GENÉTICA 2022/2023
PROTOCOLO 1
INTRODUÇÃO
Nos seres vivos, podem encontrar-se
diferentes tipos de ácidos nucleicos,
nomeadamente: DNA nuclear (nDNA),
mitocondrial (mtDNA), cloroplastídico (cpDNA)
e plasmídico (pDNA); RNA mensageiro
(mRNA), RNA de transferência (tRNA) e RNA
ribossomal (rRNA).
Uma das técnicas
fundamentais da biologia molecular é a
extração de ácidos nucleicos de um
organismo, livre de contaminações por
proteínas e outros componentes moleculares
da estrutura celular. Existem diversos
protocolos adaptados à extração de DNA ou
RNA, com pequenas alterações que
dependem normalmente do tipo de organismo
ou população celular a que se aplicam. A
preparação de DNA total é muitas vezes
necessária como fonte de material a partir do
qual se isolam genes, ou para efeitos de
comparação entre organismos ao nível
molecular. O DNA total pode ser obtido a partir
de culturas bacterianas, tecidos vegetais ou
animais ou de células animais em cultura, e
envolve, normalmente 3 etapas: (i) lise celular
(com libertação de todo o material intracelular);
(ii) precipitação de proteínas e outros
componentes celulares e (iii) isolamento do
DNA. Nas células bacterianas, podem existir
moléculas de DNA que replicam de forma
autónoma, independente do cromossoma, que
se designam plasmídeos. Dentro da célula, o
DNA plasmídico (pDNA) encontra-se
DBio@UAveiro
Extracção de DNA
(total e plasmídico)
superenrolado (conformação supercoiled). O
número normal de cópias de cada plasmídeo
pode variar, existindo plasmídeos de cópias
elevadas ou baixas. Por exemplo, plasmídeos
maiores tendem a ter um menor número de
cópias. Os plasmídeos artificiais (base em
plasmídeos naturais, mas com a adição de
elementos genéticos de interesse) são
importantes para as tecnologias de DNA
recombinante e, por isso, foram desenvolvidas
técnicas para a extracção selectiva deste tipo
de moléculas, nomeadamente o método de
lise alcalina. Após a extração, a maioria do
pDNA estará na conformação superenrolada.
Contudo, uma fracção do mesmo pode ter
quebras simples de DNA, o que liberta a
tensão exercida por essa conformação. Neste
caso, o pDNA continua circular, mas não
superenrolado (conformação circular aberta).
Por vezes, mas mais raramente, é possível
obter pDNA linearizado (quebras duplas de
DNA) ou pDNA circular mas de cadeia simples
devido à desnaturação permanente do pDNA
durante o procedimento (se a lise alcalina for
prolongada).
O resultado de qualquer processo de extração
é uma solução do ácido nucleico extraído num
tampão a pH 8,0. Após extracção, é
necessário proceder à determinação da
concentração da solução de DNA purificado
(Protocolo 2).
1
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OBJETIVOS
• Aprender o processo de purificação de DNA
a partir de um extrato celular;
• Reconhecer os cuidados a ter na
manipulação do DNA;
• Aprender a utilizar kits comerciais de
extração de DNA;
• Compreender as diferentes etapas do
processo de extração de DNA
cromossomal e plasmídico.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Na aula alguns grupos irão realizar a extracção de DNA total bacteriano (protocolo A) e outros
grupos realizarão a extracção de DNA plasmídico (protocolo B), usando uma estirpe de
Escherichia coli portadora do plasmídeo pUC19 (Figura 1.1). Ambos os protocolos serão
baseadas no método de purificação de DNA em coluna (DNA spin column based purification).

PROTOCOLO A: Extracção de DNA total bacteriano com o HigherPurity™

Bacterial Genomic DNA Isolation Kit (Canvax)

Resumo:

1. Inocular meio de cultura TSB suplementado com ampicilina (100

μg/mL) com uma colónia de Escherichia coli pUC19 (Figura 1.1). Incubar
durante a noite a 37 ºC com agitação (180 rpm) – este passo não será
efectuado pelos estudantes

2. Centrifugar 1 mL da cultura de Escherichia coli durante 1 min a 13000 rpm

3. Descartar o sobrenadante e inverter o tubo num papel absorvente para
retirar o excesso de meio de cultura

4. Ressuspender o sedimento/”pellet” em 180 μL de Buffer BR-1 (tampão de
ressuspensão), com ajuda de uma micropipeta - ! confirmar que todo o pellet
é dissolvido no buffer
5. Adicionar 10 μl de lisozima e incubar a 37ºC por 10 min
6. Adicionar 10 μl de solução de RNase A e misturar bem (cerca de 10
segundos), recorrendo ao vórtex. Incubar durante 5 minutos à temperatura
ambiente
7. Adicionar 20 μl de Proteinase K e incubar durante 30 minutos a 55ºC8.
Adicionar 200 μl de Buffer BLU, agitar no vórtex e incubar durante 10
minutos a 70ºC.

