Manipulação de Ácidos Nucléicos
A extração do DNA é o primeiro passo de
muitas aplicações biotecnológicas, são
elas: PCR, clonagem, transferência de
genes, tipagem molecular, marcadores
moleculares e sequenciamento
 Etapas para um diagnóstico molecular:
Coleta do material biológico, extração do
DNA ou RNA, amplificação (técnicas de
PCR por exemplo) e análise dos resultados
 Coleta
Por meio do sangue total, líquido
amniótico, soro, plasma, urina, tecidos
parafinados e raspados bucais, cervicais e
uretrais
O DNA por ser uma molécula estável
consegue ficar preservado no tecido por
bastante tempo
A integridade do DNA é mantida através
de soluções em pH 8 (pois enzimas
nucleases tem seu ambiente favorável em
pH7)
OBS: em RNA por ser uma molécula fita
simples e mais instável o processo de
coleta e preservação deve ser mais
cuidadosa
 Extração
O objetivo da extração é separar o DNA de
todas as outras moléculas, como está em
meio celular existem diversas estruturas
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que não se quer analisar, como: proteínas,
lipídios etc.
Para separar os ácidos nucleicos utiliza-se
primeiramente soluções de lise
(detergentes), capazes de romper a
membrana plasmática das células e liberar
seu conteúdo no meio extracelular
Após isso adiciona-se soluções
desnaturantes de proteínas (fenol), ao
misturar o fenol com a amostra e
centrifugar, percebe-se a formação de 2
fases, a parte de cima são os ácidos
nucleicos e a parte de baixo são os restos
proteicos
Mesmo separado de outras moléculas o
DNA não consegue ser visualizado, devido
a sua característica química (polaridade
negativa) e repulsão das moléculas de
DNA
Com isso, para bloquear a carga negativa
do DNA é preciso inserir sal e etanol
gelado, pois o sal anula a polaridade do
ácido nucleico e o etanol favorece a
agregação dessas moléculas
Após outra centrifugação o agregado de
DNA é possível ser visto a olho nu no
fundo do tubo A etapa de quantificação é feita pela
comparação entre a intensidade da
fluorescência das amostras extraídas com
uma solução de DNA de concentração
conhecida

Ao final do processo é preciso fazer uma

quantificação e qualificação desse DNA
para saber se a extração funcionou, é feito
por meio de espectrofotômetro (realizada a
medição da quantidade de luz absorvida
pelo DNA) ou eletroforese em gel de
agarose (permite a resolução de ácidos
nucléicos, é um método comparativo)
 Eletroforese com gel de agarose
Com o gel de agarose quantificamos e
avaliamos a integridade do DNA e
estimamos o tamanho das moléculas das
bandas nos géis por comparação com
soluções de DNA de tamanhos conhecidos
(marcadores de peso molecular)  Espectrofotômetro
Nas extrações podem-se obter grandes É capaz de determinar as concentrações
moléculas, que incluem cromossomos médias dos ácidos nucléicos presentes
inteiros ou cromossomos fragmentados em uma amostra, bem como sua pureza
Amostras de boa qualidade formam bandas É realizada por medição da quantidade
íntegras, enquanto amostras degradadas ou de luz absorvida pelo DNA em solução
com presença de RNA formam rastros ao no comprimento de onda de 260nm
longo do gel

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 Quanto maior for a absorção de luz
nesse comprimento de onda, maior a
concentração de DNA na solução

