Centro de Cincias da Sade CCS Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho - IBCCF

Tcnicas em Biologia Molecular

PCR Polymerase Chain Reaction

Aluna: Bruna Alves Metzker

Reao em cadeia da polimerase

Kary Mullis (1985). Permite a obteno de um grande nmero de cpias de uma dada sequncia de DNA, sem que haja necessidade de clonagem prvia. Baseia-se em determinadas caractersticas da replicao do DNA:
DNA polimerase sintetiza uma nova fita de DNA a partir de uma fita molde; DNA polimerase no inicia a sntese por si s. Precisa de um primer; DNA polimerase sintetiza somente na direo 53; A reao de polimerizao requer os 4 dNTPs.

Como fazer PCR

DNA molde Primers DNA polimerase termoestvel (Taq polimerase) Deoxinucleotdeos trifosfato (dNTPs) Tampo Mquina termocicladora

Etapas da reao
Desnaturao: 94C 96C Separa a dupla fita do molde de DNA em duas fitas simples
Pareamento: 37C 65C Primers ligam-se em locais especficos do DNA molde Extenso: 72C DNA polimerase usa os dNTPs adicionando-os a nova fita de acordo com a regra de pareamento polimerizao. .

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

PCR em tempo real

PCR x PCR em tempo real PCR em tempo real realiza a quantificao de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, porque determina valores durante a fase exponencial da reao A emisso dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na proporo direta da quantidade de produto do PCR - SYBR Green e TaqMan

SYBR Green

O SYBR Green se liga entre a fita dupla de DNA e emite uma fluorescncia verde. Vantagens x Desvantagens No comeo da amplificao, as molculas no ligadas do SYBR Green apresentam fluorescncia fraca. Aps o reconhecimento dos primers, algumas molculas do SYBR Green podem ligar-se na dupla fita previamente formada. Durante a polimerizao as molculas do SYBR Green se ligam ao DNA sintetizado. Assim, a reao monitorada continuamente e um aumento da fluorescncia observado em tempo real.

TaqMan

Esta sonda apresenta em uma extremidade um fluorforo, e na outra extremidade um quencher .

Durante a PCR em tempo real a TaqMan hibridiza com a sequncia da fita simples de DNA complementar alvo para amplificao. No processo da amplificao a TaqMan degradada devido atividade exonuclease 5 -> 3 da DNA polimerase, separando o quencher da molcula fluorescente durante a extenso, resultando no aumento da intensidade da fluorescncia.

Aplicao
Amplificar sequncias de DNA especficas; Produtos de PCR podem ser clonados; Produtos de PCR podem ser diretamente sequenciados; Deteco de mutaes; Medicina forense; Teste de paternidade;

Arqueologia.