9. Adicionar 200 μL de etanol absoluto e misturar vigorosamente com o
vórtex.
10. Transferir a mistura para a coluna (em caso de dúvida, consultar a Figura
1.2) com a ajuda da micropipeta

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11. Centrifugar a 13000 rpm durante 1 min

12. Descartar o liquido do tubo de recolha (Figura 1.2)
13. Transferir a coluna para um microtubo colector (Figura 1.2) e adicione 200 μL de Buffer
WB1 (tampão de lavagem) à coluna
14. Centrifugar a 13000 rpm durante 1 min
15. Descartar o liquido do tubo de recolha
16. Transferir a coluna para um microtubo colector e adicione 200 μL de Buffer WB2 (tampão
de lavagem) à coluna
17. Centrifugar a 13000 rpm durante 3 min
18. Descartar o liquido do tubo de recolha
19. Transferir a coluna para um microtubo de 1,5 mL previamente marcado com o número do
grupo e turma prática
20. Adicionar 100 μL de Buffer EB (tampão de eluição) diretamente ao centro da coluna
21. Incubar 1 min à temperatura ambiente
22. Centrifugar 13000 rpm por 1 min
23. Descartar a coluna e guardar a -20 ºC o microtubo que contem o DNA genómico extraído
(Figura 1.2).

PROTOCOLO B: Extracção de DNA plasmidico (pUC19) 
com o WideUSE™

Plasmid Purification Kit (Canvax)

1. Inocular meio de cultura TSB suplementado com ampicilina (100 μg/mL)

com uma colónia de Escherichia coli pUC19 (Figura 1.1). Incubar durante a
noite a 37 ºC com agitação (180 rpm) – este passo não será efectuado
pelos estudantes

2. Centrifugar 1 mL da cultura de Escherichia coli durante 1 min a 13000 rpm

3. Descartar o sobrenadante e inverter o tubo num papel absorvente para
retirar o excesso de meio de cultura

4. Ressuspender o sedimento/”pellet” em 100 μL de Buffer S-I (tampão de
ressuspensão suplementado com RNase) - ! confirmar que todo o pellet fica
dissolvido no buffer
5. Adicionar 100 μl de Buffer S-II (buffer de lise com pH alcalino) e misturar
bem (inverter o tubo algumas vezes)
6. Adicionar 100 μl de Buffer S-III (tampão de neutralização) e misturar bem
(inverter o tubo algumas vezes)
7. Centrifugar a 13000 rpm durante 10 min
8. Com a micropipeta, transferir o sobrenadante (que contem o DNA
plasmidico) para um microtubo de 1,5 mL
Resumo:
9. Adicionar 500 μl de Binding Buffer e incubar à temperatura ambiente
durante 5 min

3
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10. Transferir a cultura para a coluna por decantação (em caso de dúvida, consultar a Figura
1.2)
11. Centrifugar a 5500 rpm durante 1 min 30 sec
12. Descartar o liquido do tubo de recolha (Figura 1.2)
13. Adicionar 700 μL de Washing Buffer à coluna
14. Centrifugar a 5500 rpm durante 1 min 30 sec
15. Descartar o liquido do tubo de recolha e voltar a colocar a coluna nesse mesmo tubo
16. Adicionar 500 μL de isopropanol
17. Centrifugar a 5500 rpm durante 1 min 30 sec
18. Descartar o liquido do tubo de recolha e voltar a colocar a coluna nesse mesmo tubo
19. Centrifugar a 13000 rpm durante 1 min 30 sec
20. Colocar a coluna num microtubo novo de 1,5 mL previamente marcado com o número de
grupo e turma prática
20. Adicionar 50 μL de Buffer EB (tampão de eluição) diretamente ao centro da coluna
21. Incubar 1 min à temperatura ambiente
22. Centrifugar 13000 rpm por 1 min
23. Descartar a coluna e guardar a -20 ºC o microtubo que contem o DNA plasmídico extraído
(Figura 1.2).

Figura 1.1: Representação da estirpe de E. coli contendo o plasmídeo pUC19. O mapa

detalhado do plasmídeo pode ser consultado no protocolo da aula 2 (Biorender).

Figura 1.2: Representação das colunas, tubos colectores e microtubos 1,5 mL

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? ANÁLISE E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

1. Qual a relevância de utilizar meio suplementado com antibiótico para crescer a estirpe de
E. coli pUC19?
2. Quais as etapas essenciais para um procedimento de purificação de ácidos nucleicos?

