente
– 3 milhões de SNPs

• Em plantas essa diversidade pode ser >2%

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SNPs
• São alterações que afetam uma base nucleotídica
• Indels de uma base também podem ser considerados SNPs
• Classificações:
– Natureza do nucleotídeo afetado: não codante ou codante (sinônimo ou
não sinônimo)
– Tipo de alteração de base: transição ou transversão

Descoberta de SNPs

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Descoberta de SNPs
• Se dá através da comparação das sequências de
diferentes cromossomos (haplótipos);

• Quanto mais indivíduos são sequenciados, maior é a

probabilidade de se detectar os SNPs

P = 1 - (1 - p) 2n

Descoberta de SNPs
• Sequências podem ser geradas de novo ou obtidas de bancos de
dados genômicos
– No passado, era comum a mineração de bancos de ESTs para descoberta de
SNPs

• SNPs identificados devem ter uma nota de qualidade baseado:

– Número de reads alinhados

– Qualidade das bases naquela região

• Software muito utilizado com Sanger – PolyBayes

– NGS: GATK, FreeBayes, SoapSNP, SAMTools

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Genotipagem de SNPs

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Tecnologias de genotipagem de SNPs

• Metodologias “low-throughput” (baixa eficiência)

• Baseadas em microarranjo

• Baseadas em “single base extention”

– Illumina Infinium
– Sequenom

• Descoberta e genotipagem de SNPs com

sequenciamento de alta performance (NGS)
– Genotype by sequencing (GBS)

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Infinium

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Infinium

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BeadArrays

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Descoberta e genotipagem de SNPs com

sequenciamento de alta performance

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Genotipagem por sequenciamento

• Descoberta e genotipagem ao mesmo tempo: não
necessita SNPs préviamente descobertos
(democratização)
• Sequenciamento completo de vários genomas ainda é
proibitivo
– Para a grande maioria das aplicações não necessitamos de uma
completa genotipagem do genoma
– Mesmo nos estudos de associação, esforços de genotipagem
podem ser reduzidos devido ao desequilíbrio de ligação

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Genotipagem por sequenciamento

• Grande eficiência das novas tecnologias de
sequenciamento permite genotipagem de SNPs em vários
indivíduos (multiplex) em uma mesma rodada de seq.

• No entanto:
– Maior taxa de erro exige maior profundidade de cobertura (>20x)
para que SNPs tenham confiabilidade
• Redução da complexidade do genoma

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Redução de complexidade

• Sequênciamento de RNA
– Em humanos somente uns 2-3% do genoma
está representado nos mRNA

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Redução de complexidade
• Uso de sondas-isca (“Sequence capture”)
– Vem sendo muito utilizado para captura e
sequênciamento dos exons

https://www.nature.com/articles/nbt.1975

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Métodos

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Redução de complexidade
• Uso de enzimas de restrição seguido de
amplificação
– Já utilizado há muito tempo: AFLPs, genotipagem de
SNPs com microarranjos, etc.

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Universidade Federal de Lavras

Departamento de Biologia
Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

GENÔMICA E BIOINFORMÁTICA

Prática com Genotipagem de SNPs

Professor: Evandro Novaes

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Genotipagem de polimorfismos
SNPs e Indels

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Arquivo fastq1
Pipeline (forward)
Arquivo fastq2
(reverse)

Genotipagem Mapeamento dos

reads em genoma de
de SNPs e referência
bwa
Indels:
Identificação seqs duplicadas
Picard Tools

Filtragem de polimorfismos Identificação de polimorfismos

GATK - VariantFiltration GATK - HaplotypeCaller

Avaliação dos polimorfismos

VCFTools

Anotação do efeito dos

SNPs e Indels
SnpEff

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Sequências genômicas de E. coli

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/DRX019805

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SNPEff annotation

http://snpeff.sourceforge.net/SnpEff_manual.html#outputSummary

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