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR= Reação de polimerase em cadeia amplificado, os primers são feitos
especificamente para se ligar com a
É a técnica que permite a amplificação do
sequência em que se quer estudar
DNA in vitro (replicação do DNA fora da
célula) Extension: extensão, é a polimerização por
meio da DNA polimerase, após a ligação
Utiliza-se de uma reação enzimática
do primer com a cadeia alvo a DNA
catalisada pela polimerase
polimerase vai começar a replicação
Método rápido, eficiente e com alta propriamente dita
especificidade e reprodutibilidade
Ocorre a alternância de temperaturas a
Pode amplificar qualquer sequência alvo cada ciclo, quanto menos se aquece
de DNA melhor, pois o ciclo se repetirá 30 vezes e
OBS: para amostras de RNA é preciso a essa alternância pode degradar a DNA
transcriptase reversa para transformar o polimerase
RNA em DNA
Não identifica o vírus, sim o seu material
genético
À medida que o processo progride, o DNA
gerado vai ser usado como uma base para
replicação subsequente (reação em cadeia)
É feito em ciclos, cada ciclo origina 2
novas cadeias de DNA
 Etapas da PCR:  Reagentes necessários:
Melting: é a desnaturação, consiste na Na replicação in vivo várias enzimas são
separação da dupla fita de DNA a ser necessárias:
amplificado, por aquecimento (94°C),
quebra as ligações de hidrogênio por serem Helicase: quebra as ligações de hidrogênio
ligações fracas, mas preserva-se as DNA polimerase: Polimeriza a cadeia em
ligações fosfodiéster por serem fortes construção
Annealing: anelamento ou hibridização, é Ligase: liga os fragmentos de okazaki
a ligação do primer ao DNA a ser
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Primase: coloca os primers e dá o “start”
da DNA polimerase
Girase: impede o superenovelamento do
DNA após a abertura das cadeias
Para ocorrer a PCR outros constituintes
também são precisos: cloreto de magnésio
para ativar as Taq; nucleotídeos sintéticos
para servirem de substrato; solução
tampão, para garantir pH ideal; H2O
Milli-Q, ou seja, água sem íons e DNA
molde

Na PCR como já mencionado ocorre a

abertura das cadeias pela temperatura, com
isso a função da helicase é perdida
Já que as cadeias são separadas de ponta a
ponta, sem formação de forquilha de
replicação, a ligase também não é  Cinética da PCR:
necessária, pois a replicação agora ocorre Dividida em 3 fases:
de ponta a ponta
Fase de screening: ciclos iniciais, os
A primase também não vai ser necessária primers procuram o molde de DNA com as
pois empresas são capazes de produzir sequências complementares
primers extremamente específicos (2 para
Fase intermediária: processo de
cada fita), capazes de se ligar na região do
amplificação está ocorrendo, levando ao
DNA que diagnostica o que o pesquisador
aumento exponencial de fragmentos de
quer
DNA
E por fim, a girasse também não é
Fase tardia ou de platô: amplificação acaba
necessária já que as cadeias foram abertas
devido a limitação de reagentes (primers
totalmente não há uma região que pode
foram consumidos e a Taq já foi
ficar superenovelada
degradada)
Somente a DNA polimerase é necessária,
entretanto, a humana possui atividade ideal
com 34°C e para romper as cadeias é
preciso uma temperatura de 94°C
Utiliza-se uma DNA polimerase advinda
de bactérias ancestrais (archeas) que
possuem uma capacidade de aguentar altas
temperaturas (Taq-DNA polimerase)

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 Durante a fase de amplificação o
pesquisador analisa os dados pelo
computador
Consegue quantificar, tempo da reação
reduzido
Requer concentrações menores de DNA
Maior reprodutibilidade, sensibilidade e
precisão
Pode-se monitorar vários alvos
simultaneamente
Pode ser utilizada para monitorar o
 Variações da PCR: progresso da doença e avaliar o efeito de
tratamentos
PCR Clássica:
Uso de sondas fluorescentes que medem a
Consiste na replicação de sequências
quantidade de produto a cada ciclo,
específicas de DNA utilizando
dispensando a eletroforese
equipamentos termocicladores
A avaliação do resultado só é possível após
realizar-se inúmeras vezes até atingir
milhões de cópias, a detecção do produto é
normalmente feita em eletroforese em gel
de agarose, o que demanda muito tempo
Não quantifica, apenas qualifica
PCR Realtime:
Consegue detectar pequenas quantidades
de material genético Desvantagens: a reação é cara comparada
Acompanhamento do processo se dá em com outros métodos e exige equipamentos
tempo real especializados