3. No procedimento de extração de DNA total, porque é necessário utilizar proteinase K e
RNase?

4. Em ambos os protocolos, qual a função do último tampão?

5. Qual a principal diferença entre os protocolos de extração de DNA total e DNA plasmídico?

 No último, o que permite separar o DNA plasmidico do DNA cromossomal?
6. No procedimento de extração de DNA plasmídico, não é necessário utilizar proteinase K.
Porquê?

5
 GENÉTICA 2022/2023
INTRODUÇÃO
O método de eleição para quantificação de
ácidos nucleicos é a espetrofotometria. Este
método de quantificação consiste na medição
da absorvância da solução a um
comprimento de onda de 260 nm. A este
comprimento de onda, uma unidade de
densidade ótica corresponde a 50 μg/ml de
DNA de cadeia dupla e 40 μg/ml de DNA em
cadeia simples. Para estimar a pureza das
amostras de DNA, determina-se a razão
entre as absorvâncias medidas a 260 nm e a
280 nm. Para preparações de DNA puro,
esta razão deve ser igual a 1,8.
As enzimas de restrição são uma das
ferramentas básicas da tecnologia de DNA
recombinante. Estas enzimas, normalmente
produzidas por bactérias, reconhecem
determinadas sequências de nucleótidos na
cadeia dupla de DNA. As sequências de
reconhecimento são específicas para cada
enzima. Um tipo particular de enzimas de
restrição são as enzimas de Tipo II, que
quebram a cadeia dupla de DNA em locais
específicos (sequência de reconhecimento).
Estas quebras resultam em dois cortes, um
em cada uma das cadeias da molécula de
DNA, efetuados em locais precisos.
As sequências de reconhecimento são em
geral de 4, 6 ou 8 pares de bases e possuem
simetria rotacional (palindromas). Qualquer
DNA (cromossómico, mitocondrial,
plasmídico, viral) possui várias sequências
DBio@UAveiro
PROTOCOLO 2
Quantificação e Digestão de DNA
de reconhecimento para uma dada enzima
de restrição. Estas enzimas podem ser
usadas para digerir DNA de qualquer
organismo, originando extremos/terminais
com sequências nucleotídicas conhecidas.
Estes terminais podem ser coesivos
(exemplo: BamHI) ou cegos (exemplo: ScaI)
e permitem a posterior ligação de DNA de
diferentes origens, desde que esses
fragmentos apresentem extremos
compatíveis (esta reação exige a presença
de uma outra enzima, a DNA ligase). Este é
o princípio básico da engenharia genética.
Cada enzima apresenta condições ótimas de
reação no que diz respeito à temperatura e à
concentração de sais. O volume de enzima a
adicionar à solução final em que decorre a
reação, deve ser menor do que 10  do
volume total, devido ao alto conteúdo em
glicerol das soluções de armazenamento das
enzimas. Concentrações elevadas de glicerol
podem inibir a sua atividade.
O DNA a ser digerido deve estar livre de
impurezas para que não haja o risco de estas
inibirem a enzima. É necessário ter em conta
também a concentração do DNA a digerir. As
enzimas de restrição são, em geral,
comercializadas a concentrações de 10
unidades por microlitro, sendo uma unidade
definida como a quantidade de enzima que,
ao fim de uma hora e à temperatura ideal,
digere completamente 1 g de DNA padrão
(normalmente, DNA do fago lambda).
7
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OBJETIVOS cuidados necessários para evitar a

degradação do DNA;
• Compreender o tipo de ação das enzimas • Aprender a preparar reações de digestão
de restrição sobre moléculas de DNA de DNA;
circulares; • Saber interpretar resultados da digestão de
• Desenvolver os conhecimentos necessários DNA.
para a manipulação de DNA e reconhecer os

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Na primeira parte da aula irão determinar a concentração e grau de pureza do DNA extraído
na aula anterior (Protocolo A). Na segunda parte da aula, os estudantes irão digerir o DNA
extraído: cada grupo elaborará uma das seguintes reacções:

- Digestão simples de DNA cromossomal (Protocolo B) – enzima BamHI (Figura 2.2)

- Digestão simples de DNA plasmídico (Protocolo C) – plasmídeo pUC19 (Figura 2.1) e
enzima BamHI (Figura 2.2)
- Digestão dupla de DNA plasmídico (Protocolo D) – plasmídeo pUC19 (Figura 2.1) e enzimas
BamHI e SacI(Figura 2.2)

No entanto, os resultados devem ser interpretados pelos estudantes como um todo. Ou seja,
todos os grupos devem analisar os resultados obtidos nas três reacções efectuadas na aula.

