Imunofluorescência

Imunologia Oral
Técnicas de imunofluorescência
Caso clinico

● A
Caso clinico - laboratório
● f

SS:
- 1º se a xerostomia e xeroftalmia não estão associadas a outra doença do
tecido conjuntivo
- 2º se a xerostomia e xeroftalmia estão associados a outra doença tecido
conjuntivo (ex artrite reumatoide)
(1) Imunofluorescência direta
(2) Imunofluorescência indireta
Fluorocromos
Exemplo: GFP
(green fluorescente protein)

Proteína extraída da alga

Aequorea victoria

Emite fluorescência na zona visível

é actualmente usado na produção de proteínas de fusão, constituídas por um gene de interesse

.
fundido com o da GFP, de modo a monitorizar, por exemplo localização dessa proteína in vivo

Semelhante a FITC
Fluorocromos
Espectro de absorção / emissão da GFP
Imunofluorescência direta

Técnica laboratorial: diagnóstico de lesões na pele, rim, tecido conjuntivo…

Anticorpo contra estrutura tecidular – marcado com fluorocromo (FITC, PE, …)

É aplicado diretamente sobre o corte de tecido/cultura celular onde se quer

identificar o antigénio (que pode ou não existir aí)
Imunofluorescência direta
Verifica-se se existe ou não formação do complexo imune
(microscópio de fluorescência)

Aplicação: localização morfológica de antigénios na superfície celular

Imunofluorescência indireta
Anticorpo específico + anticorpo secundário marcado com fluorocromo

Utiliza soro de um individuo sobre um substrato adequado (ex: corte histológico)

- depende do Ac a pesquisar e da disponibilidade de Ag no tecido

Utiliza antiglobulina humana marcada com fluorocromo

Imunofluorescência indireta

Aplicação:
- deteção de auto-anticorpos (ANA, ANCA, ASMA, Anti-TSH, … )
- deteção de anticorpos contra agentes infeciosos
Imunofluorescência indireta
Imunofluorescência indireta

Doenças auto-imunes (lúpus, artrite reumatóide, SAAF, espondilartropatias…)

Imunofluorescência

Células HEp-2

Título positivo > 1:160

Aspeto da fluorescência (visualização direta)
Auto-anticorpos: imunofluorescência
Rastreio (screening)

- Imunofluorescência indireta

Ensaios confirmatórios
- Ensaios imunoenzimáticos
- Imunoblot
- Reações de precipitação
- Ensaios Multiplex
Auto-anticorpos: imunofluorescência
Anticorpos anti-nucleares (ANA ou AAN)
- contra proteínas, histonas, ácidos nucleicos (ds, ss), nucleossomas (histonas+DNA)
centrómeros e ENAs (Extractable Nuclear Antigens)*
- Grupo heterogéneo de Ac com diferentes especificidades

3 – 15% da população tem ANA+ (títulos baixos)

Deteção:
- Imunofluorescência indireta (HEp-2**)
- Imunoprecipitação
- ELISA • Assim designados pq foram isolados de extratos salinos de
tecidos mamíferos. Pq proteínas associadas com RNA rico em
- Imunoblot uridina : RNP, Sm, SS-A/Ro, SS-B/La, SCL-70, Jo-1 e PM-1
** Hep-2 – Células Epiteliais Humanas
Auto-anticorpos: imunofluorescência
Células HEp-2: substrato preferencial para a pesquisa de ANA: grande núcleo com
elevada expressão Ag
Estruturas nucleares
- Membrana nuclear
- Nucléolos (rico em RNAr)
- Centrómeros
- Cromatina
- Spliceossomas (complexo de RNA
e proteínas que removem intrões
do RNAm – splicing)
Auto-anticorpos: imunofluorescência
Auto-anticorpos: estudo dos padrões nucleares

E ainda… Centrómero Padrão do SS

Auto-anticorpos: estudo dos padrões nucleares
Padrão nuclear difuso / homogéneo
- não específico: LES, Lupus induzido por farmacos, e muitas outras doenças AI
- Coloração uniforme de todo o núcleo
- segundo padrão mais comum
- ANA contra componentes dos cromossomas (dsDNA, histonas, nucleossomas)

* Cromatina positiva
Auto-anticorpos: estudo dos padrões nucleares
Padrão nuclear mosqueado
- não específico: LES, SS, esclerodermia (ES difusa) e outras doenças AI
- padrão mais comum
- ANA contra antigénios nucleares extraíveis – ENA (anti-RNP, Sm, SSA, …)

* Cromatina negativa – não cora

Auto-anticorpos: estudo dos padrões nucleares
Padrão nuclear centrómero
- específico para CREST*
- ANA contra centrómeros (pequenos pontos fluorescentes no núcleo – 46-nº
Cromossomas)

* CREST - calcinose, fenómeno de Raynaud, alteração

da motilidade esofágica, esclerodactilia e telangiectasias
Auto-anticorpos: estudo dos padrões nucleares
Padrão nuclear nucleolar
- relativamente específico para ES difusa
- ANA contra nucléolos (2 a 7)
Bom estudo!