Mutações
Mutações são naturais para o DNA e são
essenciais para garantir a variabilidade
genética, entretanto, se genes não forem
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expressos na quantidade e na hora certa
podem resultar em síndrome, doenças
genéticas e malformações
Mutações são mudanças na sequência de  Erros na Replicação
DNA de um gene ou cromossomo
Podem levar à formação de um par errado
Mutações podem ocorrer de diversas de nucleotídeos ou adição/subtração de
formas em genes e levar à consequências pares de bases (mutações de ponto)
nas proteínas, como: não produção da
Substituições, Inserções ou deleções
proteína (silenciamento do gene), excesso
(responsáveis pela diversidade genética)
de proteína e alteração na estrutura da
proteína Substituição: mutações em que um par de
bases é substituído por outro. Ocorre por
Possuem causas genéticas (cromossômicas,
transições (substituição de uma base por
monogenéticas e síndromes identificáveis)
outra da mesma categoria) ou
e ambientais (teratógenos, lesões
transverções (substituição de uma base de
intraparto, infecções e etiologia
categoria química por uma de outra)
desconhecida)
Tipos de mutações: somáticas (ocorrem em
qualquer célula do corpo, exceto as
germinativas, não perpassam as gerações)
e germinativas (em geral não afetam o
indivíduo, mas sim seus descendentes)
Para que uma mutação seja herdável é
preciso que ela atinja as células sexuais
Podem surgir espontaneamente ou serem
induzidas
Espontâneas ocorrem naturalmente e
surgem em todas as células
As substituições por transições ocorrem
As induzidas surgem pela ação de agentes por conta da forma tautomérica das bases
mutagênicos (existem em pequenas quantidades e são
Quando as mutações espontâneas se raras), levando a um erro de pareamento
juntam com as induzidas ocorre o acúmulo
de mutações e começam a surgir doenças
(câncer)
 Mutações Espontâneas
Podem ocorrer ou por meio de erros na
replicação do DNA ou por meio de lesões
espontâneas

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 por valina na cadeia peptídica, alterando a
hemoglobina tipo A pôr tipo S
Inserção e Deleção: é a adição ou
remoção de um ou mais pares de
nucleotídeos, são mais frequentes que as
substituições de bases, levam mudanças na
matriz de leitura, sempre vão levar a
alterações fenotípicas
Ocorre, pois, no momento da separação
das fitas complementares (na replicação ou
por radiação), bases complementares da
Forma rara da timina vai ser capaz de mesma fita podem se ligar e formar um
parecer com citosina, ligando-se com a alinhamento incorreto
guanina, mas como essa forma instável ela
volta a ser timina normal e a conformação
da ligação fica errada, podendo ser
corrigida posteriormente
A forma rara da guanina se parece com a
adenina, forma rara da citosina se parece
com timina e forma rara da adenina se
parece com guanina
Entretanto, a troca das bases não é uma
mutação propriamente dita, pois os
mecanismos de reparo vão corrigir isso,
A partir do ponto que a inserção ou deleção
toda mutação é definitiva. O problema das
acontecer vai mudar o quadro de leitura de
substituições é na replicação, em que o
todos os pontos em diante
erro não é corrigido e perpetua-se para a
nova fita  Lesões Espontâneas:
Decorrem da alteração química das bases
normalmente presentes no DNA, são elas:
Depurinação: quebra da ligaçõe
glicosídica entre as bases púricas (A e G) e
a desoxirribose, levando a perda da base
Se não for reparada leva a uma deleção
Um exemplo de doença causada por erro
de pareamento é a anemia falciforme, em
que a substituição pontual de timina por
adenina leva a substituição de glutamato
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 Ocorre por substituição de uma base no
DNA, alteração de uma base ou
danificação de uma base
Incorporação de análogos de base: são
compostos químicos que “imitam” bases e
induzem pareamentos errados, causando
Desaminação: é a remoção de um grupo substituições, são usados em experimentos
amino de uma base, como a desaminação para descobrir funções de proteínas e em
da citosina que produz uracila quimioterápicos
É a mais fácil de ser corrigida, pois uracila
não estão no DNA
Se não for corrigida leva a uma
substituição

Bloqueadores de replicação: luz

ultravioleta (forma duas ligações
covalentes entre duas bases da mesma fita,
principalmente entre duas pirimidinas
Oxidação: é a danificação das bases por adjacentes, levam a uma substituição),
radicais de oxigênio do tipo superóxidos, radiações ionizantes (levam a alterações
hidroxila ou peróxidos de hidrogênio, leva estruturais das bases, eliminação das bases,
a uma transverção GT (G passa a parear rompimento das pontes de hidrogênio e
com A) ruptura de uma ou duas cadeias)
Alquilação: é a transferência de grupos
metil ou etil (advindos de nitrosaminas ou
metil-nitrosoguanidinas), que reagem com
as bases do DNA, levando a uma alteração
das bases e o consequente pareamento
errado
Pode causar uma substituição
 Mutações Induzidas:
São realizadas deliberadamente, por meio
da intervenção humana

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