PROTOCOLO A: Determinação da concentração e grau de pureza da amostra de

DNA

1. Preparar 1 microtubo com 995 L de TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM

EDTA)
2. Adicionar 5 L do DNA extraído
3. Agitar os tubos suavemente para tornar a solução homogénea.
4. Efetuar a leitura da absorvância a 280 e a 260 nm para as soluções
contidas em cada um dos tubos em cuvetes de quartzo
5. Calcular a concentração e o grau de pureza da amostra

A260 A280 A260/A280 Interpretação

8
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PROTOCOLO B: Reação de digestão de DNA total com a enzima BamHI

1. Considerar a concentração de DNA total obtida

2. Calcular o volume de DNA total a usar na reacção de digestão, considerando que tem de
digerir 2,5 g de DNA
3. Determinar o volume de água a utilizar, considerando que a reacção de digestão tem a
seguinte constituição:

Reagente Volume Volume calculado

Volume a
Água determinar pelo
estudante

Volume a
DNA a digerir (2,5 g) determinar pelo
estudante

Tampão FastDigest verde 10X

3 L 3 L
(contém tampão de carga)

Enzima BamHI FastDigest 3 L 3 L

Volume final da reacção 30 L 30 L

4. Adicionar os reagentes da tabela um por um num microtubo estéril de 1,5 mL

5. Homogeneizar e centrifugar rápido o tubo, para que toda a reacção se concentre no fundo
do microtubo
6. Incubar a 37 ºC durante 10 minutos
7. Congelar a amostra a -20ºC, para parar a reacção e conservar o DNA até à próxima
utilização
8. Analisar o resultado da digestão por electroforese em gel de agarose (Aula 4).

9
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PROTOCOLO C: Reação de digestão de DNA plasmídico (pUC19) com a enzima

BamHI

1. Considerar a concentração de DNA plasmídico obtida

2. Calcular o volume de DNA plasmídico a usar na reacção de digestão, considerando que
tem de digerir 0,5 g de DNA
3. Determinar o volume de água a utilizar, considerando que a reacção de digestão tem a
seguinte constituição:

Reagente Volume Volume calculado

Volume a
Água determinar pelo
estudante

Volume a
DNA a digerir (0,5 g) determinar pelo
estudante

Tampão FastDigest verde 10X

2 L 2 L
(contém tampão de carga)

Enzima BamHI FastDigest 1 L 1 L

Volume final da reacção 20 L 20 L

4. Adicionar os reagentes da tabela um por um num microtubo estéril de 1,5 mL

5. Homogeneizar e centrifugar rápido o tubo, para que toda a reacção se concentre no fundo
do microtubo
6. Incubar a 37 ºC durante 10 minutos
7. Congelar a amostra a -20ºC, para parar a reacção e conservar o DNA até à próxima
utilização
8. Analisar o resultado da digestão por electroforese em gel de agarose (Aula 4).

10
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PROTOCOLO D: Reação de digestão dupla de DNA plasmídico (pUC19) com as

enzimas BamHI e SacI (digestão dupla)

1. Considerar a concentração de DNA plasmídico determinada na aula anterior

2. Calcular o volume de DNA plasmídico correspondente a 0,5 g de DNA
3. Determinar o volume de água a utilizar, considerando que a reacção de digestão tem a
seguinte constituição:

Reagente Volume Volume calculado

Volume a
Água determinar pelo
estudante

Volume a
DNA a digerir (0,5 g) determinar pelo
estudante

Tampão FastDigest verde 10X

2 L 2 L
(contém tampão de carga)

Enzima BamHI FastDigest 1 L 1 L

Enzima ScaI FastDigest 1 L 1 L

Volume final da reacção 20 L 20 L

4. Adicionar os reagentes da tabela um por um num microtubo estéril de 1,5 mL

5. Homogeneizar e centrifugar rápido o tubo, para que toda a reacção se concentre no fundo
do microtubo
6. Incubar a 37 ºC durante 10 minutos
7. Congelar a amostra a -20ºC, para parar a reacção e conservar o DNA até à próxima
utilização
8. Analisar o resultado da digestão por electroforese em gel de agarose (Aula 4).

11
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Figura 2.1: Mapa do plasmídeo pUC19, extraído na aula 1, com indicação dos genes e locais
de reconhecimento para algumas enzimas de restrição, com a posição dos respetivos locais
de corte, em termos de par de bases do plasmídeo (números entre parêntesis). O gene blaTEM
codifica uma beta-lactamase que confere resistência à ampicilina.

12
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Figura 2.2: Sequências de reconhecimento das enzimas BamHI e ScaI e respectivos

terminais coesivos e cegos (Biorender).

