Teste molecular

Nome Completo
Matrícula
Farmácia Curso

Situação 1º Situação 2º Situação 3º

FEBRE'E SINTOMA FEBRE E SINTOMA CONTATO DOMICILIAR COM CASO CONFIRMADO NOS ULTIMOS 14
RESPIRATORIO RESPIRATORIO DIAS E FEBRE' OU SINTOMA RESPIRATÓRIO
+ Retorno + IMPORTANTE OBSERVAR OUTROS SINAIS E SINTOMAS:
de viagem de área Teve contato mialgia/artralgia, dor de cabeça, calafrios, manchas vermelhas pelo
afetada nos últimos próximo de caso corpo, gânglios linfáticos aumentados, diarreia, náusea, vomito
14 dias confirmado ou desidratação e inapetência.
suspeito

NÃO SIM SIM NÃO

EXCLUIDO CASO CASO PROVAVEL EXCLUIDO

SUSPEITO

Coletar amostra respiratória para pesquisa de

SARS-CoV-2 por RT - PCR em tempo real e outros
virus respiratórios

POSITIVO PARA OUTRO NEGATIVO POSITIVO PARA

VIRUS RESPIRATORIO SARS-COVID-2

DESCARTADO CONFIRMADO
COVID-19 COVID-19
 Técnica RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase em tempo real)

1º A partir da amostra coletada é feita a extração de RNA

1. Lise 2. Ligação

Promove a ruptura da O lizado é transferido para a

partícula viral, expondo coluna de sílica onde o RNA
assim o material genético. se liga por centrifugação os
demais componentes serão
filtrados e descartados

4. Eluição
3. Lavagem
Ocorre no final do processo, com a
Purifica o RNA aderido centrifugação o RNA será
a coluna de sílica depositado no fundo do tubo e
eluido em água livre de RNAse

E necessário converter a molécula de RNA em

DNA com a reação de transcrição reversa, esta
ase antecede a PCR em tempo real.
O iniciador irá se ligar a fita de RNA
direcionando a enzima RT a iniciar a
RNA
sintese de cDNA

Iniciador

Desoxirribonucleotideos Síntese de cDNA A reação de transcrição reversa

Fosfatados dNTP´s utiliza a enzima transcriptase reversa
(RT) para sintetizar a fita de cDNA

Enzima: Trancriptase reversa

Finalizado este processo o A enzima utiliza os dNTP`s para a
CDNA pode ser utilizado na PCR extensão da fita complementar
em tempo real

RT-PCR

RT-PCR
A técnica permite a detecção da amplificação cDNA:
do alvo (amostra viral) pela fluorescencia emitida a
cada ciclo através de sondas alvo especificas,
oriundas do sistema TaqMan
Esses elementos são então submetidos a diferentes
ciclos de temperatura (Ciclagem) e a detecção da
fluorescência é feita por um equipamento acoplado a
um computador. A fluorescência captada é convertida
em um sinal para visualização dos resultados
Dentro do equipamento acontecerá a ciclagem com
temperatura e tempo determinados.
-No primeiro momento as fitas de DNA irão se
separar, caso a amostra possua o material genético
do virus (SARS-CoV-2) os iniciadores se anelarão e as
sondas devem hibridizar as regões especificas do
genoma do SARS- CoV-2 E então a polimerização
acontece
A técnica utiliza:
cDNA: Iniciadores específicos para o alvo
(oligonucleotideos) dNTPs (Desoxirribonucleotideos
Fosfatados! Taq DNA polimerase (Enzima): Sonda de DNA
fluorescente (oligonucleotideo) alvo especifico
A sonda molecular irá se ligar entre os iniciadores. A
extremidade 5 da sonda está ligada uma molécula
fluorescente chamada repórter (R) Na extremidade 3
está ligado o quencher (Q) que tem a capacidade de
absorver fluorescência do repórter quando a sonda está
intacta
A polimerização acontece no momento em que a Taq DNA
Polimerase encontra os iniciadores anelados a fita de DNA
No sentido 5 para 3 a enzima vai incorporando os dNTP's
disponíveis no meio e ao encontrar a sonda promove a
clivagem da mesma, liberando então a molécula
fluorescente ao meio
Esse processo acontece várias vezes, e a
fluorescência emitida a cada clivagem da
sonda será detectada em tempo real e
convertida em um sinal que gera os
 1.Thresold: é tido como limiar.
Abaixo dele está o nível basal onde
geralmente observam-se os ruídos.
2. Background: Ruídos e sinais
de fluorescência abaixo do limite de
detecção
3 Fase exponencial: Momento
que há amplificação da amostra
4 Fase Platô: Não se observa
mais alterações o grau de fluorescência

5. CT (Cycle threshold): é definido quando a curva de amplificação cruza o threshold, ou seja, quando o
equipamento capta um sinal real de fluorescência que é proporcional a quantidade de produto de RT-PCR.
E neste momento que o DNA alvo è amplificado e a partir deste ponto a amplificação segue exponencialmente até
atingir seu platô.

Vantagens Desvantagens
Custos elevados
Alta sensibilidade
Mão de obra especializada
Especificidade Tempo de execução
Infraestrutura específica
Ensaio multiplex