? ANÁLISE E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

1. Na aula 1 procedeu-se à extração do plasmídeo representado na Figura 2.1. Qual o peso

molecular do plasmídeo?
2. Após a digestão do DNA plasmídico com a enzima BamHI, qual(is) será/serão o(s) peso(s)
molecular(es) do(s) fragmento(s) produzido(s)? Porquê?
3. Após a digestão do DNA plasmídico com as enzimas BamHI e ScaI, qual(is) será/serão o(s)
peso(s) molecular(es) do(s) fragmento(s) produzido(s)? Porquê?
4. Aquando da determinação do grau de pureza de uma amostra de DNA, o que podem indicar
os seguintes valores?

A260/A280 Interpretação

1.9

1.5

13
 GENÉTICA 2022/2023
INTRODUÇÃO
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é
uma metodologia rápida que possibilita a
amplificação in vitro de fragmentos de DNA
específicos a partir de uma quantidade
mínima de DNA (1 cópia). Para a reação
são necessários 2 iniciadores (primers
específicos, que são oligonucleótidos
sintéticos complementares às duas cadeias
de DNA molde), que são desenhados com
base na sequência de nucleótidos que
flanqueia o fragmento que se pretende
amplificar. Para além dos primers, a solução
deve conter a polimerase (Taq DNA
polimerase) tampão da enzima e dNTPs. A
técnica consiste em vários ciclos repetidos,
que estão divididos em 3 etapas: i)
desnaturação do DNA (elevada temperatura
para assegurar a quebra das pontes de
hidrogénio da dupla fita de DNA;
ii) emparelhamento (annealing) dos primers
em sequência específicas alvo (a
temperatura é definida em função da
sequência nucleotídica) e iii) extensão da
região a ser amplificada por ação da DNA
polimerase. Cada cadeia de DNA recém
amplificada é usada como molde no ciclo
DBio@UAveiro
PROTOCOLO 3
Amplificação de DNA
(PCR)
seguinte. Como resultado desta
amplificação serão produzidos fragmentos
idênticos ao DNA alvo.
Assim, a PCR tem várias aplicações como,
por exemplo, amplificação de genes ou
fragmentos específicos, entre outras. É, por
isso, uma ferramenta importante para
estudos filogenéticos. No caso das
bactérias, o gene que codifica para o rRNA
16S é bastante utilizado para estudos
filogenéticos por ser muito conservado entre
diferentes espécies de bactérias. Para tal,
utilizam-se primers específicos para
diferentes regiões do gene, dependendo do
objectivo de cada estudo. Após
determinação da sequência nucleotídica do
fragmento amplificado e comparação com
outras sequências depositadas nas bases
de dados é possível conhecer o género ou,
em alguns casos, a espécie do
microrganismo em estudo.
OBJETIVOS
• Compreender a técnica de PCR bem como
das suas aplicações.
• Reconhecer a técnica de PCR como
processo de análise e amplificação de
moléculas de DNA.
15
 GENÉTICA 2022/2023 DBio@UAveiro

O resumo da técnica de PCR, assim como o método de avaliação do resultado está

esquematizado na Figura 3.1.

PROTOCOLO A: Amplificação do gene 16S rRNA por reacção em cadeia da

polimerase (PCR)

1. Utilizar o DNA total extraído (NOTA IMPORTANTE ABAIXO) na Aula 1 como DNA molde na
reacção de PCR
2. Identificar um microtubo de 200 L (prática e grupo) na zona lateral
3. Preparar a seguinte reação de amplificação:

Reagente Volume
MasterMix 2X 10 L
Primer foward (10 pmol/L)* 1 L
Primer reverso (10 pmol/L)* 1 L
tDNA 1 L
Água 7 L
Volume final da reacção 20 L

*Sequência do primer foward: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’ (nucleótidos 8 a 27 do gene rRNA 16S de E.
coli) Temperatura de melting: 58 ºC
*Sequência do primer reverso: 5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC -3’ (nucleótidos 1525 a 1541 do gene rRNA 16S de E.
coli) Temperatura de melting: 55 ºC

4. Programar o termociclador para proceder à amplificação por PCR de acordo com o os

seguintes parâmetros:

Temperatura Tempo Nº Ciclos

Desnaturação inicial: 94 ºC 9 min 1
Amplificação desnaturação: 94 ºC 30 seg
“annealing”: 56 ºC a) 30 seg 30
extensão: 72 ºC 1 min 30 segb)
Extensão final: 72 ºC 10 min 1
a) calcular com base na temperatura de melting dos primers
b) velocidade de polimerização da DNA polimerase: 30 seg/1Kb

5. Colocar os microtubos contendo a reacção de PCR no termociclador e iniciar o programa de

amplificação
6. Terminada a reacção, manter os microtubos a 15 ºC ou armazená-los a –20 ºC.
7. Avaliar o sucesso da amplificação por electroforese em gel de agarose (Aula 4).

16
 GENÉTICA 2022/2023 DBio@UAveiro

! NOTA IMPORTANTE:
Será fornecido DNA total aos grupos que extraíram DNA plasmidico na Aula 1.

Figura 3.1: Resumo do procedimento e análise de uma PCR (Biorender e Khan academy).

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 GENÉTICA 2022/2023 DBio@UAveiro

? ANÁLISE E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

1. A PCR é uma reacção in vitro que mimetiza um processo celular. Qual?

2. Qual a principal função da reacção de PCR?
3. Quais são os componentes essenciais de uma “mastermix” de PCR?
4. A temperatura de “annealing” é sempre igual em todas as reacções de PCR? Porquê?
5. O tempo de extensão é sempre igual em todas as reacções de PCR? Porquê?
6. Qual deverá ser o peso molecular do fragmento que amplificou na aula prática.
7. Se o objectivo do PCR fosse amplificar um gene com 2Kb, qual deveria ser o tempo de extensão
que utilizaria?
8. Numa reacção de PCR, em que consiste um controlo negativo? Porque é essencial incluir um
controlo negativo na análise?
9. Qual a função do gene 16S rRNA?
10. Porque deve usar DNA total e não DNA plasmidico para a reacção de PCR proposta na aula?

18
 GENÉTICA 2022/2023
INTRODUÇÃO
Para avaliar o sucesso da digestão do DNA
pela endonuclease de restrição, a reação de
digestão deve ser analisada por eletroforese
em gel de agarose.
O DNA é uma molécula carregada
negativamente e esse facto permite a
separação das moléculas existentes numa
solução heterogénea através de eletroforese.
Esta técnica permite separar fragmentos
resultantes de digestão de acordo com o seu
peso molecular. Num gel de agarose, a
velocidade de migração de uma molécula de
DNA é inversamente proporcional ao
logaritmo do seu peso molecular (e, portanto,
do seu tamanho).
Se, neste mesmo gel, forem introduzidos
fragmentos de DNA de tamanho conhecido
(marcadores ou padrões), o tamanho dos
fragmentos resultantes da digestão com a
enzima de restrição pode ser determinado
com exatidão. As bandas de DNA podem ser
detetadas no gel após coloração com o
agente intercalante brometo de etídio e
visualizadas sobre luz ultravioleta.
Os géis de agarose preparam-se a
concentrações entre 0,5 e 1,2 %,
dependendo dos tamanhos dos fragmentos a
separar, decorrendo as eletroforeses a
voltagens compreendidas entre 1 e 4 V/cm
em tampão TAE.
DBio@UAveiro
PROTOCOLO 4
Visualização DNA em gel de
agarose
As amostras de DNA são aplicadas no gel,
após adição de 1/6 de volume de tampão de
arrastamento (ou tampão de carga/loading
dye). Este tampão contém glicerol, que lhe
confere densidade, e corantes. Corantes
usualmente encontrados neste tampão são o
xileno cianol, o azul de bromofenol e o
laranja G, que migram de maneira idêntica a
moléculas de DNA com 4000, 500 e 50 pares
de bases (bp), respetivamente (Figura 4.1). O
seu uso permite avaliar a posição
aproximada das moléculas de DNA durante a
eletroforese.
OBJETIVOS
• Compreender o processo de separação de
moléculas de DNA de acordo com o peso
molecular;
• Interpretar e analisar os resultados obtidos
após separação de moléculas de DNA em
gel de agarose;
• Tomar conhecimento e reconhecer os
cuidados a ter na manipulação de agentes
físicos e químicos com elevado risco para a
saúde.
19
 GENÉTICA 2022/2023 DBio@UAveiro

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Nesta aula, todas as amostras de DNA das aulas anteriores (extracções de DNA total e
plasmídico, digestões e PCR) serão analisada por electroforese em gel de agarose.

PROTOCOLO A: Eletroforese em gel de agarose

O objectivo é preparar um gel de agarose com uma concentração de 1%, em 50 mL de

tampão de corrida TAE 1X (Figura 4.2).

1. Calcular a quantidade de agarose a pesar

2. Colocar a agarose num frasco e adicionar 50 mL de tampão TAE 1X
3. Misturar e colocar no microondas
4. Deixar ferver durante algum tempo e ir mexendo a cada 30 segundos, até que a agarose
esteja completamente dissolvida
5. Esperar que o gel arrefeça até cerca de 45 ºC
6. Enquanto o gel arrefece, preparar a plataforma do gel e colocar o pente na posição
adequada.
7. Quando a agarose atingir a temperatura adequada, adicionar 10 L de uma solução de
Brometo de Etídio (EtBr) a 5 mg/mL (ATENÇÃO: O EtBr é cancerígeno.)
8. Misturar suavemente e verter a agarose na plataforma
9. Deixar o gel solidificar (cerca de 15 minutos; durante este tempo de espera, preparar as
amostras como descrito no passo 11)
10. Colocar a bandeja com o gel de agarose na tina de corrida, que já contêm o tampão de
eletroforese TAE 1X. Verificar se o gel ficou totalmente submerso em tampão.
11. Preparar as amostras*: Colocar 5 L da amostra de DNA num microtubo e misturar com
5 L de tampão de arrastamento (TA) 2X concentrado.
12. Aplicar as amostras nos poços do gel. Num dos poços (por cada patamar de poços do
gel) é necessário carregar 2 µL do marcador de peso molecular para DNA linear (já
contém tampão de arrastamento; Figura 4.3)
13. Ajustar a corrente da fonte para 100 volts e iniciar a eletroforese.
14. Logo que o azul de bromofenol do tampão de arrastamento tiver percorrido mais de
metade da longitude do gel, terminar a eletroforese.
15. Observar o resultado num transiluminador de ultravioleta e fotografar (CUIDADO: Usar
proteção adequada para os olhos).

! ATENÇÃO: As amostras da digestão de DNA plasmídico e da reacção de PCR já contêm tampão

de arrastamento/carga. Desta forma, é possível carregar estas amostras directamente no gel de agarose.

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Figura 4.1: Separação de diferentes corantes dos tampões de arrastamento após eletroforese em gel de
agarose.

Figura 4.2: Esquematização do protocolo de eletroforese em gel de agarose e análise dos resultados.

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Figura 4.3: Imagem do marcador de peso molecular GRS Universal Ladder (Grisp), com a indicação do
peso molecular de cada fragmento (em pares de bases bp), quando separado num gel de agarose de
1%.

? ANÁLISE E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

1. Qual a quantidade de agarose que teria de pesar se pretendesse preparar 100 mL de um gel
de agarose a 2%?
2. Se lhe for fornecido o tampão de corrida TAE 50X concentrado como procederia para
preparar 100 mL de tampão TAE 1X concentrado?
3. Se pretender analisar fragmentos de DNA com cerca de 50 bp é mais adequado utilizar um
gel de agarose a 0,8% ou a 2%? Porquê?
4. Considere que o polo negativo e positivo de uma tina de eletroforese estão representados
com as cores preto e vermelho, respectivamente. Ao colocar o gel de agarose na tina, os poços
onde vai carregar a amostra de DNA devem ficar mais próximos do polo preto ou vermelho?
5. Qual o composto que permite a visualização do DNA quando exposto à luz ultravioleta?
Porque é que o composto tem essa capacidade?
6. Como explica o resultado que obteve para a extração de DNA total vs o resultado que obteve
na digestão simples de DNA plasmídico, considerando que extraiu DNA da mesma estirpe
bacteriana?
7. Quantas bandas observou na extracção de DNA plasmídico? Como explica esse resultado?
8. Como explica o resultado que obteve para a extração de DNA plasmidico vs o resultado que
obteve na digestão simples de DNA plasmídico?

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PROTOCOLO 5

Deteção do Efeito Mutagénico de

Compostos Químicos - Teste de
Ames

histidina quando as células são incubadas na

presença de diferentes concentrações o
composto cuja ação se pretende testar.

INTRODUÇÃO Quando as células da estirpe auxotrófica são

espalhadas em meio mínimo, não deve
Designam-se por mutagénicos os agentes
ocorrer divisão celular e, portanto, não
químicos ou físicos que afetam a estrutura do
devem surgir colónias visíveis. No entanto,
DNA, provocando alteração da sequência de
na presença de um agente mutagénico, uma
bases. São inúmeros os compostos químicos
fração da população celular é afetada por
que provocam alterações desta natureza e
mutação, nalgumas células, a mutação faz
muitos deles são suscetíveis de entrar em
reverter o fenótipo de auxotrofia para
contacto com os seres humanos.
prototrofia. Assim sendo, passam a existir
Existem vários procedimentos para testar a
células com capacidade de crescer e se
ação mutagénica de compostos químicos. O
dividirem num meio mínimo (apresenta uma
teste mais utilizado por Bruce Ames, da
quantidade mínima do nutriente para o qual a
Universidade da Califórnia na década de 70.
cultura mãe é auxotrófica), originando
Este teste utiliza estirpes bacterianas
colónias no meio de cultura (colónias
pertencentes à espécie Salmonella
revertentes – His+). Este crescimento indica
typhimurium. Estas estirpes foram
que o composto em teste apresenta atividade
geneticamente modificadas por forma a
mutagénica. Em geral, o número de colónias
serem usadas na deteção de agentes
obtidas está diretamente relacionado com a
químicos com ação mutagénica. Os
concentração do composto.
principais tipos de modificações induzidas
nas estirpes foram:
• Inativação dos sistemas de reparação do OBJETIVOS
DNA
• Inativação da síntese de lipopolissacarídeos • Compreender os conceitos de auxotrofia e
prototrofia
para aumentar a permeabilidade das
• Compreender o conceito de mutação
células aos compostos químicos
• Caracterizar diferença fenotípica em
• Auxotrofias para aminoácidos,
bactérias
nomeadamente para histidina.
• Relacionar a mutação com a ação de
agentes químicos
O teste padrão consiste em medir a taxa de • Executar um método analítico para a
mutação reversa da auxotrofia para a deteção de mutagénese

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PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A Figura 5.1 apresenta, em forma de esquema, o conjunto de procedimentos que devem ser
adotados neste protocolo. O composto mutagénico (solução teste) será testado em diferentes
diluições (10-1, 10-2 e 10-3). Cada grupo testará o efeito apenas de uma destas diluições.

Figura 5.1: Deteção de atividade mutagénica pelo teste de Ames - conteúdo dos tubos e passos do
protocolo experimental a ser efectuado por cada grupo.

Material
• 6 caixas de Petri contendo meio mínimo suplementado com 40% (m/v) de glucose
• 6 tubos contendo 2 ml de Top Agar
• Solução teste (mitomicina [12.5 µg/ml]
• Solução de 0,5 mM Biotina e 0,5 mM Histidina

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• Banho a 45ºC
• Cultura de Salmonella typhimurium TA 102
• Pipetas estéreis

PROTOCOLO: Deteção de Atividade Mutagénica

1. Fundir o meio Top agar.

2. Colocar 2 mL de meio Top Agar em cada um dos seis tubos e incubar num banho a 45ºC;
aguardar que a temperatura baixe até que possa manipular os tubos.
3. A cada tubo adicionar 200 µL de solução de Histidina/Biotina.
4. A três tubos, adicionar 100 µL da solução a testar; marcar estes tubos com a indicação
TESTE e diluição usada, aos restantes três tubos marcar a condição CONTROLO.
5. Adicionar 100 µL de cultura bacteriana a todos os tubos TESTE e CONTROLO.
6. Marcar a base de três das caixas de Petri com a indicação TESTE e diluição.
7. Marcar a base de três das caixas de Petri com a indicação CONTROLO.
8. Misturar bem o conteúdo dos tubos TESTE usando o vórtex e verter o conteúdo de cada
tubo em cada uma das placas TESTE.
9. Misturar bem o conteúdo dos tubos CONTROLO usando o vórtex e verter o conteúdo de
cada tubo em cada uma das placas CONTROLO.
10. Deixar solidificar durante, pelo menos, 20 minutos. Depois, envolver as placas em papel
de embrulho.
11. Colocar as placas na estufa a 37ºC.
12. Ao fim de 48 horas, contar o número de colónias presente em cada uma das placas,
calcular a média e erro padrão e representar graficamente o número de revertentes His+ por
condição (Tabela 5.1).

Tabela 5.1. Apresentação dos resultados do teste de Ames realizado na aula. Devem recolher os
resultados de toda a turma e interpretar como um todo.

Número de colónias
mutantes
Réplica Réplica Réplica Erro
Média
1 2 3 Padrão

CONTROLO

Composto
TESTE:
Diluição 10-1
Composto
TESTE:
Diluição 10-2
Composto
TESTE:
Diluição 10-3

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? ANÁLISE E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

1. Observe, com muita atenção, as placas de Petri de cada condição (CONTROLO e

TESTE): verifica-se algum “tapete fino” de bactérias? Qual é o significado da
presença deste tapete bacteriano?
2. Na condição CONTROLO, foi possível observar colónias que cresceram por cima
do tapete? Em caso afirmativo, explique o aparecimento destas colónias.
3. Nas placas TESTE, aconteceu o mesmo que na condição CONTROLO? Justifique
a sua resposta.
4. Qual foi a concentração da solução TESTE mutagénica e porquê?

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BIBLIOGRAFIA

• Correia, A., Mendo, S. (2001). Genética: Exercícios Teórico- Práticos, UA.

• Brown T (2010). Gene Cloning and DNA Analysis: An introduction, 6th Edition, Wiley Blackwell.
• Old, R. W. & Primrose (1991). Principles of Gene Manipulation. Blackwell, London.
• MARON, D. M. and AMES, B. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test.
Mutation Research 113:173-215.
• Maria VL, Correia AC, Santos MA. (2002). Benzo[a]pyrene and beta-naphthoflavone mutagenic
activation by European eel (Anguilla anguilla L.) S9 liver fraction. Ecotoxicol Environ Saf. 53(1):81-5.
doi: 10.1006/eesa.2001.2204.

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